白扁豆HPLC指纹图谱研究

白扁豆HPLC指纹图谱研究 白扁豆HPLC指纹图谱研究[摘要]目的：建立白扁豆HPLC指纹图谱的分析方法，为科学鉴定白扁豆药材的真伪与评价其质量提供依据。方法：采用WatersXselectHSST3色谱柱(5μm，4.6×250mm)；流动相为甲醇-水溶液，梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为257nm；柱温为25°C的色谱条件，测定16批白扁豆HPLC指纹图谱。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”对各批次白扁豆进行相似度评价。结果：建立相似度在0.980以上的白扁豆HPLC指纹图谱。结论：建立了白扁豆HPLC指纹图谱模型，可科学地鉴别白扁豆原药材的真伪以及可为白扁豆原药材质量控制及以白扁豆为主要原料药的中药制剂质量标准的拟定提供参考依据。[关键词]白扁豆；高效液相色谱；指纹图谱；葫芦巴碱；质量评价StudyonthefingerprintofLablabsemenalbum[Abstract]Objective:toestablishHPLCfingerprintanalysismethodforlablabsemenalbum.Methods:WatersXselectHSST3chromatographiccolumn(5μm，4.6×250mm)wasused.Themobilephasewasmethanol-watersolutionwithgradientelution.Theflowratewas1.0ml/min.Thedetectionwavelengthis257nm.Chromatographicconditionsofcolumntemperatureis25°CtodeterminetheHPLCfingerprintsof16batchesoflablabsemenalbum.ThesimilarityevaluationofeachbatchoflablabsemenalbumwascarriedoutbyusingthesimilarityevaluationsystemofChinesemedicinechromatogramfingerprint2012edition.Results:HPLCfingerprintofLablabsemenalbumwithsimilarityabove0.980wasestablished.Conclusion:theHPLCfingerprintmodeloflablabsemenalbumwasestablished,whichcanbeusedtoscientificallyidentifytheauthenticityoflablabsemenalbumandprovidereferenceforthequalitycontroloflablabsemenalbumandtheformulationofthequalitystandardofChinesemedicinepreparationwithlablabsemenalbumasthemainrawmaterial.[Keywords]Lablabsemenalbum；Highperformanceliquidchromatography；Fingerprints；N-methylnicotinate；QualityControl目录TOC\o"1-2"\h\z\u引言 引言白扁豆为豆科植物扁豆DolichoslablabL.的干燥成熟种子，是常用的药食同源的中药材[1]。由于白扁豆的化学成分较为复杂且白扁豆的伪品及混淆品众多，运用传统的性状鉴别与显微鉴别难以全面地鉴别其真伪，不足以评价其质量的优劣。而中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定分析方法，可用于鉴别中药材真伪，评价中药材由于产地和采收期等因素不同所造成的质量差异以及考察中药材质量的均一性与稳定性。目前对于白扁豆的研究大多是关于药理作用方面而在白扁豆的鉴别与分析方面却鲜有报道，因此为了更加有效地控制白扁豆药材的质量，保证白扁豆的质量稳定性，本课题拟通过建立白扁豆HPLC指纹图谱，并借助指纹图谱相似度评价软件，对16批白扁豆药材进行分析与评价，以期为白扁豆药材的鉴别、质量优劣控制提供新的科学参考依据。1白扁豆HPLC指纹图谱文献研究1.1白扁豆概述《中国药典》2015年版一部收载白扁豆为豆科植物扁豆DolichoslablabL.的干燥成熟种子[1]。其又名扁豆、白藊豆、峨眉豆、南扁豆、沿篱豆等，性甘、微温，归脾、胃经。原产于印度等热带地区，在我国最早可追溯到汉晋时期[2]。具有健脾化湿，和中消暑的功能，是常用药食同源的中药材[3]。常用于脾胃虚弱，暑湿吐泻，大便溏泄，食欲不振，白带过多，胸闷腹胀等[4-6]。其被广泛地引用于各种健脾祛湿的食疗；在临床上，广泛用于治疗小儿脾虚湿热型腹泻[7-8]，也被用于治疗各种功能性腹泻[9]；近几年还用作抗肿瘤治疗的辅助药物和治疗黄褐斑的药物[10-11]。1.1.1化学成分及药理作用研究白扁豆的化学成分主要有糖类、脂类、蛋白质、甾体、苷类、维生素、矿物质[12]和葫芦巴碱[13-14]等。糖类为白扁豆的主要成分，其除含淀粉外，还含有水苏糖、果糖等。胡国柱[15]的研究表明白扁豆多糖具有抗氧化活性。弓建红[16]的研究表明白扁豆多糖能增强细胞的免疫功能。陈志飘[17]的研究表明白扁豆多糖对酒精性肝病（ALD）具有防治作用。姚于飞[18]的研究表明白扁豆多糖对神经细胞的缺氧性凋亡坏死具有保护作用。蛋白质是白扁豆的生物活性成分，一种从白扁豆种子中纯化出名为dolichin的抗菌蛋白，不仅具有抗菌活性，还能够抑制HIV反转录与侵染过程中的甘油水解酶α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶[19]。白扁豆所含的植物血细胞凝集素能够增强人体对肿瘤的免疫能力[20]。现代白扁豆的现代药理学研究表明白扁豆除以上作用外还具有降血脂，降血糖和避孕作用等[21-22]。1.1.2伪品及混淆品近年来，白扁豆的混淆品及伪品在市场上层出不穷，某些地区还将白扁豆的变种作白扁豆入药。孔德远[23]在市场上发现了白扁豆的混淆品，经研究鉴定为豆科植物金甲豆PhaseoluslunatusL.的干燥成熟种子，具有补血消肿的功效。市场上还有以缅甸进口扁豆充作白扁豆，称作“进口扁豆”，为白扁豆的伪品；另外山东曹县所产的白扁豆与真品白扁豆有明显的区别，不能入药[24]。目前白扁豆的混淆品和伪品众多，但在药典中也仅有性状与显微两种鉴别方法，不能全面地鉴别白扁豆的真伪,缺乏量化指标和手段，缺乏专属性，难以对白扁豆药材的真伪和优劣进行准确、全面的评价[25]。1.2中药指纹图谱研究概述中药指纹图谱，是指某些中药材或中药制剂经过适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其特性的共有峰的图谱。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，可用于鉴别中药材真伪，评价中药材质量的均一性与稳定性，其特点为系统性、特征性与稳定性，其基本属性为“整体性”和“模糊性”[26]。建立中药指纹图谱的方法可分为光谱法、色谱法、质谱(MS)法，核磁共振(NMR)法，X射线衍射法和免疫测定法，其中应用最为广泛的为高效液相色谱法（HPLC）[27-28]。中药指纹图谱能够较全面地反映药材中的化学成分，体现中药化学成分的复杂性，与中医药理论的“整体性”相适应，能够实现对中药材质量的有效综合评价与全面控制[29]。中药指纹图谱不仅能对中药材进行质量控制，还能对中药产品进行综合性的质量评价,如陈玲[29]等人用HPLC法建立了黄芩饮片以及以黄芩为原料的一系列产品的指纹图谱，对黄芩进行了综合的质量评价。中药指纹图谱能对不同产地的同种药材的相似度进行评价，采用化学共有模式识别，评价药材的一致性，已达到科学评价药材质量，划分药材品质等级，为合理运用中药材的安全性与准确性提供有效的参考依据[30]。2仪器与试药2.1仪器MettlerTLE204电子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；G&GJJ500型电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；KQ-700DE型数控超声波清洗器(700W,40KHz)(昆山市超声仪器有限公司)；HH系列数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司)；Greatwall低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司)；Thermo台式小型高速冷冻离心机(SorvallLegendMicro17R)(美国赛默飞世尔科技公司)；MilliporeAdvantageA10自动纯水机(美国默克密理博公司)；Agilent1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)2.2试药2.2.1试剂甲醇（色谱纯）(美国默克公司)；甲醇（分析纯）(广州化学试剂厂)；液相用水（超纯水）(屈臣氏集团)2.2.2供试品白扁豆药材批号见表1，购于广州康圣药业有限公司表1白扁豆药材批号编号批号编号批号S12017010101S92017030903S22017030102S102017010203S32017020201S112017090201S42017030202S122017050402S52017030302S132017050301S62017030402S142017110302S72017030601S152017080302S82017030702S1620171202032.2.3对照品葫芦巴碱对照品（批号：H购于成都瑞芬思生物科技有限公司，供含量测定用，含量以98.63%计，使用前无需处理。3溶液的制备3.1供试品溶液的制备精密称定白扁豆药材粉末（已过三号筛）约1.5g，置于100ml具塞锥形瓶中，精密加入25mL20%甲醇后，摇匀，称重并记录；超声处理（功率700W，频率40kHz）30min，取出放冷后再次称重，用20%甲醇补足其失重，摇匀后离心（13000转/min），取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。3.2对照品溶液的制备精密称取葫芦巴碱对照品，加入甲醇制成含每1ml含葫芦巴碱对照品0.1mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。4色谱条件的考察与确定设定色谱条件为：色谱柱：WatersXselectHSST3色谱柱(5μm，4.6×250mm)；流动相体系：甲醇(A)-水(B)，按表2梯度洗脱；进样量：10ul；柱温：25℃；流速1ml/min。采用单一变量原则，对检测波长、色谱柱、流动相流速、色谱柱柱温进行考察，确定最佳色谱条件。表2流动相梯度时间(min)甲醇(A%)水(B%)00100501003035653510004.1检测波长的考察采用二极管陈列检测器对供试品进行全波长扫描，在三维色谱图下观察不同波长时色谱峰的整体峰形。对比不同波长下各色谱峰的数目与峰型、响应值、基线平整情况等，最终选定257nm为检测波长。白扁豆药材指纹图谱三维色谱图见图1，不同波长下指纹图谱见图2至图3。图1白扁豆药材HPLC指纹图谱全波长扫描3D图图2230nm处白扁豆HPLC指纹图谱图3257nm处白扁豆HPLC指纹图谱图4290nm处白扁豆HPLC指纹图谱4.2色谱柱的考察由于供试品中成分的化学性质不同，不同类型的的色谱柱会影响供试品中成分的出峰情况，影响指纹图谱中色谱峰的峰型与分离情况，故采用甲醇（A)-水(B)为流动相，设定检测波长为257nm，色谱柱柱温为25℃，流动相流速为1ml/min，考察了两根不同的色谱柱，分别是WatersXselectHSST3柱(5μm，4.6×250mm)和WatersSymetyeq\o\ac(○,R)C18柱(5μm，4.6×250mm)。得到了两根色谱柱在257nm时的HPLC指纹图谱，图谱见图5至图6。通过比较两个指纹图谱的出峰情况与分离度，可知WatersXselectHSST3柱(5μm，4.6×250mm)色谱柱所出的指纹图谱的峰型及分离度较好，故最终选用WatersXselectHSST3柱(5μm，4.6×250mm)。图5WatersSymetyeq\o\ac(○,R)C18柱(5μm，4.6×250mm)HPLC指纹图谱图6WatersXselectHSST3柱(5μm，4.6×250mm)HPLC指纹图谱4.3流动相流速的考察采用WatersXselectHSST3色谱柱(5μm，4.6×250mm)，甲醇(A)-水(B)为流动相体系，设定检测波长为257nm，色谱柱柱温为25℃。考察三种不同流速0.8ml/min、1ml/min与1.1ml/min对色谱峰的影响，由图可看出流速为0.8ml/min时，相对保留时间会稍微延长，而流速为1ml/min与1.1ml/min时相对保留时间的差异不大，综合考虑不同流速时的分离效果，最终确定流动相流速为1ml/min。3种不同流速HPLC指纹图谱见图7至图9。图7流速0.8ml/minHPLC指纹图谱图8流速1ml/minHPLC指纹图谱图9流速1.1ml/minHPLC指纹图谱4.4色谱柱柱温的考察采用WatersXselectHSST3色谱柱(5μm，4.6×250mm)，甲醇(A)-水(B)为流动相体系，设定检测波长为257nm，流动相流速为1ml/min。考察20℃、25℃、30℃3个不同柱温对指纹图谱的影响。综合考虑色谱峰的峰型与分离效果，故确定色谱柱柱温为25℃。3种色谱柱柱温指纹图谱见图10至图12。图10柱温20℃HPLC指纹图谱图11柱温25℃HPLC指纹图谱图12柱温30℃HPLC指纹图谱4.5确定色谱条件 根据上述研究结果，确定色谱条件为：检测波长：257nm色谱柱：WatersXselectHSST3色谱柱(5μm，4.6×250mm)；流动相体系：甲醇（A)-水(B)，按表2梯度进行洗脱；流动相流速：1ml/min；色谱柱柱温：25℃；进样量：10ul。5供试品提取工艺的考察5.1提取溶剂的考察精密称取批号为2017010101的供试品各4份，每份约1.5g。置于具塞锥形瓶中，分别精密量取20%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇各25ml，称定重量并记录。超声（700W，40KHz)30min，放冷，称定重量，分别用20%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇补足失重，摇匀后离心（13000转/min），取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，得4份供试品溶液。取上述供试品分别进样，所得的指纹图谱见图12至图15。由图谱所知，20%甲醇作为提取溶剂时所得图谱的色谱峰数目较多，峰型较好，故选定20%甲醇作为提取溶剂。图1220%甲醇图1350%甲醇图1470%甲醇图15甲醇5.2提取方法的考察精密称取批号为2017010101的供试品各2份，每份约1.5g，置于具塞锥形瓶中，分别精密量取20%甲醇溶液各25ml，称定重量并记录。分别进行超声（700W,40KHz)30min，加热回流30min处理。取出放冷后称定重量，用20%甲醇溶液补足失重，摇匀。离心（13000转/min），取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，得2份供试品溶液。取供试品分别进样，所得图谱见图16至图17。由图谱可知超声30min提取时图谱中所出的色谱峰的数目，峰型及分离度均优于回流30min，且超声的操作也较回流的简便，故选择超声作为提取方法。图16回流30min图17超声30min5.3提取时间考察精密称取批号为2017010101的供试品各3份，每份约1.5g，置于具塞锥形瓶中，分别精密量取20%甲醇溶液各25ml，称定重量并记录。分别进行超声（700W,40KHz)15min、30min、45min处理。取出放冷后称定重量，用20%甲醇溶液补足失重，摇匀。离心（13000转/min），取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，得3份供试品溶液。取供试品分别进样，所得结果见图18至19。由所得图谱可知，超声30min时所得图谱的色谱峰的峰型及分离度较超声15min的好，虽超声30min所得的色谱峰数目不及超声45min的，但综合考虑色谱峰的峰型、分离度及基线的平整情况，故选择30min作为最终的提取时间。图18超声15min图19超声30min图20超声45min5.4提取工艺确定根据上述研究结果，确定提取工艺为：提取溶剂：20%甲醇；提取方法：超声（700W,40KHz)30min。6方法学考察6.1精密度试验精密称取白扁豆药材粉末(S2)约1.5g，按“3.1”项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液按“4.5”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。确定1号色谱峰（葫芦巴碱）为参照色谱峰，通过Excel计算出分别计算6个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果如表3、表4所示。结果表明，各峰的相对保留时间RSD%小于0.05%，相对峰面积RSD%均小于2.68%，将6幅色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似评价系统2012版”进行匹配与相似度分析，匹配结果见图21。相似度评价结果见表5，数据显示六幅色谱图和其得到的对照指纹图谱相似度均大于0.994，说明该仪器精密度良好，符合HPLC指纹图谱的技术要求。表3精密度试验共有峰相对保留时间序号1st2nd3rd4th5thth6RSD%11.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0023.2663.2613.2633.2623.2623.2610.0534.0544.0554.0534.0514.0524.0530.0345.1505.1515.1495.1475.1495.1490.0355.3615.3625.3595.3585.3595.3590.0366.6616.6576.6556.6566.6586.6580.03表4精密度试验共有峰相对峰面积序号1st2nd3rd4th5th6thRSD%11.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0020.0480.0470.0480.0450.0480.0492.6830.1060.1040.1070.1040.1080.1022.2540.2050.2010.2040.2100.2030.2142.4650.1240.1210.1230.1250.1250.1302.4760.0130.0140.0140.0140.0140.0142.38图21精密度试验匹配色谱图表5精密度试验HPLC指纹图谱相似度评价结果1st2nd3rd4th5th6thRSD%相似度0.9940.9980.9990.9990.9990.9970.206.2重复性试验精密称取白扁豆药材粉末(S2)6份，每份约1.5g，按“3.1”项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液按“4.5”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。确定1号色谱峰（葫芦巴碱）为参照色谱峰，分别计算6个共有峰的相对保留时间和相对峰面积计算结果见表6，表7。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD%均小于0.07%，相对峰面积RSD%均小于2.97%，说明该方法重复性良好。将6幅色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似评价系统2012版”进行匹配与相似度分析，匹配结果见图22，相似度评价结果见表8，数据显示6幅色谱图和其得到的对照指纹图谱相似度均大于0.987，说明其相似性较好。由以上结果表明该方法的重复性良好，符合HPLC指纹图谱的技术要求。表6重复性试验共有峰相对保留时间序号1st2nd3rd4th5th6thRSD%11.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0023.2613.2643.2653.2593.2653.2640.0734.0574.0604.0654.0594.0624.0610.0645.1535.1575.1605.1565.1615.1610.06续表6序号1st2nd3rd4th5th6thRSD%55.3645.3695.3715.3685.3725.3730.0666.6616.6676.6706.6676.6716.6720.06表7重复性试验共有峰相对峰面积序号1st2nd3rd4th5th6thRSD%11.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0020.0530.0520.0530.0540.0560.0552.8730.1250.1230.1280.1310.1310.1292.4640.2440.2630.2630.2630.2610.2642.9550.1570.1630.1560.1630.1690.1662.9760.0140.0140.0140.0130.0140.0141.69图22重复性试验匹配色谱图表8重复性试验HPLC指纹图谱相似度评价结果1st2nd3rd4th5th6thRSD%相似度0.9870.9980.9990.9990.9990.9980.486.3稳定性试验精密称取白扁豆药材粉末(S2)约1.5g，按“3.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h时按“4.5”项下色谱条件进行测定。确定1号色谱峰（葫芦巴碱）为参照色谱峰，分别计算6个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰峰相对保留时间RSD%小于0.15%，相对峰面积RSD%小于2.87%。将六幅指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似评价系统2012版”进行匹配与相似度分析，匹配结果见图23。相似度评价结果见表11，数据显示六幅色谱图和其得到的对照指纹图谱相似度均大于0.990，说明其相似性较好，表明供试品溶液在12h内稳定性较好。表9稳定性试验共有峰相对保留时间时间/h024681012RSD%11.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0023.2663.2633.2623.2613.2663.2613.2630.0634.0544.0534.0524.0574.0664.0614.0670.1545.1505.1495.1495.1535.1635.1595.1630.1255.3615.3595.3595.3645.3745.3705.3740.1266.6616.6556.6586.6616.6726.6686.6750.11表10稳定性试验共有峰相对峰面积时间/h024681012RSD%11.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0020.0480.0480.0480.0470.0480.0480.0512.7930.1060.1070.1080.1110.1080.1140.1132.8740.2050.2040.2030.2100.1970.2090.2142.7250.1240.1230.1250.1300.1300.1310.1322.8660.0130.0140.0140.0140.0140.0140.0142.35图23稳定性试验匹配色谱图表11稳定性试验HPLC指纹图谱相似度评价结果024681012RSD%相似度0.9900.9980.9980.9990.9990.9970.9970.316.4空白试验精密吸取20%甲醇10μl，注入液相色谱仪，按“4.5”项下色谱条件下测定色谱图，结果表明本次实验所用的流动相和样品的溶剂对色谱图无干扰，结果见图。图24空白溶剂高效液相色谱图7白扁豆HPLC指纹图谱模型的建立7.1白扁豆HPLC指纹图谱的建立与分析取16批白扁豆药材按“3.1”项下制备供试品溶液，按“4.5”项下色谱条件下进行测定，得到16批白扁豆药材的高效液相色谱图，见图25。取葫芦巴碱对照品按“3.2”项下制备对照品溶液，按“4.5”项下色谱条件进行测定，得到葫芦巴碱对照品的高效液相色谱图，见图26。将16批白扁豆药材的高效液相色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似评价系统(2012版）”，设S1为参照图谱，采用中位数、时间窗为0.1的方法，计算16批白扁豆药材和对照指纹图谱的相似度，得到16批白扁豆药材在257nm波长下的指纹图谱，见图27。经多点校正自动匹配生成共有模式的对照指纹图谱，见图28，确定6个共有峰。图2516批白扁豆药材高效液相色谱图图26葫芦巴碱对照品色谱图图2716批白扁豆HPLC指纹图谱匹配色谱图图2816批白扁豆HPLC指纹图谱共有模式对照图谱7.2峰的确认根据6个已确认的共有峰，通过与对照品溶液色谱图对比，确认1号峰为葫芦巴碱。因其均存在于各样品中，且峰面积较大，分离度较好，故选取1号峰葫芦巴碱作为参照峰(S)。7.3相似度评价对16批白扁豆药材的指纹图谱进行数据分析，以1号峰葫芦巴碱为参照峰，以参照峰的保留时间和峰面积为1，分别计算其他共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，见表12和表13。计算结果显示，共有峰的相对保留时间RSD均在0.07%之下，表明16批白扁豆药材的指纹图谱中，各个批次的药材间的共有峰相对保留时间差别不大，但共有峰的相对峰面积的RSD相差较大，可能是由于药材中各种成分的含量因产地、环境、气候、贮藏等原因而发生了改变。将16批白扁豆药材指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似评价系统(2012版）”进行相似度评价，计算16批白扁豆指纹图谱与对照图谱间的相似度，其相似度评价结果见表14。由结果显示16批白扁豆药材的相似度与对照图谱的相似度均大于0.989，其中S1、S11、S13的相似度均能达到1.000，说明白扁豆药材的总体相似度较高，本实验所用的白扁豆药材质量较为稳定。表1216批白扁豆HPLC指纹图谱共有峰相对保留时间S1S2S3S4S5S6S7S811.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.00023.2533.2473.2513.2523.2513.2493.2523.25534.0534.0454.0514.0524.0514.0494.0514.05245.1435.1485.1445.1405.1395.1405.1455.14455.3525.3485.3545.3515.3495.3495.3545.35666.6566.6476.6576.6546.6546.6546.6586.659续表12S9S10S11S12S13S14S15S16RSD%11.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0023.2523.2553.2513.2533.2563.2553.2543.2550.0734.0514.0564.0514.0504.0494.0514.0514.0500.0645.1455.1465.1425.1425.1395.1405.1415.1390.0655.3545.3565.3505.3495.3495.3495.3505.3500.0566.6586.6596.6546.6546.6516.6526.6526.6520.05表1316批白扁豆HPLC指纹图谱共有峰相对峰面积编号S1S2S3S4S5S6S7S811.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.00020.0180.0360.0250.0500.0300.0430.0430.03830.0860.0750.0840.1370.0940.1090.1020.10840.2000.1630.2180.2880.2450.2690.2270.22150.0920.0680.1010.1850.1080.1350.1290.10060.0150.0210.0160.0150.0140.0150.0150.015续表13编号S9S10S11S12S13S14S15S16RSD%11.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0020.0570.0360.0520.0500.0410.0480.0550.05729.6330.1280.0880.1120.1150.1020.1200.1330.13419.5540.2750.2150.2390.2320.2310.2620.2870.27717.1350.1740.1160.1470.1570.1340.1580.1860.18330.7860.0180.0090.0130.0120.0120.0120.0110.01413.86表1416批白扁豆药材指纹图谱相似度比较样品S1S2S3S4S5S6S7S8相似度0.9890.9970.9980.9980.99910.9980.999续表14样品S9S10S11S12S13S14S15S16相似度0.9990.99910.99910.9990.9980.9988讨论8.1色谱条件本实验对色谱条件中的检测波长、色谱柱、流速和柱温进行了考察。8.1.1检测波长采用二极管陈列检测器对供试品进行全波长扫描，比较了各波长下指纹图谱的峰数、响应值以及考虑了基线的平整情况，最终选定257nm作为检测波长，在此检测波长下，指纹图谱的峰数较多，响应值较高且基线较为平整。8.1.2色谱柱考察了WatersXselectHSST3柱(5μm，4.6×250mm)和WatersSymetyeq\o\ac(○,R)C18柱(5μm，4.6×250mm)2种色谱柱，经比较发现，在相同的色谱条件下，WatersXselectHSST3柱(5μm，4.6×250mm)所出的色谱峰较多，峰型较好，基线也较为平整。8.1.3流速考察了流速为0.8ml/min、1ml/min与1.1ml/min时对各色谱峰分离效果的影响，最终选定1ml/min作为流动相流速。柱温会影响色谱峰的保留时间，其变化会使保留时间发生改变，从而会影响药材中各成分的分离效果与指纹图谱的相似度评价，故本实验考察了20℃、25℃、30℃的柱温对色谱峰分离效果的影响，结果表明在相同的色谱条件下，柱温为25℃时，色谱峰的分离效果最好。8.2提取方法本实验对不同提取溶剂(20%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、纯甲醇)、不同提取方法(加热回流提取、超声提取)及不同提取时间(15min、30min、45min)进行考察，本着以所得图谱中的色谱峰数目较多，提取效率高且提取方法稳定安全可行的原则，最终确定了20%甲醇作为提取溶剂，超声（700W,40KHz)30min作为提取方法。8.3实验结果的讨论本实验对16批白扁豆药材的指纹图谱进行数据分析，结果表明共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.07%，可作为白扁豆药材HPLC指纹图谱稳定的共有指纹峰。但共有峰的相对峰面积的RSD相差较大，而色谱图图形基本一致，应该是与产地、生长环境气候、贮藏条件等因素造成白扁豆药材中各成分含量比例不一有关。本实验运用相似度评价分析的方法，对16批不同产地的白扁豆药材HPLC指纹图谱进行分析。16批白扁豆药材中全部药材的指纹图谱的相似度在0.980以上，说明本实验所用的白扁豆药材质量比较稳定一致。从16批白扁豆药材的指纹图谱中确认了6个共有峰，指认了1个峰，说明本方法还不能较为全面地反映白扁豆的质量，只能为白扁豆药材的鉴别和质量控制提供一定的科学依据。结论本实验建立了精密度、稳定性和重复性良好的白扁豆药材HPLC指纹模型，通过相似度评价的分析方法评价了16批白扁豆药材的质量，通过比较确认了6个共有峰，指认了1个峰，可科学地鉴别白扁豆原药材的真伪以及可为白扁豆原药材质量控制及以白扁豆为主要原料药的中药制剂质量标准的拟定提供一定的参考依据。参考文献：[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2015版一部.北京:中国医药科技出版社,2015:110.[2]ksouriR,KsouriW,JallaliI,etal.Medicinalhalophytes:Potentsourceofhealthprimotingbiomoleculewithmedicalnutracceuticalandfoodapplications[J].Critrevbiotechnol,2012(32):289-326.[3]卫计委公布最新食药两用中药名单[J].中医临床研究,2017,9(24):11-14.[4]钱雄,邢燕如,张谨宜.张谨宜治疗小儿腹泻医案三则[J].浙江中医杂志,2017,52(02):142.[5]魏建平.治疗女性白带异常验方[J].中国民间疗法,2016,24(05):6.[6]佚名.10种食物是强效“除湿器”[J].安全与健康,2014(12):48.[7]王作卫,邓克新.合儿汤治疗小儿秋季腹泻38例临床体会[J].世界最新医学信息文摘,2015,15(50):103.[8]王霞芳.小儿腹泻顽疾的辨治[J].中医儿科杂志,2014,10(04):5-8.[9]文兴春,雷媛媛,李爱,高生.张小萍教授治疗功能性腹泻的经验总结[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(08):262+264.[10]文洽先,吕国强,张振勇,等.肠癌方联合化疗治疗晚期大肠癌的临床观察[J].实用医院临床杂志,2011,8(6):149-151．[11]石红乔.黄褐斑膏方调治体会[J].中医杂志,2011,52(11):972-973．[12]卢金清,蔡君龙,戴艺,等.白扁豆的研究进展[J].湖北中医杂志,2013,35(12):77-79.[13]YANGXW.Alkaloids[M].Beijing:ChemicalIndustyPress,2005．[14]武菲,付玉杰.葫芦巴碱在植物体内的生理功能[J].安徽农业科学,2012,40(10):5876-5878+5914.[15]胡国柱,姚于飞,文珠,等.白扁豆多糖对神经细胞缺氧性凋亡的保护[J].中药药理与临床,2012,28(1):91-94．[16]弓建红,许小华,王俊敏,等.白扁豆多糖对正常小鼠体内抗氧化和免疫实验研究[J].食品工业科技,2010,31(09):337-338．[17]陈志飘.白扁豆多糖防治酒精性肝病的实验研究[D].湖北民族学院,2017.[18]姚于飞,胡国柱,高幼奇,文珠.白扁豆多糖抗神经细胞缺氧性坏死与凋亡[J].中药药