紫花地丁细菌性斑点病的病原菌鉴定

ADDINCNKISM.UserStyle紫花地丁细菌性斑点病的病原菌鉴定摘要：紫花地丁细菌性斑点病是2019年进行病害调查时发现的一种病害，为了确定该病的病原菌，为病害防治和规范化生产提供一定的理论依据。通过病原菌的培养特性、烟草过敏性坏死反应、生理生化测定和致病性实验初步确定病原菌的种类。结果表明：病原菌在NA培养基上生长较慢，直径2-3mm，圆形，透明，蜡状，扁平，边缘啮齿状，菌落产生黄绿色色素；革兰氏染色反应为阴性；具有烟草过敏性反应；7%盐浓度下可生长，41℃下可生长，可以利用葡萄糖、木糖和甘露糖，在PH为5.7和6.8的培养基上可以生长，代谢产生色氨酸酶、酪氨酸酶和过氧化氢酶，可以利用柠檬酸盐，为好氧型细菌；致病性试验表明具有致病性。由实验可知zhdd为紫花地丁细菌性叶斑病的病原菌。关键词：紫花地丁；病原菌；生理生化；致病性Abstract:Bacterialspotdiseaseofviolayedoensisisakindofdiseasefoundin2019.Inordertodeterminethepathogenofthedisease,andprovidesatheoreticalbasisfordiseasecontrolandstandardizedproduction.Throughtheculturecharacteristicsofpathogens,allergicnecrosisreaction,physiologicalandbiochemicaltestsandpathogenicityexperimentspreliminarydeterminethetypesofpathogens.TheresultsshowedthatthepathogengrewslowlyontheNAmedium,withadiameterof2-3mm,round,transparent,waxy,flat,margindentate,colonyproducingyellow-greenpigment;Gram'stainreactionwasnegative;hadtobaccoallergicreaction;couldgrowat7%saltconcentration,couldgrowat41℃,coulduseglucose,xyloseandmannose,couldgrowonmediumwithPHof5.7and6.8,Producetryptophanase,tyrosinaseandcatalasefrommetabolize,andcouldusecitrate,Isakindofaerobicbacteria;pathogenicitytestshowedpathogenicity.Accordingtotheexperiment,zhddwasthepathogenofbacterialleafspotofviolayedoensis.Keywords:Violayedoensis;Pathogen;PhysiologyandBiochemistry;Pathogenicity紫花地丁（ViolayedoensisMakino）是堇菜科（Violaceae）的干燥全草[1]。又称地丁，明末清初，李中立ADDINCNKISM.Ref.{6768D0C083904fc4B029475F2151DC5B}《本草原始·草部下》地丁条云：“花开有紫、白二种。根直如钉，入药用紫花者，故俗呼为紫花地丁”[2]。以全草入药，性寒味微苦，有清热解毒的功效[3]。目前，已从紫花地丁中分离得到70多种化合物，研究表明，紫花地丁在抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤方面有广泛的作用[4]。所含黄酮苷类及有机酸对金色葡萄球菌、猪巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌等都有较强的抑菌作用[5]，素有“解毒草”之称。主要分布在我国除青海、西藏以外的地方[6]。紫花地丁喜阳，在湿润或寒冷阴郁的天气都能生长，对土质要求不高，有很强的适应能力，能自播繁殖[7]。紫花地丁花色艳丽，花期长[8]，效益好，繁殖能力强[9]，在园林绿地和景观绿化中能发挥强大的作用[10]。经查阅文献，没有发现对紫花地丁的病害记载。通过本实验，目的是确定致使紫花地丁发生细菌性斑点病的病原菌。1材料与方法1.1病害调查图1图1紫花地丁症状物1.2病原菌分离和纯化[11]将实验用具置于高压蒸汽灭菌中以115℃的条件灭菌30min备用。选择有病斑的叶片，剪取病斑后加入0.1%的升汞将病斑浸没消毒2min，然后用灭菌水冲洗3次，再用玻璃棒将病斑捣碎，用接种环沾取组织液，用平板划线的方法将其接种在NA培养基上，置于25℃的恒温培养箱中培养，24h后观察菌落的生长情况，挑取分离得到的单菌落用平板划线的方法接种在NA培养基上，放在25℃的恒温培养箱中培养24h进行纯化，之后在4℃的冰箱中保存备用。1.3病原菌的形态鉴定将保存的细菌重新活化后接种在NA培养基上培养，24h后对单菌落的形态、大小、颜色和质地等进行观察。同时挑取活化的单菌落放在干净的载玻片上，滴加灭菌水将细菌涂成薄层，使细菌固定在载玻片上，滴加结晶紫初染1min，用蒸馏水冲洗后滴加碘液媒染1min，用蒸馏水冲洗后，再用95％的酒精脱色30s，最后滴加番红复染1min，晾干后放在油镜下观察其颜色及形态[12]。1.4烟草过敏性反应采集烟草叶片插在三角瓶中，加入蒸馏水，放在25℃的光照培养箱中。将保存的细菌重新接种在NA培养基上活化24h后，加入适量的灭菌水配置成细菌悬浮液，吸取菌悬液注射在烟草叶片的细胞间，以无菌水为对照，置于25℃的光照培养箱中培养，每隔2h观察记录一次发病情况，直至48h[13]。1.5生理生化鉴定方法[14-15]生理生化实验主要有：耐盐性实验、糖醇发酵类实验、生长PH的测定、吲哚实验、柠檬酸盐的利用实验、明胶液化实验、酪朊水解实验、酪氨酸水解实验、V-P测定实验、接触酶实验、淀粉水解实验、卵磷脂酶实验、苯丙氨酸脱氨酶实验、甲基红实验、厌氧实验、生长温度测定等试验，实验方法主要参照《植物病害研究方法》和《常见细菌系统鉴定手册》。1.6紫花地丁上致病性测定[16-17]选择新鲜健康的紫花地丁植株，放在25℃的光照培养箱中备用。将菌种重新接种在NA培养基上活化24h后加入适当的灭菌水配置成细菌悬浮液，选择未感病的紫花地丁植株作供试材料。针刺接种：将昆虫针在酒精灯上灼烧灭菌后沾取菌悬液在紫花地丁上以针刺的方法接种，对照沾取灭菌水针刺在紫花地丁的叶片上。喷雾接种：将菌悬液装入喷壶中喷洒在紫花地丁的叶片上，对照喷洒灭菌水在叶片上。将处理和对照放在保温保湿的环境中培养，48h后揭开箱子观察记录植株表现的症状。2结果与分析2.1病原细菌分离和纯化经过分离共获得了1株细菌，记为zhdd。菌落菌落在培养基上生长较慢，直径2-3mm，圆形，透明，蜡状，扁平，边缘啮齿状，菌落产生黄绿色色素。（如图2）2.2病原菌的革兰氏染色反应将活化24h的单菌落用革兰氏染色剂经过初染、媒染、脱色和复染四个步骤后，放在油镜下观察，发现zhdd为红色杆状的细菌，所以zhdd是革兰氏阴性菌。（见图3）图2zhdd单菌落图图2zhdd单菌落图图3zhdd革兰氏染色反应图3zhdd革兰氏染色反应图2zhdd单菌落图2.3烟草过敏性反应将zhdd菌悬液接种在烟草叶片上，放在光照培养箱中恒温培养，在第6h即出现较小的过敏性坏死斑点，斑点呈褐色，并在之后的观察中逐渐扩大，对照的烟草没有在叶片上出现任何斑点（如图4）。图4烟草过敏性坏死图图4烟草过敏性坏死图2.4生理生化测定zhdd的各项生理生化测定结果如下。（如表1）耐盐性实验中，在盐浓度为2％、5％和7％时为阳性，说明细菌可以在2％、5％和7％的盐环境下生长；在10％的耐盐性实验中阴性，说明细菌不能在10％的盐环境下生长。糖醇发酵类实验均为阳性，说明细菌在进行生命活动时可以利用葡萄糖、木糖和甘露糖。生长PH值测定在PH为5.7和6.8的培养基中均为阳性，说明细菌在PH为5.7和6.8的环境中可以正常生长。吲哚实验为阳性说明细菌代谢产生色氨酸酶，可以分解蛋白胨中的色氨酸。柠檬酸盐利用实验为阳性说明细菌可以将柠檬酸钠作为碳源被利用。酪氨酸水解实验为阳性说明细菌在进行生命活动时可以产生酪氨酸水解酶。V-P测定为阳性说明细菌能分解葡萄糖产生乙酰甲基甲醇。接触酶实验为阳性说明细菌可以产生过氧化氢酶。淀粉水解为阴性说明细菌不能产生分解大分子淀粉的水解酶。卵磷脂酶实验中，细菌不能正常生长说明细菌不能利用该培养基提供的营养。苯丙氨酸脱氨酶实验为阳性说明细菌可以分解氨基酸产生苯丙氨酸脱氨酶。甲基红实验为阳性说明细菌可以分解葡萄糖产生丙酮酸。厌氧实验为阳性说明中细菌仅能在培养基表面生长。生长温度实验为阳性说明细菌在41℃下可以进行正常的生命活动。表1.紫花地丁生理生化表测定项目实验组对照组耐盐性实验（2％）＋－耐盐性实验（5％）＋－耐盐性实验（7％）＋－耐盐性实验（10％）－－糖醇发酵类实验（葡萄糖）＋－糖醇发酵类实验（木糖）＋－糖醇发酵类实验（甘露糖）＋－生长PH测定（5.7）＋－生长PH测定（6.8）＋－吲哚实验＋－柠檬酸盐利用实验＋－酪朊水解实验＋－酪氨酸水解实验＋－V-P测定＋－接触酶实验＋－淀粉水解实验－－卵磷脂酶实验细菌不生长苯丙氨酸脱氨酶实验＋－甲基红实验＋－厌氧实验＋生长温度测定（41℃）＋注：“＋”表示反应为阳性，“－”表示反应为阴性。卵磷脂酶实验中细菌不能在培养基上生长。2.5紫花地丁上的致病性测定图5.紫花地丁针刺处理图将zhdd的菌悬液接种后图5.紫花地丁针刺处理图3结论与讨论从紫花地丁的感病植株上经过分离和纯化共得到一种细菌，经过细菌的形态观察发现zhdd是红色杆状的革兰氏阴性菌。经过zhdd的烟草过敏性坏死反应，发现烟草叶片上出现病斑，说明zhdd对烟草有致病性。将zhdd接种在新鲜健康的紫花地丁上，以针刺接种的紫花地丁在叶片上出现水渍状淡褐色病斑，有发病的症状。实验结果表明zhdd对紫花地丁有致病性。为了确定紫花地丁侵染性病害的病原物，应该进行完整的柯赫氏法则，即对致病性测定中以针刺处理的紫花地丁感病株再次进行分离和纯化，观察其特征与原病原生物是否相同[18]。对于病原菌的鉴定除了形态学和生理生化测定以外，还需要进行分子生物学的鉴定，例如建立在PCR技术基础上的16S-rDNA基因的的直接测序法，是细菌分类鉴定的主要方法之一，可以通过比较细菌的16S-rDNA基因序列间的同源性，构建细菌属间和种间的系统发育树来探索他们的进化关系[19]。参考文献：[1]中国药典.一部[S].2015:337[2]周驰,张启伟,常章富.紫花地丁的本草考证[J].中国中药杂志,2010,35(22):3086-3088.[3]毛晓霞,苗光新,于海龙,等.紫花地丁的研究进展[J].承德医学院学报,2010,27（03）:302-305.[4]李永生,何希瑞,杨燕,等.紫花地丁化学成分与药理活性研究新进展[J].环球中医药,2013,6(04):313-318.[5]张兵锋.紫花地丁的研究进展[J].宜春学院学报,2008(02):88-90.[6]孙彬,屈爱桃.紫花地丁研究进展[J].内蒙古中医药,2008(11):50-51.[7]许小静.紫花地丁的栽培技术与推广应用[J].北京农业,2015(20):95-96.[16]程家玉,张晶.紫花地丁人工栽培丰产技术及推广应用[J].中国林副特产2007,(04):73-79.[9]丁百林.果园生草可选用紫花地丁[J].西北园艺(果树),2013(03):51.[10]赵金鹏,张亚菲,张玲.野生紫花地丁的人工栽培技术研究及在高校校园利用价值评价[J].南方农业,2019,13(20):45-47.[11]余磊,秦西云,杜静,等.云南烟草上1种新的细菌性病害病原鉴定[J].植物病理学报,2009,39(03):243-248.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[15]东秀珠,蔡妙英.常见细