级免疫学实验固有细胞免疫

实验三非特异性反应、细胞免疫测定1.吞噬作用 示教 2.溶菌酶实验 1个平板/组3.机体细胞免疫功能测定E玫瑰花环实验 示教淋巴母细胞转化实验 示教4.免疫细胞的分离与纯化——小鼠脾细胞或胸腺细胞的制备1份/组第一页，共三十八页。一、非特异性免疫功能的测定

（一）、天然免疫的组成屏障结构

（1）体表屏障:

物理屏障化学屏障生物学屏障（2）体内屏障结构全身淋巴结屏障血-脑屏障

血-胎屏障第二页，共三十八页。参与天然免疫的效应分子

防御素补体系统细胞因子溶菌酶其他效应分子第三页，共三十八页。

参与天然免疫的效应细胞吞噬细胞NK细胞

T细胞肥大细胞NKT细胞上皮细胞及其附属成分第四页，共三十八页。1、吞噬细胞及吞噬作用吞噬作用是指白细胞游出到炎症灶，吞噬病原体以及组织碎片的过程。完成此功能的吞噬细胞主要有两种，其吞噬异物的过程基本相同，但其结构和化学成分则有所不同。

中性粒细胞巨噬细胞第五页，共三十八页。

中性粒细胞单核-吞噬细胞名称小吞噬细胞大吞噬细胞部位外周血中外周血:单核不同组织中:吞噬细胞大小直径10～12μm直径为14～17μm胞核呈杆状或分叶状,常为2-5叶肾形或弯曲折叠的不规则形核质核染色质呈块状,着色深颗粒纤细而疏松，故着色较浅胞浆富含中性颗粒胞浆较丰富的溶酶体寿命短,更新快长特点应答迅速,在早期起主要作用持续1-2天,是天然免疫晚期应答的主要效应细胞吞噬范围主要是化脓性细菌细菌、病毒、原虫、其他异物第六页，共三十八页。吞噬发生的最初1-2小时，吞噬细胞趋化因子聚集于微生物附近粘附于微生物表面吞入胞浆，形成吞噬体一系列反应，杀灭微生物吞噬过程第七页，共三十八页。实验方法：中性粒细胞的吞噬作用金黄色葡萄球菌1-2ml，注入小白鼠腹腔内5小时后，解剖，腹腔液涂片、染色观察小吞噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌的现象第八页，共三十八页。中性粒细胞吞噬葡萄球菌第九页，共三十八页。实验方法：巨噬细胞的吞噬作用10%鸡红细胞悬液注入小白鼠腹腔内分别于1,6,24小时抽取腹腔液涂片、染色观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象第十页，共三十八页。巨噬细胞吞噬鸡红细胞第十一页，共三十八页。3、溶菌酶试验溶菌酶是正常体液与分泌液中所含的一种低分子量的碱性蛋白质，主要来源于巨噬细胞，是天然免疫中一种重要的体液杀菌成分。肽聚糖是细菌细胞壁中的重要成分，溶菌酶能够水解肽聚糖从而使细菌溶解。细革兰氏阳性：溶解菌革兰氏阴性：肽聚糖外面有一层脂多糖和脂蛋白，一般情况下不受溶菌酶的影响。第十二页，共三十八页。实验室准备：（1）带菌平板的准备：处理好溶壁微球菌加入琼脂内,到平板,冷凝备用。（2）每平板打4个小孔，如图。1234第十三页，共三十八页。

同学们操作步骤：清水漱口将唾液涂于空平板中用吸管吸出，按下图滴入孔内37℃过夜明天上午测量溶菌环的直径，记录分析第十四页，共三十八页。1234PBS

阴性对照鸡蛋清阳性对照1，4加入唾液标本第十五页，共三十八页。二、E玫瑰花环形成实验实验原理T细胞表面标志CD2，即绵羊红细胞受体绵羊红细胞表面CD58可与CD2结合可用于T细胞的计数与分离第十六页，共三十八页。第十七页，共三十八页。第十八页，共三十八页。三、T淋巴细胞转化实验T细胞受到特异性抗原或非特异性丝裂原刺激时，可发生转化。特异性抗原非特异性丝裂原：PHA、ConA等。正常人淋巴细胞受到PHA刺激后，其转化率为60-80%。第十九页，共三十八页。转化细胞形态特征细胞体积：增大细胞核大小：增大染色质：疏松核仁：清晰有丝分裂：+/-细胞浆着色空泡或伪足第二十页，共三十八页。第二十一页，共三十八页。第二十二页，共三十八页。四、小鼠脾细胞的制备目的要求掌握分离制备小鼠脾细胞悬液的操作方法。材料动物：小鼠RPMI-1640细胞培养液Tris-NH4Cl红细胞裂解液75%酒精第二十三页，共三十八页。1.固定小鼠[实验步骤]第二十四页，共三十八页。2.暴露眼球[实验步骤]第二十五页，共三十八页。3.小镊子夹眼球放血，拉颈椎处死小鼠[实验步骤]第二十六页，共三十八页。4.剪开皮肤，暴露腹腔，找到脾脏[实验步骤]第二十七页，共三十八页。5.分离，摘除脾脏[实验步骤]第二十八页，共三十八页。6-1.冲洗脾脏[实验步骤]第二十九页，共三十八页。6-2.冲洗脾脏[实验步骤]第三十页，共三十八页。7-1.用注射器芯研磨脾脏，获得细胞悬液[实验步骤]第三十一页，共三十八页。7-2.用注射器芯研磨脾脏，获得细胞悬液[实验步骤]第三十二页，共三十八页。

8.

低速离心（2000转/分钟，10min）[实验步骤]第三十三页，共三十八页。9-1.离心后弃上清，留沉淀的细胞[实验步骤]第三十四页，共三十八页。9-2.离心后弃上清，留沉淀的细胞[实验步骤]第三十五页，共三十八页。9-3.离心后弃上清，留沉淀的细胞[实验步骤]第三十六页，共三十八页。