维生素B2片分析方法验证方案

概述

1.维生素B2片含量测定：照高效液相色谱法（通则0512）测定©

1.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为

填充剂；以0.Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙月青一甲醇（85：

10：5）为流动相；检测波长为444nm°理论板数按维生素峰计算不

低于2000。

1.2测定法避光操作。取本品20片，精密称定，研细，精密称

取适量（约相当于维生素B?10mg）,置500nli量瓶中，加盐酸溶液（1T

2）10ml,振摇使维生素B2溶解，加水20ml,继续振摇数分钟，再加

水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20ul注入液相电谱

仪，记录色谱图；另取维生素B2对照品约10mg,同法测定。按外标法

以峰面积计算，即得。

1.3本品含维生素B2计算，应为标示量的90.0%~110.0%。

2.维生素B2片溶出度测定：照溶出度与释放度测定法（通则C931

第二法）

测定法避光操作。取本品，以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠溶液

18ml用水稀释至600nli为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，

经20分钟时，取溶液10ml,滤过，取续滤液，照紫外-可分光光度法

（理图0401）,在444nm的波长处测定吸光度,按G7H别几的吸收系数

（七二）为323计算每片的溶出量。限度为标示量的75%,应符合规定。

3.维生素B2片有关物质测定：照高效液相色谱法（通则0512）测

定。

色谱条件照含量测定。

避光操作。取本品的细粉适量（约相当于维生素BzlOmg）,置100ml

量瓶中，加盐酸溶液（lT2）5ml,振摇使维生素B,溶解，加水10ml,

继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供

试品溶液；精密量取1ml,置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，

作为对照溶液。精密量取供试品溶液与对照溶液各20ul,分别注入液

相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液的色

谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的

0.75倍（1.5%）,各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的

1.5倍（3.0%）o供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰而积0.025

倍的色谱峰忽略不计。

4.工艺处方组成

规格：5mg

物料名称基准处方1000片

维生素B25.00g

淀粉30.70g

糊精24.00g

硬脂酸镁0.30g

45%乙醇溶液21.00g

乙醇(95%)9.75g

纯化水11.25g

合计60g

5、仪器基本情况:

设备名称XXXX设备编号XXXX

型号XXXX出厂编号XXXX

出厂日期XXXX安装位置XXXX

岛津国际贸易（上海

生产厂家日本岛津供货厂家

有限公司）

设备名称XXX设备编号XXXX

型号XXXX出厂编号XXXX

安装位置XXXX

生产厂家XXX

供货厂家岛津公司

6.相关术语：

6.1准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。

一般用回收率（％）表示。回收率限度应在98%〜102%之间。

6.2精密度系指在规定的条件下同一份均匀的供试品，经多次取样测

定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标

准偏差表示。

6.3线性系指在设计的范围内，测定响应值与试样中被测物质浓度呈

比例关系的程度

6.4范围系指分析方法能达到一定精密度、准确度和线性要求时的高

低限浓度或量的区间。

6.5检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。

6.6耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受

程度。

二.验证目的

通过脸证以确认所采用的方法适合于维生素B2片的测定。根

据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根

据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件

进行维生素B2片检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验

条件，再进行脸证，直至脸证结果符合设立的脸证标准。

三.验证依据

中国药典2015年版二部

中国药典2015年版四部9101《药品质量标准分析方法验证指导

原则》

四.参考文件

1、验证管理规程

2、验证总计划

3、SIL-20A高效液相色谱仪操作维护保养规程

4UV-1800紫外可见分光光度计操作维护保养规程

5、中国药典2015年版

6、变更控制规程

18Ag/ml>20l^g/ml>22pg/ml、24Mg/ml的溶液。

1.2.2测定

精密量取经微孔滤膜过滤后各不同浓度稀释液20uI,注入液相

色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图。按外标法以峰面积计算。

1.2.3判定标准：维生素B2在16%/ml至24%/ml的浓度范围内,维

生素B2峰面积成线性且相关系数R299.8%。

1.3维生素B2片含量分析方法精密度验证

1.3.1流动相配制见维生素B2片含量分析方法线性验证项下。

1.3.2样品溶液配制

取维生素B2片20片（XXXX生产），精密称定，计算平均片重，

研细，精密称取样品适量（约相当于维生素B210mg）置500ml量瓶

中，盐酸溶液（（lT2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml,继

续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过制成20Ng/ml的溶液，

取续滤液作为样品溶液。

1.3.3测定

精密量取20nl注入液相色谱仪，记录邑谱图，连续6次，得到维

生素B2峰面积，计算维生素B2峰的S同。

1.3.4判定标准：维生素B2峰面积的S，eW2.0%。

1.4维生素B2片含量分析方法准确度验证

1.4.1流动相配制、处方量辅料配制见维生素B2片含量分析方法线

性验证项下。

1.4.2样品溶液配制

精密称定维生素B2对照品约25mg,置250nli容量瓶中，加入处

方量混合辅料275mg,加盐酸溶液（（1T2）10ml）振摇使维生素B2

溶解，加水20ml,继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，

取续滤液，制成浓度为100Ng/ml的溶液。

按80%、100%、120%的倍数稀释，精密量取续滤液8ml、10ml、

12ml,分别置于50ml容量瓶中，加水配制成浓度为16随/ml、20吆

/mI、24Mg/mI的测试溶液。

1.4.3测定

精密量取20Hl注入液相色谱仪，记录色谱图，得到维生素B2

峰面积。通过线性方程计算维生素B2浓度。用测得浓度和实际浓度

之比计算回收率。

1.4.4判定标准:回收率限度应在98%-102%之间,回收率的九£2.0%。

1.5维生素B2片含量分析方法范围险证

1.5.1数据记录及结果计算

依据1.2线性，1.3精密度，1.4准确度，确定高效液相色谱法

符合《中国药典》2015版维生素B2峰含量的范围一般为测定浓度的

范围。

1.5.2判定标准：含量的范围一般为测定浓度的80%〜120%。

1.6维生素B2片含量分析方法专属性验证

1.6.1流动相配制、溶剂I配制、处方量辅料配制见维生素B2片含

量分析方法线性验证项下。

1.6.2溶液配制

1.6.2.1供试品溶液：取维生素B2片（XXXX生产）20片，精密称定，

计算平均片重，研细，精密称取样品（约相当于维生素B210mg）,置

500ml量瓶中，加盐酸溶液（（lT2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加

水20mI,继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过制成20Ng/ml

的溶液，取续滤液作为供试品溶液。

1.6.2.2对照品溶液：精密称取维生素B2对照品10mg,置500ml量

瓶中,加盐酸溶液（（1T2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加水20ml,

继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，制成20照/ml的对

照品溶液。

1.6.2.3空白溶液：在500ml量瓶中，加盐酸溶液（（1-2）10ml）振

摇，再加水稀释至刻度，摇匀，作为空白溶液。

1.6.2.4阴性溶液：按照片剂配方，加入处方量混合辅料55mg,置

250nli量瓶中，加盐酸溶液（（lT2）10ml）,加水20ml,继续振摇数分

钟，再加水稀释至刻度，摇匀，滤过，续滤液，作为阴性溶液。

1.6.3测定

精密量取经微孔滤膜过滤后的供试品溶液、对照品溶液、空白溶

液、阴性溶液各20uI,注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录

色谱图。

1.6.4判定标准：维生素B2对照品溶液与样品溶液主峰保留时间一致,

空白溶液与阴性溶液在主峰保留时间处应为平直基线，无吸收峰。

1.7维生素B2片含量分析方法耐用性脸证

1.7.1改变流动相比例

1.7.1.1色谱条件

①固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）;

②检测器：紫外检测器，检测波长444nm;

③流动相：0.Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙聘-田醇

（80：15：5）为流动相

④流速：1.OmL/mino

⑤柱温：30℃

⑥进样量：20uLo

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

1.7.1.2系统适用性试验溶液：系统适用性试验溶液：取维生素B2

对照品10mg,置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液（（1T2）10ml）振

摇使维生素B2溶解，加水20ml,继续振摇数分钟，再加水稀释至刻

度，摇匀。溶解并稀释制成每1ml中各约含20%的溶液，

1.7.1.3取系统适用性试脸溶液2O|1L注入液相色谱仪。

1.7.2改变柱温及流动相

1.7.2.1色谱条件

①固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）;

②检测器：紫外检测器，检测波长444nm;

③流动相：0.Olmol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液-乙睛-口醇

（85:10:5）为流动相

④流速：1.0mL/min。

⑤柱温：33℃

⑥进样量：20RLO

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

1.7.1.2系统适用性试验溶液：取维生素B2对照品10mg,置500ml

的容量瓶中，加盐酸溶液（（lT2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加

水20ml,继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇勺。溶解并稀释

制成每1ml中各约含维生素B220吨的溶液。

1.7.1.3取系统适用性试验溶液20uL注入液相色谱仪。

1.7.2.2系统适用性试验溶液：取维生素B2对照品10mg,置500ml

的容量瓶中，加盐酸溶液（（lT2）10ml）振摇使维生素B2溶解，加

水20ml,继续振摇数分钟，再加水稀释至刻度，摇匀。溶解并稀释

制成每1ml中各约含维生素B220照的溶液。

1.7.2.3取系统适用性试脸溶液20nL注入液相色谱仪。

1.7.3判定标准：在改变流动相比例及改变柱温后，方法通过系统适

用性试验，理论板数按维生素B2峰计算不低于2000o

2.维生素B2片溶出度分析方法验证

2.1维生素B2片溶出度分析方法线性验证

照溶出度与释放度测定法（通则0931第一法（篮法）及紫外分光光

度法测定法测定（通则0401）。

2.1.1溶液配制

2.1.1.1溶出介质制备：冰醋酸3nli与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀

释至600ml为溶出介质。

2.1.1.2样品溶液配制

分别精密称定维生素B2对照品约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、

约10mg,置100ml容量瓶中，加溶出介质溶解并稀释至刻度，摇匀，

分别制成含维生素B2浓度约为6股/ml、7阻/ml、8服/ml、9服/ml、

10l^g/ml的溶液。

2.1.2测定

以溶出介质作为空白试脸；照紫外分光光度法，取供试品溶液在

444nm的波长处测定吸光度A,记录色谱图。（图谱附后）

2.1.3判定标准：维生素B2片在6Ng/ml至10Ng/ml的浓度范围内，

维生素B2溶出度吸光度成线性且相关系数R299.0%。

2.2维生素B2片溶出度分析方法精密度验证

2.2.1样品溶液配制

取维生素B2片1片（XXXX生产），以冰醋酸3ml与4%氢氧化

钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质。照溶出度第一法（通则

0931）测定，转速为每分钟100转，依法操作。经20分钟时，在浆

叶顶端至液面中心，距溶出杯内壁10mm处取溶液10ml,滤过，作为

样品溶液。

2.2.2测定

取供试品溶液在444nm的波长处测定吸光度A。

2.2.3判定标准：维生素B2片溶出度溶液峰面积的SreW2.0%。

2.3维生素B2片溶出度分析方法耐用性验证

2.3.1样品溶液配制

取维生素B2片1片（XXXX生产），以冰醋酸3ml与4%氢氧化钠

溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质。照溶出度第一法（通则0931）

测定，转速为每分钟100转，依法操作。经20分钟时，在浆叶顶端

至液面中心，距溶出杯内壁10mm处取溶液10ml,滤过，作为样品溶

液。

2.3.2测定

样品溶液，在室温下放置，分别于0、1、2、3、4、5、6小时精

密样品溶液，在444nm的波长处测定吸光度A。

2.3.3判定标准：溶出度溶液6小时内溶液稳定，维生素B2片溶出

度溶液峰面积的RSDW2%。

2.4维生素B2片溶出度分析方法准确度脸证

2.4.1处方量原辅料配制

处方量50%原辅料：精密称定维生素B2对照品2.5mg、淀粉约

15.35mg.糊精约12mg、硬脂酸镁约0.15mg。混合。

处方量80%原辅料：精密称定维生素B2对照品4mg、淀粉约

24.56mg、糊精约19.2mg>硬脂酸镁约0.24mgo混合。

处方量100%原辅料：精密称定维生素B2对照品5mg、淀粉约

30.7mg、糊精约24mg、硬脂酸镁约0.3mg。混合。

2.4.2样品溶液配制

分别将处方量50%、80%、100%原辅料置溶出杯中，加冰醋酸3ml

与4%氢氧化钠溶液18ml用水稀释至600ml为溶出介质，照溶出度第

一法（通则0931）测定，转速为每分钟100转，依法操作。经20分

钟时，在浆叶顶端至液面中心，距溶出杯内壁10mm处取溶液10ml,

滤过，作为样品溶液。每个浓度水平配制3份。

2.4.3测定

取供试品溶液在444nm的波长处测定吸光度A,记录色谱图，得

到维生素B2的吸光度。通过线性方程计算维生素B2浓度。用测得浓

度和实际浓度之比计算回收率。

2.4.4判定标准：回收率应为标示量的95%-105%之间，回收率的

Srel<2.5%o

3.维生素B2片有关物质分析方法验证

3.1系统适用性实验

3.1.1色谱条件

,©固定庙：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18）;

②检测器：紫外检测器，检测波长444nm;

③流动相：0.01mol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液：乙脐：

甲醇二85:10:50

④流速：1.OmL/mino

⑤柱温：30℃

⑥进样量：20nLo

3.1.2测定方法

按高效液相色谱法（通则0512）测定。

3.1.3溶液配制

取维生素B2对照品10mg,置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液

（（1T2）10HII）振摇使维生素B2溶解，加水20ml,继续振摇数分钟，

再加水稀释至刻度，摇句。溶解并稀释制成每1ml中各约含20Ng的

溶液。

3.1.4取系统适用性试验溶液20uL注入液相色谱仪。

3.1.5系统适应性试验

取系统适用性实验溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。

3.1.6判定标准：理论板数按维生素B2峰计算不低于2000o

3.2维生素B2片有关物质分析方法专属性验证

3.2.1溶液配制

A.处方量辅料：精密称定淀粉约30.7mg、糊精约24mg、硬脂酸镁约

0.3mgo混合。

B.供试品溶液：取维生素B2片（XXXXX生产）20片，精密称定，研

细，精密称取细粉适量（约相当于维生素B210mg）,置100ml的量

瓶中，加盐酸溶液（1-2）5ml,振摇使维生素B2溶解，加水10ml,

充分振摇匀，使维生素B2溶解并加水稀释至刻度,摇匀，滤过，取续滤

液，作为供试品溶液。

C.空白溶液：取已配制的全部处方量辅料，置100ml量瓶中，力口盐酸

溶液（1T2）5ml,充分振摇匀，加水并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续

滤液，作为储备液。

3.2.2测定

按高效液相色谱法（通则0512）测定。色谱条件同3.1.1。

精密量取供试品溶液和储备液各20uI,注入液相色谱仪，记录

色谱图。

3.2.3判定标准：维生素B2片在444nm处有吸收峰出现，维生素B2

片的处方量辅料无吸收峰出现，维生素B2片的处方量辅料不干扰有

关物质的检查。

3.3维生素B2片有关物质分析方法检测限验证

3.3.1溶液配制

供试品溶液：见专属性脸证项下供试品溶液。

样品溶液：取供试品溶液适量，加水分别配置成lOONg/ml、

50Ng/ml、25kg/ml、12.5kg/ml、2.5Ng/ml、0.25Ng/ml、0.025l-lg/mI

浓度的溶液。

3.3.2测定

按高效液相色谱法(通则0512)测定。色谱条件同3.1.1。

精密量取样品溶液20口I,注入液相色谱仪，记录色谱图。

3.3.3判定标准：当S/N73时为检测限。

3.4维生素B2片有关物质分析方法耐用性脸证

3.4.1溶液配制：

取维生素B2对照品10mg,置500ml的容量瓶中，加盐酸溶液

((112)10ml)振摇使维生素B2溶解，加水20ml,继续振摇数分钟，

再加水稀释至刻度，摇匀。溶解并稀释制成每1ml中各约含20Ng的

溶液，作为系统适用性实验溶液。

3.4.2

色谱条件

①'固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(C18);

②检测器：紫外检测器，检测波长444nm;

③流动相：0.01mol/L庚烷磺酸钠的0.5%冰醋酸溶液：乙般：

甲醇二85:10:5o

(4)流速：1.OmL/mino

⑤柱温：33℃

⑥进样量：20uLo

3.4.3测定

按高效液相色谱法(通则0512)测定。取系统适用性实验溶

液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。

3.4.4判定标准：

理论板数按维生素B