黄曲霉毒素B1的测定薄层色谱法14课件

黄曲霉毒素B1的测定

主讲教师：吕

伟农产品食品检验员——薄层色谱法目录测定黄曲霉毒素B1的意义1测定黄曲霉毒素B1的原理与准备工作2薄层色谱法测定流程3单向测定法45双向测定法6薄层色谱法操作说明3案例：

据欧盟食品饲料类快速预警系统（RASFF）消息2022年4月15日，意大利通过RASFF通报越南出口腰果黄曲霉毒素超标（）。2022年4月6日，中国质量新闻网通报河北省市场监管部门组织抽检8类食品474批次样品，其中抽检炒货食品及坚果制品67批次，经检验不合格样品2批次。

测定黄曲霉毒素B1

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测定黄曲霉毒素B1测定意义

1、急性毒性：在高浓度的AFT会导致急性中毒、急性肝

损伤，甚至死亡。2、慢性毒性：长期在较低浓度的AFT会引起慢性中毒、

组织纤维化变性等，导致肝硬化、肝癌和肠癌等病变。3、

致癌性:AFT是目前所知致癌性最强的化学物质。

主要在肝细胞内质网微粒体混合功能氧化酶系的作用下

代谢活化具有致癌性，黄曲霉毒素称作为前致癌物。5

测定黄曲霉毒素B1主要方法

1、薄层色谱法2、酶联免疫吸附筛查法3、免疫层析法4、胶体金快速定量法5、高效液相色谱法6

薄层色谱法-学习目标

1、掌握薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1的原理。2、学会配制黄曲霉毒素标准溶液。3、会依据规范完成取样操作。

4、会规范完成黄曲霉毒素B1的提取操作。5、学会规范点样与层析操作。6、能完成证实实验与概略定量分析处理。

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薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1的原理

样品中黄曲霉毒素B1经提取、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。

薄层板上黄曲霉毒素B1最低检出量0.0004μg。81、CHCL3、正己烷或石油醚（沸程30~60℃或60~90℃）、甲醇。2、苯、乙腈。3、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水。4、丙酮。

以上试剂先进行一次试剂空白试验，如不干扰测定即可使用，

否则需逐一进行重蒸。5、硅胶G。薄层色谱用。6、三氟乙酸。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1的准备工作

91、无水硫酸钠。2、氯化钠。3、苯-乙腈混合液。量取98mL苯，加2mL乙腈，混匀。4、甲醇-水溶液量取55mL甲醇加45ml水，混匀。5、黄曲霉毒素B1标准储备溶液。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1准备工作

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薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1的准备工作

配制黄曲霉毒素B1标准储备溶液。①AFTB1标准品纯度≥98%，国家标准物质证书。②黄曲霉毒素B1标准溶液制备：准确称取1~1.2mg黄曲霉毒素B1标准品，加入2mL乙腈溶解，用苯稀释至100mL，避光，于4℃冰箱保存。该标准溶液为10μg/mL。11

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1准备工作

紫外分光光度计测定黄曲霉毒素B1标准储备溶液吸光值。式中X-黄曲霉毒素B1标准溶液的浓度，μg/mL;A--测得的吸光度值;f--使用仪器的校正因素;M-黄曲霉毒素B1的分子质量量312;E2--AFTB1在苯一乙腈混合液中的摩尔消光系数，

19800。12

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1准备工作

配制黄曲霉毒素B1储备液

③纯度的测定：取5μL10μg/mL黄曲霉毒素B1标准溶液，滴加于涂层厚度0.25mm的硅胶G薄层板上，用甲醇-三氯甲烷（4+96）与丙酮-三氯甲烷（8+92）展开剂展开，紫外光灯下观察荧光，符合以下条件：a.在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点。b.原点上没有任何残留的荧光物质。13

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1的准备工作

配制黄曲霉毒素B1标准使用液（标准液10μg/mL）取1mL标准液于10mL容量瓶，加苯-乙腈混合液至刻度，混匀（1.0μg/mL黄曲霉毒素B1）。取1.0mL此稀释液于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度（0.2μg/mL黄曲霉毒素B1）。

取黄曲霉毒素B1上述溶液1.0mL于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度（0.04μg/mL黄曲霉毒素B1）。14

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1的准备工作

次氯酸钠溶液（消毒用）。

取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀。将80g工业用碳酸钠溶于500mL温水中，将两液混合、搅拌，澄清后过滤。此滤液含次氯酸质量浓度约为25g/L。若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。所得溶液的质量浓度约为50g/L。污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。151、小型粉碎机。2、样筛2.0mm筛孔孔径。3、电动振荡器。4、全玻璃浓缩器。5、玻璃板。5cm×20cm。6、薄层板涂布器，可选用适用黄曲霉毒素检测的商品薄层板。7、展开槽。长25cm、宽6cm、高4cm。8、紫外光灯。100~125W，带有波长365nm滤光片。9、微量注射器或血色素吸管。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1仪器与设备

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薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-主要流程

试样准备提取净化

浓缩定量转移

点样

预展

正展

观察

确证试验概略定量171、取样。样品中污染黄曲霉毒素高的霉粒一粒影响测定结果，大量取样，样品粉碎、混匀。①采取有代表性样品。②对局部发霉变质的样品单独取样。③大样经粗碎与连续多次用四分法缩减至0.5~1kg，全部粉碎，粮食过20目筛，花生过10目筛，混匀。花生油和花生酱等样品不需制备，取样时搅拌均匀。必要时，每批样品取3份大样作样品制备及分析测定。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-取样18①玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等。

a.甲法。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-提取称量破碎试样20.00g具塞250ml锥形瓶30ml正己烷（石油醚）100ml甲醇水注意密封，震荡30min静置片刻折叠式快速定性滤纸过滤下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水于另一具塞锥形瓶19①玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等。

a.甲法。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-提取取20mL甲醇水于另一125mL分液漏斗中20mLCHCL3，振摇2min，静置分层（甲醇促分层）放出CHCL3层，用CHCL3湿润的定量慢速滤纸（10g无水硫酸钠）过滤于50mL蒸发皿中5mLCHCL3于分液漏斗中，重复振摇提取CHCL3层一并滤于蒸发皿，CHCL3洗过滤器，洗液并于蒸发皿中蒸发皿放在通风柜，于65℃水浴上通风挥干。20

在冰盒上冷却2~3min后，准确加入1mL苯-乙腈

混合液（或将CHCL3用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干

后，准确加入1mL苯-乙腈混合液）。用带橡皮头

的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，

将蒸发皿从冰盒上取出继续溶解，混合，晶体消失，

再用此滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-提取21

乙法（限于玉米、大米、小麦及其制品）。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-提取称量破碎试样20.00g具塞250ml锥形瓶滴加6mL水湿润样品，加60mLCHCL3，振荡30min加12g无水硫酸钠，振摇静置30min，快速定性滤纸滤于100mL具塞锥形瓶取12mL滤液于蒸发皿中，在65℃水浴上通风挥干加1mL苯-乙腈混合液，用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合若析出苯结晶，将蒸发皿从冰盒上取出继续溶解，混合，晶体即消失此滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中22

花生油、香油、菜油等

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-提取4.00g样品于小烧杯，用20mL正己烷或石油醚将样品移于125mL分液漏斗20mL甲醇水溶液洗烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振摇2min，静置分层甲醇水移入第二个分液漏斗，5mL甲醇水重复提取一次，提取液一并移入第二个分液漏斗中。第二个分液漏斗加20mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层放出CHCL3层，用CHCL3湿润的定量慢速滤纸（10g无水硫酸钠）过滤于50mL蒸发皿中5mLCHCL3于分液漏斗中，重复振摇提取CHCL3层一并滤于蒸发皿，CHCL3洗过滤器，洗液并于蒸发皿中于65℃水浴上通风柜挥干加1mL苯-乙腈混合液，充分混合此滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管,23

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-单向展开薄层板制备

点样展开与观察有蓝紫色荧光点确证试验概略定量无蓝紫色荧光点无需确证试验24

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-单向展开法薄层板制备称取约3g硅胶G,2-3倍水研磨1~2min至成糊状后立即倒于涂布器内推成5cm×20cm，厚度0.25mm薄层板三块100℃活化2h，取出，放干燥器中保存（2-3d）空气中干燥约15min25

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-单向展开法点样薄层板边缘吸附剂刮净距薄层板下端3cm基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可加4个点，点距边缘和点间距约为1cm，点直径约3mm。第Ⅰ点：10μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04μg/mL）。第Ⅱ点：20μL样液。第Ⅲ点：20μL样液+10μL0.04μg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。第Ⅳ点：20μL样液+10μL0.2μg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。26

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-单向展开法展开与观察展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。如样液阴性，薄层板Ⅲ点黄曲霉毒素B1

0.0004μg，可检查样液内黄曲霉毒素B1最低检出量由于样液点上加滴黄曲霉毒素B1标准使用液，可使黄曲霉毒素B1标准点与样液中的黄曲霉毒素B1荧光点重叠。另一展开槽加10mL丙酮-三氯甲烷（8+92），展开10~12cm，取出。如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1为0.002μg，主要起定位作用Ⅱ点在与黄曲霉毒素B1标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点，样品中黄曲霉毒素B1含量＜5μg/kg27

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-单向展开法确证试验加滴三氟乙酸，产生黄曲霉毒素B1衍生物，展开后此衍生物的比移值约0.1左右。两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min后，使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃。薄层板左边依次滴加两个点，Ⅰ点：10μL0.04μg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。Ⅱ点：20μL样液。于薄层板上滴加两个点。Ⅲ点：10μL0.04μg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。Ⅳ点：20μL样液。再展开，紫外灯观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。28

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-单向展开法稀释定量样液中黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B1标准点的最低检出量的荧光强度一致，则样品中黄曲霉毒素B1含量即为5μg/kg。样液荧光强度比最低检出量强，估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升数，至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致。Ⅰ点：10μL0.04μg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。Ⅱ点：据情况滴加10μL样液。Ⅲ点：根据情况滴加15μL样液。Ⅳ点：根据情况滴加20μL样液。

计算

计算29

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-单向展开法计算

X—样品中黄曲毒素B1的含量（μg/kg）V1—加入苯-乙腈混合液的体积（mL）V2—出现最低荧光时滴加样液的体积（mL）D—样液的总稀释倍数m1—加入苯-乙精混合液溶解时相当样品的质量（g）0.0004——黄曲霉毒素B1的最低检出量（μg）结果的表述：报告测定值的整数位。30

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-双向展开薄层板制备

点样展开与观察有蓝紫色荧光点确证试验概略定量无蓝紫色荧光点无需确证试验薄层板先用无水乙醚作横向展开，将干扰的杂质展至样液点的一边而黄曲霉毒素B1不动，然后再用丙酮-三氯甲烷（8+92）作纵向展开，样品在黄曲霉毒素B1相应处的杂质底色大量减少，因而提高了方法灵敏度。如用双向展开中滴加两点法展开仍有杂质干扰时，则可改用滴加一点法。31

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-双向展开滴加两点法

点样在三块板的距左边缘0.8~lcm处各滴加10μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04μg/mL），在距左边缘2.8~3cm处各滴加20μL样液，在第二块板的样液点上加滴10μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04μg/mL）第三块板的样液点上加滴10Μl0.2μg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。32

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-双向展开滴加两点法

展开横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边置于展开槽内展开，展至板端后，取出挥干，或根据情况需要时可再重复展开1~2次。纵向展开：挥干的薄层板以丙酮-三氯甲烷（8+92）展开至10~12cm为止。丙酮与三氯甲烷的比例根据不同条件自行调节。33

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-双向展开滴加两点法

观察在紫外光灯下观察第一、二板，若第二板的第二点在黄曲霉毒素B1标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光点，则样品中黄曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下。若第一板与第二板的相同位置上出现荧光点，则第一板与第三板比较，看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置上的荧光点是否与黄曲霉毒素B1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，第一、二、三板可以同时做，也可按照顺序做。如按顺序做，当在第一板出现阴性时，第三板可以省略，如第一板为阳性，则第二板可以省略，直接作第三板。34

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-双向展开滴加两点法

确证试验另取薄层板两块，于第四、第五两板距左边缘0.8~lcm处各滴加10μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04μg/mL）及1小滴三氟乙酸；在距左边缘2.8~3cm处，于第四板滴加20μL样液及1小滴三氟乙酸；于第五板滴加20μL样液、10μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04μg/mL）及1小滴三氟乙酸，反应5min后，用吹风机吹热风2min，使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃。再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。如样液黄曲霉毒素B1含量高时，则将样液稀释后按做确证试验。35

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-双向展开滴加两点法

稀释定量如样液黄曲霉毒素B1含量高时，稀释定量操作。如黄曲霉毒素B1含量低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰，影响结果的判断，可将样液再做双向展开法测定，以确定含量。X—样品中黄曲毒素B1的含量（μg/kg）V1—加入苯-乙腈混合液的体积（mL）V2—出现最低荧光时滴加样液的体积（mL）D—样液的总稀释倍数m1—加入苯-乙精混合液溶解时相当样品的质量（g）0.0004——黄曲霉毒素B1的最低检出量（μg）36

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-双向展开滴加一点法

点样在三块板距左边缘0.8~1cm处各滴加20μL样液第二板的点上加滴10μL黄曲霉毒素B1标准使用液（0.04μg/mL）第三板的点上加滴10μL黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2μg/mL）。37

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-双向展开滴加一点法

展开横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边置于展开槽内展开，展至板端后，取出挥干，或根据情况需要时可再重复展开1~2次。纵向展开：挥干的薄层板以丙酮-三氯甲烷（8+92）展开至10~12cm为止。丙酮与三氯甲烷的比例根据不同条件自行调节。38

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-双向展开滴加一点法

观察在紫外光灯下观察第一、二板，如第二板出现最低检出量的黄曲霉毒素B1标准点，而第一板与其相同位置上未出现光点，样品中黄曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下。第一板在与第二板黄曲霉毒素B1相同位置上出现光点，则将第一板与第三板比较。看第三板上与第一板相同位置的荧光点是否与黄曲霉毒素B1标准点重叠，如果重叠再进行以下确证实验。39

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-双向展开滴加一点法

确证试验另取两板，于距左边缘0.8~lcm处，第四板滴加20μL样液、1滴三氟乙酸；第五板滴加20uL样液、10uL0.04μg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液及1滴三氟乙酸。产生衍生物及展开。将以上二板在紫外光灯下观察，以确定样液点是否产生与黄曲霉毒素B1标准点重叠的行生物，观察时可将第一板作为样液的衍生物空白板。经过以上确证试验定为阳性后，再进行稀释定量，如含黄曲霉毒素B1低，不需稀释或稀释倍数小，杂质荧光仍有严重干扰，可根据样液中黄曲霉毒素B1荧光的强弱直接用双向展开法定量。40

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1-双向展开法计算

X—样品中黄曲毒素B1的含量（μg/kg）V1—加入苯-乙腈混合液的体积（mL）V2—出现最低荧光时滴加样液的体积（mL）D—样液的总稀释倍数m1—加入苯-乙精混合液溶解时相当样品的质量（g）0.0004——黄曲霉毒素B1的最低检出量（μg）结果的表述：报告测定值的整数位。411.本法测定样品黄曲霉毒素B1

1~5μg/kg回收水平时，

回收率75%以上，本方法的灵敏度可达1~5μg/kg。

先将所需的黄曲霉毒素B1标准液加在准备称样的烧杯

或具塞锥形瓶中，用吹风机吹冷风将标准液的溶剂吹干

后，再将样品加入（由于配标准溶液的溶剂与提取剂不

同,故需吹干，否则影响方法的回收率偏低）。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1说明

422.薄层灵敏度最低检出量为0.0004μg。

测定方法为：取黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2μg/mL）

0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40μL，用

苯-乙腈混合液（98：2.体积比）稀释到1mL，每毫升

含0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08μg

黄曲霉毒素B1，取以上不同浓度的标准溶液10μL，点

样，然后展开，观察，找出各实验室在自已条件下的最

低检出量。计算式如下：

最低检出量=点样体积0.0lmL（10μL）×标准液的质

量浓度（μg/mL）。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1说明

433.所有有机溶剂都要做荧光检查，滴20μL于薄层板上，

在紫外灯下检查。如无荧光即可使用，否则需重蒸后方

可使用。

4.

次氯酸钠溶液名为安替福民，为5%次氧酸钠溶液。

次氯酸钠溶液具有强氧化性和强碱性，能分解黄曲霉

毒素，可用作黄曲霉毒素消毒剂。5.紫外灯的强度与滤光片的波长必须挑选合适（灯光强

度为100W左右，滤光片波长为365nm），薄层板的

底色在灯光下观察为暗紫色较为合适，否则就不易显

出黄曲霉毒素B1微弱的蓝紫色荧光斑点。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1说明

446、简便又可减少黄曲霉毒素B1固体在空间污染环境的配制方法，如下：①先用纸盒制成类似的接种柜，在此柜中用微量匙取出少量白色结晶的标准品于量瓶中，按方法先加入乙腈，再按比例加入一定体积的苯，使配制的标准液质量浓度高于10μg/mL。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1说明

45②用紫外分光光度计测定并计算其每毫升的黄曲霉毒素B的含量，再按此浓度用溶剂稀释后，再测定，一直稀释到相当于每毫升含有8~10μg的黄曲霉毒素B1的吸光度值，校正仪器。仪器校正。测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数,以求出使用仪器的校正因素。准确称取25mg经干燥的重铬酸钾(基准级),用硫酸(0.5+1000)溶解后并准确稀释至200mL相当CK2Cr2O7=0.0004mol/L。再吸取25mL此稀释液于50mL容量瓶中,加硫酸(0.5+1000)稀释至刻度，相当0.0002mol/L溶液。

薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1说明

46再吸取25mL此稀释液于50mL容量瓶中,加硫酸(0.5+1000)稀释至刻度,相当于0.0001mol/L溶液。用1cm石英杯,在最大吸收峰的波长(接近350nm处)用硫酸(0.5+1000)作空白,测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸光度,计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值。E1=A/C式中E-重铬酸钾溶液的摩尔消光系数;A--测得重铬酸钾溶液的吸光度;c--重铬酸钾溶液的摩尔浓度。

薄