单元三抗生素类药物的发酵生产项目一抗生素基本知识任务五抗生

单元三抗生素类药物的发酵生产项目一抗生素基本知识任务五抗生素微生物检定法（一）标准品抗生素标准品是与供试品同质的纯度较高的抗生素，用作效价测定时的标准，每1mg含有一定的单位。分为国际标准品与国家标准品。经国际协议，每1mg标准品中含有一定的单位，其单位称为国际单位（IU）。在某些品种第一次定国际单位时，一般其效价单位的含义是由主观决定的，如定为1mg=1000U。国际标准品制备量有限，主要供各国在检定国家标准品时作对照用，不宜用于常规检验和具体科研工作中。我国的标准品由国家食品药品监督管理局下设单位中国药品生物制品检定所统一负责选样、分装、协作标定、确定效价单位等，并统一向全国各使用单位分发。国际上已制备的国际标准品的品种，在制备国家标准品时，均与国际标准品比较而定出效价，对于我国特有的品种则根据一定的原则自定效价单位。（二）检定用菌种检定抗生素效价时要选择合适的抗生素敏感菌作为试验菌。不同的抗生素其敏感菌不一样。《中国药典》2010年版规定检定抗生素效价的菌种有8种。枯草芽孢杆菌

短小芽孢杆菌金葡菌藤黄微球菌大肠埃希菌啤酒酵母菌肺炎克雷伯菌支气管炎博德特菌（三）抗生素微生物检定法

抗生素微生物检定法是利用抗生素抑制或杀死细菌或真菌的程度作为客观指标来衡量抗生素有效成分的效力的一种方法。依据试验设计原理的不同，抗生素微生物检定法一般分为管碟法、浊度法和稀释法。《中国药典》2010年版采用管碟法和浊度法。1.管碟法又称杯碟法，是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。我国药典抗生素微生物检定的第一法。固体培养基凝固前接种试验菌，培养基凝固后，将供试品用不同的设计方法加在接种有试验菌的培养基上，适宜的温度下培养一段时间后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所能到达之处，细菌不能生长而呈现出透明的抑菌范围，一般呈圆形，称为抑菌圈。将供试品的抑菌圈与标准品抑菌圈进行比较，计算出供试品的效价。2.浊度法利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。采用分光光度计来测定吸光度，浑浊程度越高，光吸收越好，通过的光线也就越少。3.稀释法

依据抗生素最低抑菌浓度而设计的方法称为稀释法。通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，观察含不同浓度抗生素的液体培养基中有无细菌生长，从而测定抗生素最低抑菌浓度（MIC）的方法。常用于新药的研制及药敏试验等方面。（四）管碟法1.原理－抑菌圈的形成将不锈钢小管（俗称牛津杯）放置在摊布试验菌的琼脂培养基双碟上，在小管内加入抗生素溶液后，将培养基置于试验菌生长的适宜条件下，两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌的生长作用。当培养到一定时间，琼脂培养基中的两种互动作用达到动态平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制，此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好等于抗生素最低抑菌浓度。根据设计原理不同，管碟法分一剂量法（标准曲线法）、二剂量法（2.2法）和三剂量法（3.3法）三种常用方法。其中二剂量法使用最多。2.量-反应直线式中，t为扩散时间（h）；M为管中抗生素的量（μg或U）；r为抑菌圈的半径（mm）；H为培养基的厚度（mm）；C′为抗生素最低抑菌浓度（μg/mm3或U/mm3）；D为扩散系数（mm2/h）。2.量-反应直线抗生素总量的对数(lgM)与所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直线关系，奠定了以抑菌圈的大小来测定抗生素抗菌活性物质量的理论基础。3.量-反应平行线

在量–反应的指标中，当抗生素浓度的对数剂量和反应呈直线关系，且供试品与标准品的作用性质相同时，供试品与标准品的两条量–反应关系曲线相互平行。在抗生素效价测定时，为消除各种干扰因素的影响，采用标准品和供试品在相同的试验条件下进行实验，测得相对效价的比率，再由已知的标准品效价计算出供试品的效价。4.检定的影响因素抑菌圈质量的控制抑菌圈的形状

抑菌圈大小的控制抑菌圈边缘清晰度的控制标准品与供试品的同质性斜率的控制直线截距的控制（1）抑菌圈质量的控制a.抑菌圈的形状：实验中抑菌圈常多有破裂、不圆、甚至无圈的现象，原因：在滴加抗生素溶液时药液溅出、毛细滴管碰到钢管壁使抗生素溶液漏出，抑菌圈出现不圆；双碟、钢管、钢管放置器内有残留抗生素污染，出现细菌不生长，或者有多余的抑菌圈产生，或者抑菌圈非正常的变大；试验菌菌龄过老、菌层培养基加菌液时培养基温度过高，将检定菌烫死等，会导致细菌不生长；稀释抗生素溶液所用缓冲液的pH值和盐浓度也可影响抑菌圈的圆整。（1）抑菌圈质量的控制b.抑菌圈大小的控制

M=C0V

当抗生素最低抑菌浓度C′不变时，lgM与r2呈直线关系。故钢管中滴加抗生素的量应保持一致，且应严格限定钢管的大小。抑菌圈质量的控制b.抑菌圈大小的控制抑菌圈大小受t值（抗生素扩散时间，即细菌刚生长到显示抑菌圈所需的时间）增减的影响，故预先延长抗生素的扩散时间可使抑菌圈变大。一组双碟加样时，应尽量缩短加样间隔时间，并保持加样速度的均匀性，以减少误差。抑菌圈的大小还受抗生素扩散系数D的影响，若在缓冲液中加入3%的氯化钠或在培养基中加一定量的盐或吐温，可增加抗生素的扩散能力，使抑菌圈增大。b.抑菌圈大小的控制（1）抑菌圈质量的控制c.抑菌圈边缘清晰度的控制在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均一，不符合动力学公式中各项之间的关系或各扩散系统交叉所致。如试验菌种放置时间过长，菌群中个体的生长周期不同，对抗生素的敏感度不同，往往使抑菌圈形成双圈或多圈，使边缘模糊不清。培养基原材料的成分及质量、pH值、盐浓度及培养时间均可影响抑菌圈边缘的清晰度。多组分抗生素中，各组分抗菌活性的不同，扩散系数也不同，其交叉作用影响抑菌圈边缘的清晰度。

（2）标准品与供试品的同质性用于制备标准品溶液和供试品溶液的缓冲溶液pH、盐浓度的差异，导致供试品溶液与标准品溶液表现为非同质。供试品（尤其是制剂）较标准品中含有额外的维生素、氨基酸、无机盐及糖类等生长物质。可在标准品中加入相同量的添加剂或赋形剂，以抵消此影响。对化学稳定性较差的抗生素，易降解。对光敏感的多烯类抗生素（如制霉菌素、两性霉素B等），试验过程中应注意避免光线直射；对有差向异构特性的抗生素，尤其应注意pH、盐浓度、温度和光照对抗生素差向化的影响。（3）斜率的控制

由公式中斜率来推算：斜率越小，直线越平缓，抗生素效价的微弱差别，可导致抑菌圈大小的差别较大，使得测定结果更精确。要使斜率小，则应使D值、t值变大，即抗生素在培养基中的扩散系数D要大，试验菌的生长时间t要长。D值又与抗生素的分子量、培养基成分、试验菌以及pH、盐浓度、琼脂含量多少等因素有关。增大t值的办法，可在滴加抗生素溶液后，将双碟置室温中放置1～2h，然后再置培养箱中培养。（4）截距的影响相同浓度的抗生素，截距小的抑菌圈大，效价测定的灵敏度高。截距的大小取决于数值，除扩散时间、扩散系数和抗生素最低抑菌浓度对截距有影响外，培养基厚度H也是影响因素之一。培养基厚度越薄，截距减小，抑菌圈增大。所以在制备双碟时，相同的试验组内，每只双碟中底层和菌层培养基的厚度应保持一致性和均匀性。二剂量法是将标准品（S）和供试品（T）各稀释成高、低两种剂量，在同一含试验菌的琼脂平板上进行比较，根据2种剂量4种溶液所产生的抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。（五）二剂量法试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。1.操作方法双碟的挑选内径约90mm，硬质玻璃或塑料培养平皿，水平透明，无色斑气泡内径（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm，外径（7.8±0.1）mm，重量差异不超过±0.01g，光洁平坦钢管的挑选主要是吸潮和防止细菌蔓延的作用，厚薄一致，表面光滑、平坦，吸水性强。不需要洗涤，140℃干烤1h消毒、降温后拿出。陶瓦盖（1）菌悬液的制备按照抗生素检定实验设计表选择相应的试验菌，培养制备菌悬液。抗生素类别试验菌培养基灭菌缓冲液PH值抗生素浓度范围（单位/ml）培养条件编号PH值温度/℃时间/小时链霉素枯草芽孢杆菌[CMCCB（B）63501Ⅰ7.8～8.07.80.6～1.635～3714～16卡那霉素枯草芽孢杆菌[CMCCB（B）63501Ⅰ7.8～8.07.80.9～4.535～3714～16巴龙霉素枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]Ⅰ7.8～8.07.80.9～4.535～3714～16妥布霉素枯草芽孢杆菌[CMCCB（B）63501Ⅰ7.8～8.07.81～435～3714～16罗红霉素枯草芽孢杆菌[CMCCB（B）63501Ⅱ7.8～8.07.85～1035～3716～18庆大霉素短小芽孢杆菌[CMCC（B）63202]Ⅰ7.8～8.07.82.0～12.035～3714～16（2）供试品、标准品溶液的制备标准品溶液的制备：标准品的使用与保存，应遵循标准品使用说明书的规定。从冰箱中取出标准品，于室温平衡后，以减量法精密称取不少于20mg、一般为50mg的标准品，根据标准品的标示效价单位加入稀释液，制成浓度一般为1000U/ml的浓溶液，贮存于冰箱中备用。临用时依据抗生素微生物检定实验设计表的规定，取标准品1000U/ml的浓溶液，用缓冲液稀释成滴碟所用高、低两浓度，作为标准品溶液。标准品和供试品高、低浓度的剂量比一般为2:1，当高、低剂量所致的抑菌圈直径差别较小时，可用高、低剂量之比为4:1的比率（3）双碟的制备底层：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固，更换干燥的陶瓦盖。菌层的制备在培养基中添加一定量的菌悬液，振摇混匀。注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量。每只双碟加入5ml菌层培养基。注意制备菌层的速度和平整度。（4）放置钢管在每只双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管4个（二剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。注意使钢管平稳落在培养基上，各个钢管下落的高度应一致。钢管放妥后，使双碟静置10min，钢管在培养基内稍下沉稳定。（5）滴碟、培养每批供试品双碟不少于4个，一般取4～10个在每个双碟的4个钢管中，对角的两个钢管分别滴加高浓度和低浓度的标准品溶液，其余两个对角位置的钢管分别滴加相应的高、低浓度的供试品溶液。按SH→TH→SL→TL顺序，分别滴加标准品和供试品高、低剂量溶液。双碟的培养根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平叠放的双碟数以不超过三层为宜。培养后的双碟（6）抑菌圈的测量将培养好的双碟取出，打开陶瓦盖，将钢管倒入1：1000新洁尔灭溶液或其他消毒液内浸泡，检查抑菌圈是否圆整，如有破圈或不圆整圈应将碟弃去。抑菌圈测量仪的使用：每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。手工测量：游标卡尺测量抗生素微生物效价检定操作流程图2.二剂量法的效价计算P为供试品效价相当于标示值或估计效价的百分数；S2为标准品高浓度溶液所致抑菌圈直径（面积）的总和；S1为标准品低浓度溶液所致抑菌圈直径（面积）的总和；T2为供试品高浓度溶液所致抑菌圈直径（面积）的总和；T1为供试品低浓度溶液所致抑菌圈直径（面积）的总和；I为高、低剂量之比的对数（常数），高、低剂量之比为2:1时，I=0.301；高、低剂量之比为4:1时，I=0.602；PT：供试品的测得效价，U/mg；AT是供试品的标示（估计）效价，U/mg。

例3-1某批红霉素效价测定，试验菌为短小芽孢杆菌（63202），标准品ds1为5U/ml，ds2为10U/ml，供试品dT1、dT2约与标准品溶液的浓度相当，供试品的估计效价AT为924.7U/mg，计算供试品的实际效价。双碟号ds1（5U/ml）/mmds2（10U/ml）/mmdT1（5U/ml）/mmdT2（10U/m