子囊霉素产生菌的发酵条件优化

题 目：子囊霉素产生菌发酵条件的优化目录1材料与方法 41.1实验材料 41.1.1菌种与培养基 41.1.2实验试剂 51.1.3实验仪器与设备 61.2实验方法 61.2.1菌种的活化 61.2.2种子培养 61.2.3发酵液培养 61.2.4碳源对子囊霉素产生菌发酵产量的影响 61.2.5氮源对子囊霉素产生菌发酵产量的影响 61.2.6不同温度对子囊霉素产生菌发酵产量的影响 61.2.7不同接种量对子囊霉素产生菌发酵产量的影响 71.2.8发酵液的分离纯化 71.2.9HPLC色谱条件 72实验结果 72.1子囊霉素标准品的制备 72.2碳源对子囊霉素产生菌产量的影响 72.3氮源对子囊霉素产生菌产量的影响 82.4温度对子囊霉素产生菌产量的影响 92.5接种量对子囊霉素产生菌产量的影响 102.6最佳发酵条件稳定性试验 123结论 134讨论 13子囊霉素产生菌的发酵条件优化摘要目的：本研究为提高子囊霉素产生菌的产量，对其发酵条件进行优化。方法：利用单因素实验方法，探究碳源、氮源、接种量、发酵温度等因素对子吸水链霉菌ATCC14891发酵条件的影响，建立最佳发酵条件。结果：建立的最适发酵培养基：可溶性淀粉3%，大豆饼粉2.5%，蛋白胨0.3%，磷酸氢二钾0.1%，碳酸钙0.1%；最佳发酵条件：温度28℃，接种量10%，装液量20%，摇床转速200r/min，发酵时间6d。此时，子囊霉素的产量最高可达245.35781ug/mL。结论：优化后子囊霉素产生菌发酵水平比优化前提高了26.30%。关键词：子囊霉素，吸水链霉菌，发酵条件OptimizationoffermentationconditionsfortheproductionofascomycinAbstractObjective:Inordertoimprovetheyieldofascomycin-producingbacteria,weoptimizethefermentationconditions.Methods:Thesinglefactorexperimentmethodwasusedtoexploretheeffectsofcarbonsource,nitrogensource,inoculumsizeandfermentationtemperatureonthefermentationconditionsofStreptomyceshygroscopicusATCC14891,andEstablishingoptimalfermentationconditions.Result:Theoptimumfermentationmediumisasfollows:Solublestarch3%,soybeancakepowder2.5%,peptone0.3%,dipotassiumhydrogenphosphate0.1%,calciumcarbonate0.1%.Theoptimalfermentationconditionsareasfollows:Theconicalflaskwithtemperature28C,inoculation10%,liquidloading100mL/500mL,shakingspeed200r/min2,fermentationtime6days.Atthistime,thehighestproductionofascomycinwas245.35781ug/mL.conclusion:Thefermentationlevelofascomycin-producingbacteriaincreasedbyabout20%comparedwiththatbeforeoptimization.AfterrepeatedfermentationverificationtestresultsarestableKeywords:ascomycin,Streptomyceshygroscopicus,fermentationconditions

前言近现代以来，各种微生物及其代谢产物的发现以及对其进行的研究【1】，很大程度上帮助人们解决了各种严重的疾病，守护了人类的健康和生命。随着医学越来越进步，各种治疗手段也开始发展起来，其中，器官移植及免疫治疗就属于非常重要的类别[2]。由于存在免疫排异性[1]，器官移植存在一定的风险，寻找能治疗免疫排斥的药物就显得尤为紧急。目前，已经有许多从微生物中提取出来的大环内酯类免疫抑制药物运用于临床的器官移植和治疗自身免疫疾病，如环孢菌素A,雷帕霉素，他克莫司等[2]。子囊霉素（Ascomycin,子囊霉素），是一种从吸水链霉菌的发酵产物中分离得到的23元大环内酯类的化合物[3],它的结构与他克莫司类似，具有较高的免疫抑制活性，可被用于治疗系统性红斑狼疮、牛皮癣等免疫疾病[4-5]，也具有抗真菌[6]、抗痉挛[7]、抗疟疾[8]、神经保护与再生[9]等活性。其衍生物吡美莫司已被开发用于特应性皮炎的治疗[10]。当前，子囊霉素的获得主要是通过微生物发酵[11]。现已报道的生产菌株有三种：①吸水链霉菌亚种；②吸水链霉菌屋久岛亚种[12]；③杀结核链霉菌[13]，其中，以吸水链霉菌ATCC14891为子囊霉素生产菌种的代表，被广泛应用于各种子囊霉素的工业生产中。目前，关于子囊霉素产生菌的全部基因组还并不清楚[14]，目前仅报道的只有子囊霉素的生物合成基因簇[15]的相关报道。子囊霉素合成过程中的各种调控基因，重要酶类我们了解得比较少，因此想要通过基因工程来实现定向改造就十分的困难。所以在现阶段，子囊霉素产量的优化主要是培养基优化以及发酵条件优化.2007年Parveen[16]等优化了种子和发酵培养基，改变发酵罐中的发酵温度和通气量，并在发酵的过程中加入了一定量的糊精，加快了代谢产物的累积，使子囊霉素的产量达到了350mg/L。国内关于子囊霉素发酵的研究较国外更晚，但也有许多重要的成果。2008年，穆云龙[17]等通过自然筛选、诱变育种等一系列步骤之后，使子囊霉素的产量有了较大提高，其中的M-7-21菌株与原始菌株相比，产量提高了近4倍；他们还研究了子囊霉素菌株发酵过程中添加前体的浓度的影响。加入0.15%莽草酸对子囊霉素产量的提升最大，提高了大约27%，并对其最佳添加的时间进行了探索，最终使子囊霉素的产量达到了131.7mg/L。2012年，Qi[18-19]等通过激光和NTG诱变对出发菌株NT2-11进行诱变筛选，得到了高产菌株FS-35，使子囊霉素的产量提高了45%。2017年，余志拓[14]研究了树脂添加对子囊霉素产量的影响，在添加1.0%大孔吸附树脂时，子囊霉素产量提高最大达到了近30%。鉴于子囊霉素在实际生产中的生产率低，生产成本高。因此，开发子囊霉素不仅有着学术价值，也有着巨大的经济效益。本文利用前期筛选到的产子囊霉素的吸水链霉菌ATCC14891，利用单因素实验方法，探究碳源和氮源种类、接种量、发酵温度对子吸水链霉菌ATCC14891发酵产量的影响，建立最佳发酵条件，旨在提高其发酵水平，降低生产成本。1材料与方法1.1实验材料1.1.1菌种与培养基菌种：吸水链霉菌ATCC14891，保存于四川抗菌素工业研究所。关于实验用到的培养基，其配方如下：表1平板培养基成分培养基种类成分含量（g/L）平板培养基（pH7.0）可溶性淀粉酵母提取物三水磷酸氢二钾七水硫酸镁琼脂1040.50.520表2种子培养基成分培养基种类成分含量（g/L）种子培养基（pH7.0）玉米浆葡萄糖棉籽饼粉磷酸氢二钾8g10g3g1g表3发酵培养基成分培养基种类成分含量（g/L）发酵培养基（pH7.0）糊精黄豆粉蛋白胨磷酸氢二钾碳酸钙30g20g3g1g1g1.1.2实验试剂表4实验试剂药品纯度生产厂家磷酸酵母粉可溶性淀粉乙腈无水乙醇大豆蛋白胨酵母膏七水硫酸镁氯化钾六水氯化钴碳酸钙三水磷酸氢二钾环己甲酸小麦胚芽蛋白粉燕麦粉化学纯化学纯分析纯色谱纯化学纯化学纯化学纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯成都海骏化工有限公司武汉天惠生物工程有限公司武汉天惠生物工程有限公司上海迈瑞尔化学技术有限公司成都海骏化工有限公司武汉天惠生物工程有限公司武汉天惠生物工程有限公司国药集团化学试剂有限公司成都海骏化工有限公司国药集团化学试剂有限公司成都海骏化工有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司武汉天惠生物工程有限公司武汉天惠生物工程有限公司1.1.3实验仪器与设备表5实验所用仪器及设备仪器型号生产厂家超净工作台恒温摇床恒温培养箱pH仪高效液相色谱仪电子天平高压蒸汽灭菌锅离心机SW-CJ-VD650HNYC-100DZHS-150SCAT-6UltiMate3000GX-2000LDZN-80L-IIIKUBOTA2420上海康路仪器设备有限公司天津市欧诺仪器仪表股份有限公司上海喆图科学仪器有限公司上海禾工科学仪器有限公司赛默飞色谱及质谱德国上海禾工科学仪器有限公司广州瑞丰实验设备有限公司北京东迅天地医疗仪器有限公司1.2实验方法1.2.1菌种的活化从吸水链霉菌ATCC14891的甘油保藏管中刮一环，采用稀释涂布法涂布于平板分离培养基上，28℃，培养8d。再用接种环挑取平板上的单菌落，划线接种于斜面培养基，28℃，培养8d。1.2.2种子培养挖取部分带菌斜面接到装有20mL的种子培养基的锥形瓶中，28℃，200r/min振荡培养2d。1.2.3发酵液培养按照12%的接种量，吸取种子液4.8mL转入发酵培养基（共40mL）中，28℃，200r/min,震荡培养6d。1.2.4碳源对子囊霉素产生菌发酵产量的影响无碳源的发酵培养基中，分别添加3.0%的可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖和糊精作为碳源。将种子培养基充分混匀，按12%接种量将其接种到发酵瓶中，28℃，200r/min振荡培养6d后进行产物分析。1.2.5氮源对子囊霉素产生菌发酵产量的影响碳源为可溶性淀粉的发酵培养基中，分别添加2.5%的黄豆粉、酵母粉、玉米浆粉、蛋白胨作为氮源，将种子培养基充分混匀，按12%接种量将其接种到发酵瓶中，28℃，200r/min振荡培养6d后进行产物分析。1.2.6不同温度对子囊霉素产生菌发酵产量的影响在发酵过程中，温度的控制是非常重要的，温度的改变会影响酶的活性，从而影响产物的合成，在上述培养基的基础上，我们设置了26℃，28℃,30℃,32℃四个不同温度进行发酵，接种量均为12%，28℃，200r/min振荡培养6d后进行产物分析。1.2.7不同接种量对子囊霉素产生菌发酵产量的影响接种量大小对后续发酵有很大的影响，种子培养完成后充分振荡混匀，按6%，8%，10%,12%,14%的接种量，将种子液接种到培养基上，28℃，200r/min振荡培养6d后进行产物分析。1.2.8发酵液的分离纯化发酵液经纯化处理过后，取10mL发酵液，加入三倍体积的无水乙醇，充分振荡、静置、离心，取上清液过滤后进行HPLC检测。1.2.9HPLC色谱条件C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱以乙腈∶水=62∶38(V/V)为流动相(1L水+1mL磷酸)流速1.0mL·min－1柱温:60℃检测波长215nm。以子囊霉素标准品为对照品，实验组子囊霉素产量=样品峰面积/标准液峰面积×标准液浓度×稀释倍数。2实验结果2.1子囊霉素标准品的制备初始浓度为440ug/mL的子囊霉素标准品稀释4倍至浓度变为110ug/mL，取标准品10mL用于高效液相色谱仪进行色谱分析。得出结果如图1所示。在12.72min出现子囊霉素的色谱峰。峰面积（mAU*s）为2224.33。用子囊霉素标准品所得数据对后面实验组产量进行计算。图188ug/mL子囊霉素标准品的HPLC色谱图2.2碳源对子囊霉素产生菌产量的影响将分别添加3.0%的可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖和糊精进行发酵培养的四种发酵液纯化后，各取10mL进行HPLC分析，如图2所示，具体峰面积如表6所示。当碳源为可溶性淀粉时，子囊霉素的产量最高，为160.47ug/mL；当碳源为蔗糖时，子囊霉素产量为61.17ug/mL；当碳源为葡萄糖时，子囊霉素产量为132.89ug/mL；当碳源为糊精时，子囊霉素产量为135.75ug/mL，如图3。(注每个实验条件重复三次，最后实验数据取三次的平均值)图2碳源对子囊霉素产生菌产量的影响注：A、B、C、D依次为可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖和糊精表6HPLC色谱数据碳源类别峰面积（mAU*s）量（ug/mL）可溶性淀粉3244.98160.47蔗糖1236.9061.17葡萄糖2687.12132.89糊精2744.95135.75图3各碳源发酵的子囊霉素产量2.3氮源对子囊霉素产生菌产量的影响将分别添加2.5%的大豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆粉、鱼粉进行发酵培养的四种发酵液纯化后，各取10mL进行HPLC分析，如图4所示，具体峰面积如表7所示。当氮源为大豆饼粉时，子囊霉素的产量最高，为180.72ug/mL；当氮源为棉籽饼粉时，子囊霉素产量为130.98ug/mL；当氮源为玉米浆粉时，子囊霉素产量为131.17ug/mL；当氮源为鱼粉时，子囊霉素产量为108.06ug/mL，如图5。图4氮源对子囊霉素产生菌产量的影响注：A、B、C、D依次为大豆饼粉，棉籽饼粉，玉米浆粉，鱼粉表7HPLC色谱图数据氮源类别峰面积（mAU*s）量（ug/mL）大豆饼粉3654.35180.72棉籽饼粉2648.61130.98玉米浆粉2652.51131.17鱼粉2185.01108.06图5各氮源发酵的子囊霉素产量2.4温度对子囊霉素产生菌产量的影响将分别在26℃，28℃,30℃,32℃进行发酵培养的四种发酵液纯化后，各取10mL进行HPLC分析，如图6所示，具体峰面积如表8所示。当温度为26℃时，子囊霉素的产量为72.99ug/mL；当温度为28℃时，子囊霉素产量最高，为205.29ug/mL；当温度为30℃时，子囊霉素产量为172.76ug/mL；当温度为32℃时，子囊霉素产量为137.03ug/mL，如图7。图6温度对子囊霉素产生菌产量的影响注：从左到右，从上到下温度依次为26℃，28℃，30℃，32℃表8HPLC色谱图数据温度峰面积（mAU*s）量（ug/mL）26℃3498.04172.9928℃4151.21205.2930℃3493.32172.7632℃2770.95137.03图7各温度发酵的子囊霉素产量2.5接种量对子囊霉素产生菌产量的影响将接种量分别为6%、8%、10%、12%、14%的五种发酵液纯化后，各取10mL进行HPLC分析，如图8所示，具体峰面积如表9所示，当接种量为6%时，子囊霉素的产量为172.26ug/mL；当接种量为8%时，子囊霉素产量为186.67ug/mL；当接种量为10%时，子囊霉素产量最高，为225.55ug/mL；当接种量为14%时，子囊霉素产量为169.49ug/mL，如图9。图8接种量对子囊霉素产生菌产量的影响注：A、B、C、D、E依次为6%，8%，10%，12%，14%表9HPLC色谱图数据接种量峰面积（mAU*s）量（ug/mL）6%3483.30172.268%3774.60186.6710%4560.83225.5512%3897.88192.7614%3427.21169.49图9各接种量发酵的子囊霉素产量2.6最佳发酵条件稳定性试验三组添加3%的可溶性淀粉，2.5%大豆饼粉，接种量为10%，在28℃进行发酵，各取10mL进行HPLC分析，如图10所示，具体峰面积如表10所示。在此条件下，子囊霉素的产量最高可达245.35781ug/mL，如图11.图10相同条件下发酵所得图谱表10HPLC色谱图数据序号峰面积（mAU*s）量（ug/mL）A4560.46225.53B4961.43245.36C3795.81187.71图11各组发酵的子囊霉素产量3结论我国虽然是抗生素发酵的原料大国，但国内的发酵单位普遍较低，主要表现在菌种本身的产量不高、发酵工艺落后、发酵设备仪器跟国外的差距过大。所以如何提高抗生素发酵水平是我国现在面临的重大问题。由于时间及设备的限制，通过对子囊霉素产生菌的发酵条件进行优化，探究碳源，氮源，接种量，培养温度对发酵产量的影响。最终确定最适发酵培养基为：可溶性淀粉3%，大豆饼粉2.5%，蛋白胨0.3%，磷酸氢二钾0.1%，碳酸钙0.1%。最佳发酵条件为：温度为28℃，接种量为10%，装液量100mL/500mL锥形瓶，摇床转速200r/min，发酵时间为6d。此时，子囊霉素的产量最高可达245.36ug/mL，比优化前的产量194.27ug/ml提升了26.30%。4讨论本研究通过单因素改变来优化发酵培养基组成和发酵参数，筛选获得了吸水链霉菌ATCC14891的适宜发酵条件，使其发酵水平提高了约20%，经多批次发酵验证试验结果稳定，若应用到工业化生产，将会较大的降低生产成本，增强市场竞争力。由于实验时间的限制，只做了相对简单的单因素实验，其中还有很多的不足，为继续对子囊霉素产量进行提高，在本文的研究基础上，后续的实验考虑对以下几个部分进行深入研究：对发酵培养基做进一步的碳氮源的正交优化培养基碳氮源组成的优化：根据上述实验，选择可溶性淀粉、大豆饼粉作为发酵培养基碳氮源组成，采用正交设计考察培养基中碳氮源成分对产子囊霉素的影响，进一步研究碳氮源之间的交互作用。根据正交设计助手软件分析，按极差R值大小，确定2因素对生物合成子囊霉素影响的主次顺序；在利用微生物进行生物合成的过程中，菌种是最关键的一环，也是整个发酵生产的基础。目前，由于FK520产生菌的全基因组未知，对其基因操作的分子手段比较局限，相关的基因改造也鲜有报道。而传统的诱变选育恰恰可以避开这些难点，在对其代谢通路、基因调控等机制不明的情况下，利用诱变剂进行随机突变，从而提高FK520的发酵单位。但是由于随机突变的不定向性，又缺少直观的筛选标记，导致筛菌的工作量大大增加。在微生物的生物合成过程中，作为蛋白质合成场所的核糖体结构，深刻影响着菌体的生长和代谢过程。微生物次级代谢产物的积累与相关合成基因的表达息息相关，而基因的表达又完全依赖于核糖体的功能。基于核糖体在微生物次级代谢产物合成过程中的重要作用，2000年，Kozo等首次提出了核糖体工程（RibosomeEngineering）的概念，即通过改造或修饰核糖体结构，使其发生某种特异性的突变，从而激发细胞自身的潜能，促进次生代谢产物的大量表达，获得核糖体发生突变的高产菌株。利用一些能够作用核糖体的抗生素，如：链霉素、庆大霉素、利福平等对核糖体进行诱变，从而获得对抗生素产生抗性的微生物，该菌株的核糖体结构发生了抗性突变，对其蛋白质合成能力以及代谢调控都会产生一定的影响，因而利用微生物的各类抗性突变为筛选标记，就能高效筛选得到次生代谢产物合成能力提高的突变株。本研究期望通过建立合适的链霉素抗性筛选模型筛选得到FK520的高产抗性突变株。在子囊霉素的提取方面，寻找更优的提取方法，考虑用多种有机溶剂进行提取。通过构建高精度、子囊霉素代谢网络的模型，采用适当的研究方法，对子囊霉素的整个代谢途径进行分析，确定子囊霉素合成的各个步骤以及关键的靶点，从而可以对子囊霉素产生菌进行基因工程改造，定向的提高产量。

致谢时间如白驹过隙，一转眼，我已临近毕业。回首大学时光，不禁思绪万千。初入校园的青涩与懵懂，经过四年的磨砺，使我变得坚毅并勇于探索。每次的失败都是成功的垫脚石，让我不断攀登知识的高峰，而每一次成功都是极大的激励。但人的成长，不可能是孤独的，在这里，我想向那些陪伴我，激励我的人表示感谢。首先，我要衷心地感谢我的两位导师林家富老师和王丹老师，，本研究的选题，实验方案的设计，实验数据的分析处理到论文的撰写与修订，都是在两位老师的悉心指导下完成的，导师们知识的渊博，治学态度的严谨，都给我留下了深刻的印象。并将使我受益终身。感谢师兄师姐以及我的全班同学，感谢他们在我生活和学习上提供的帮助。

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子囊霉素的发现及其研究摘要：子囊霉素作为大环内脂类的免疫抑制剂，在自身免疫疾病的治疗以及器官移植中抗排斥反应方面具有显著的作用，有关子囊霉素的生物研究有巨大的药用价值和市场价值。对子囊霉素的理化性质和免疫抑制活性以及发酵法生产子囊霉素等方面进行了综述，同时结合系统生物学和合成生物学对子囊霉素的发展趋势进行了展望。关键词:子囊霉素，生物合成，发酵近现代以来，各种微生物及其代谢产物的发现以及对其进行的研究，很大程度上帮助人们解决了各种严重的疾病，守护了人类的健康和生命。随着医学越来越进步，各种治疗手段也开始发展起来，其中，器官移植及免疫治疗就属于非常重要的类别。由于存在免疫排异性，器官移植存在一定的风险，寻找能治疗免疫排斥的药物就显得尤为紧急。目前，已经有许多从微生物中提取出来的大环内酯类免疫抑制药物运用于临床的器官移植和治疗自身免疫疾病，如环孢菌素A,雷帕霉素，他克莫司等[1]。子囊霉素（Ascomycin,子囊霉素），是一种从吸水链霉菌的发酵产物中分离得到的23元大环内酯类的化合物,它的结构与他克莫司类似，具有较高的免疫抑制活性，可被用于治疗系统性红斑狼疮、牛皮癣等免疫疾病[1]。也具有抗真菌、抗痉挛、抗疟疾神经保护与再生[2]等活性。其衍生物吡美莫司已被开发用于特应性皮炎的治疗[3]。现在子囊霉素在实际生产中的生产率低，生产成本高，对其发酵条件进行优化，提高其发酵水平，降低生产成本具有非常重要的实际意义.1子囊霉素的发现及开发子囊霉素首先在1962年，由日本的制药公司从一种吸水链霉菌的代谢产物中分离得到[5]，然后被收录在美国保藏中心。最初子囊霉素只是用于抗真菌，随着对链霉菌的不断开发。首先发现了他克莫司对T细胞有抑制作用，人们就开始对其结构类似物子囊霉素进行深入研究。直到1990年，子囊霉素被报道具有抑制T细胞的免疫活性。后面又进行了子囊霉素的纯化及其生物合成过程的研究。2001年，子囊霉素的一种重要衍生物——吡美莫司（Pimecrolimus,商品名为Elidel）上市，被广泛用于治疗特应性皮炎、湿疹等免疫炎症[6]。2子囊霉素的结构及其理化性质子囊霉素是一种含氮的二十三元大环内酯类化合物，在水中的溶解度非常小，但极易溶于有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚等[7]。其外观呈现无定型白色粉末状，相对分子量为792.02，化学结构式为C43H69NO12,需要在-20℃冷冻保藏。子囊霉素、他克莫司、雷帕霉素都是属于大环内酯类的抗生素，他们之间的化学结构相似[8]，如图1.1所示：这三种抗生素具有相同的哌啶环，并且都由类似的4-羟基-3-甲氧环己基侧链组成;其中子囊霉素和他克莫司的唯一一个差别就在于，子囊霉素的C21位是一个乙基官能团，而他克莫司则是一个烯丙基侧链。另外，在子囊霉素的C21位上还存在着一个甲基的取代，形成的FK523是子囊霉素发酵生产中的主要杂质，由于子囊霉素和FK523的化学性质十分相近，一般的色谱都难以将两者完全分开，给后面的分离纯化带来了极大的困难[9]。图1.1子囊霉素、他克莫司、雷帕霉素和FK523的化学结构式3子囊霉素的生物活性3.1子囊霉素的抗真菌活性子囊霉素在其最开始被发现时，就是作为一种抑制真菌的抗生素的身份出现的。据研究表明，子囊霉素的抗菌活性主要如表1.1所示：几乎不存在抑制作用的有念珠菌、酵母菌；不完全抑制的有青霉菌、曲霉菌等[10]。与一般的抗真菌药物作用机制不同，子囊霉素是通过与细胞中的作用靶点结合，即真菌的FKBPs，从而发挥其抗真菌作用[11].表1.1子囊霉素抗真菌活性测定菌最小抑菌浓度Candidaalbicans7NCandidaalbicansIFM40001CandidaguilliermondiiCandidakuruseiSaccharomycescerevisiaePenicilliumexpansumPenicilliumchrysogenumAspergillusflavusAspergillusOryzaeAspergillusNigerSporothrixshenckiiTrichophytonmentagrophytes>100>100100>100>100>100>100(50)a50(0.2)a50(0.2)a100(50)a>100100(50)a注：a表示不完全抑制3.2子囊霉素的免疫抑制活性最早人们并没有发现子囊霉素作为免疫抑制剂的功效。直到后面他克莫司被发现能够作免疫抑制剂。子囊霉素身为他克莫司的结构类似物，又重新成为了科研热点。由于两者的化学结构极其相似，所以他们的性质和药理作用也很相近，都可以通过选择性的抑制T细胞，从而阻断了相关炎症因子的形成，进而抑制人体的免疫排斥反应[12]。据研究[13]，子囊霉素的结构中包含了两个活性结构域，如图1.2所示：C15-C21是能与钙调磷酸酶结合从而发挥抑制作用的效应区，C24-C10部分是能与免疫亲和蛋白-12结合的结合区。子囊霉素作为一种钙调磷酸酶抑制剂，它能首先与免疫亲和蛋白相互作用，形成FK免疫蛋白[14]。然后FK免疫蛋白进一步与作用靶点钙调磷酸酶相结合，形成的三元复合体，能够抑制钙调磷酸酶的脱磷酸化，降低其活性。从而减少了相关免疫炎症因子的分泌和表达。其中，子囊霉素对白介素-2的抑制效果比CsA强了10多倍，而白介素-2主要是促进T细胞的增值分化[15]，所以子囊霉素具有非常好的抑制效果。此外，还有研究发现，子囊霉素可以通过阻断白介素-8的合成，从而抑制自身的免疫排斥作用[16]。图1.2子囊霉素的活性结构域4子囊霉素的衍生物临床研究发现，子囊霉素的免疫抑制活性和它的生理毒性成一定的相关性，出现了一些不良反应，使子囊霉素的应用受到了很大的限制。为了开发子囊霉素使它既能维持其原有的免疫活性，又能使不良反应效果降低，就开始了对其衍生物的研究。要实现这一点，只能从其结构入手。改变某些理化性质，降低不良反应。在子囊霉素的结构中，不能改变他的两大活性结构域，结合区与效应区的改变，都会影响它的免疫抑制作用。所以必须通过改变其他位的结构来降低不良反应，从而获得具有更优效果的新化合物。这也是目前非常有效的一条改造途径。4.1吡美莫司吡美莫司是子囊霉素的C32氯代衍生物，是一种很成功的衍生物改造药物，它的作用机制和子囊霉素一样，主要是和免疫亲和蛋白-12结合，抑制了钙调磷酸酶的活性，进而阻断炎症细胞因子的合成，治疗免疫炎症。吡美莫司引起的全身性免疫应答和的副作用较子囊霉素更小[17]。氯的取代，使得吡美莫司的亲脂性比子囊霉素更好，更容易与皮肤结合，且不会伤害皮肤，避免造成皮肤萎缩、老化等[18]，因此其常应用于治疗特应性皮炎以及皮肤移植引起的免疫排斥反应。4.2三乙酰-L-鼠李糖取代的子囊霉素辉瑞公司曾经用三乙酰-L-鼠李糖来取代子囊霉素中C32上的羟基，得到了子囊霉素第一个改良衍生物[19]。与子囊霉素相比，C32-三乙酰-L-鼠李糖-子囊霉素对神经系统的副作用更小。在导致同等程度不良反应的情况下，C32-三乙酰-L-鼠李糖-子囊霉素的免疫抑制活性是子囊霉素的5倍左右。这表明了研究子囊霉素衍生物是能够提高其安全用药范围的。5子囊霉素的发酵生产的研究现状5.1发酵产量当前，子囊霉素的获得主要是通过微生物发酵[20]。现已报道的生产菌株有三种：①吸水链霉菌亚种②吸水链霉菌屋久岛亚种[21]③杀结核链霉菌[22]，其中，以吸水链霉菌ATCC14891为子囊霉素生产菌种的代表，被广泛应用于各种子囊霉素的工业生产中。关于子囊霉素产生菌的全部基因组还并不清楚，目前仅报道的只有子囊霉素的生物合成基因簇。子囊霉素合成过程中的各种调控基因，重要酶类我们了解得比较少，因此想要通过基因工程来实现定向改造就十分的困难。现阶段，子囊霉素产量的优化主要有诱变选育突变菌株、培养基优化[23]以及控制发酵条件.2007年Parveen等[24]优化了种子和发酵培养基，改变发酵罐中的发酵温度和通气量，并在发酵的过程中加入了一定量的糊精，加快了代谢产物的累积，使子囊霉素的产量达到了350mg/l。国内关于子囊霉素发酵的研究较国外更晚，但也有许多重要的成果。2008年，穆云龙等[25]通过自然筛选、诱变育种等一系列步骤之后，使子囊霉素的产量有了较大提高，其中的M-7-21菌株与原始菌株相比，产量提高了近4倍；后面还研究了子囊霉素菌株发酵过程中添加前体的浓度的影响。加入0.15%莽草酸对子囊霉素产量的提升最大，提高了大约27%，并对其最佳添加的时间进行了探索，最终使子囊霉素的产量达到了131.7mg/l。2012年，Qi等[26]通过激光和NTG诱变对出发菌株NT2-11进行诱变筛选，得到了高产菌株FS-35，使子囊霉素的产量提高了45%。2017年，余志拓[27]研究了树脂添加对子囊霉素产量的影响，在添加1.0%大孔吸附树脂时，子囊霉素产量提高最大达到了近30%。5.2子囊霉素的提取方法子囊霉素系胞内抗生素,因此对其进行发酵单位检测时必须将细胞破碎,使产物得以释放,才能进一步提取和分析。所以,细胞破碎是提取胞内产物和测定其含量的关键步骤,提取方式是否得当,直接影响到产品含量的测定。进年来报导的细胞破碎方法有化学试剂法、高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎法、反复冻融法、融酶法等。由于子囊霉素与他克莫司的结构相似可以参考他克莫司的提取工艺[28]。主要过程是首先发酵液通过硅藻土得菌丝饼,然后用丙酮萃取,萃取液和滤液合并过树脂柱,分别用丙酮、50%丙酮和75%丙酮洗脱。含有他克莫司洗脱段减压旋蒸,残渣乙酸乙酷提取三次,合并减压旋蒸,得油状固体。油状固体过硅胶柱,洗脱剂分别为正己烷、乙酸乙酷正己烷混合液和乙酸乙酷。含有他克莫司部分再重新过硅胶柱两次,洗脱剂同上。收集含有他克莫司部分浓缩得白色粉末即为他克莫司粗品。5.3子囊霉素的分析方法取适量发酵液，加入3倍体积无水乙醇，充分振荡，然后静置、离心，取上清液，过滤后进行HPLC检测。色谱条件：C18(4.6*250mm，5μm)色谱柱；流动相：乙腈（62%）+水（38%）(1L水+1ml磷酸）；流速：1.0ml/min；柱温：60℃；检测波长：215nm。用子囊霉素标准品作为对照品，根据样品峰面积/标准峰面积*标准液浓度*稀释倍数来计算效价。6结论通过对大量资料的整理分析，加深了对子囊霉素的了解，对进行与子囊霉素研究相关的实验提供了很好的帮助。为降低子囊霉素昂贵的市场价格，提高其较低的发酵水平，奠定了一定的基础，降低生产成本，促进工业化生产的进步。参考文献[1]余志拓.子囊霉素菌种选育及发酵工艺优化[D].上海医药工业研究院,2017.[2]王德森,张祝兰,任林英,唐文力,杨煌建,张引,连云阳.吸水链霉菌FIM-38-24产子囊霉素的发酵条件优化[J].海峡药学,2017,29(09):25-28.[3]NghiemP,PearsonG,LangleyRG.Tacrolimusandpimecrolimus:fromcleverprokaryotestoinhibitingcalcineurinandtreatingatopicdermatitis[J].JAmAcadDermatol,2002,46(2):228-241.[4]TadashiA.Ascomycinandprocessforitsproduction:US,3244592[P].1966-4-5.[5]TadashiA.Ascomycinandprocessforitsproduction:US,3244592[P].1966-4-5.[6]刘菲,魏继福,孟玲等.大环内酯类免疫抑制剂的研究进展[J].药学与临床研究,2014,1(19):61-66.[7]宋柯璟，齐海山，闻建平．子囊霉素生物合成的研究进展[J]．化学工业与工程，2016，33(6)：88-94．[8]DandanC,PeilinC,WenL,etal.ProgressinStudyingtheBiosyntheticMechanismofthe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