第四章 酶工程制药教案

第四章酶工程制药

教学目的

掌握：酶工程的概念

熟悉：固定化酶、固定化菌体的定义和特点

教学重点

固定化酶

计划学时：4

酶工程制药是生物制药的主要技术之一，主要包括药用酶的生产和酶法制药两方面的技术。

药用酶是指可用于预防和治疗疾病的酶。

酶法制药是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效物质的技术过程。主要包括酶的催化反应、

酶的固定化、酶的非水相催化等。

第一节概述

酶是生物催化剂。

所有生物体在一定条件下都可以合成多种多样的酶。生物体内的各种生化反应，几乎都是在酶的

催化作用下进行的，所以酶对于生物体的新陈代谢是至关重要的。

一、酶的催化特性

酶是生物催化剂，具有催化剂的共同性质，即可以加快化学反应的速度，但不改变反应的平衡点。

1酶的专一性强

2酶的催化效率高

3酶的作用条件温和

二、影响酶催化作用的主要因素

(-)底物浓度对酶催化反应的影响

酶催化反应的底物即酶所作用的物质。根据参与反应的底物数量的不同，可分为单底物反应和多

底物反应。

单底物反应只有一种底物发生变化。水解酶催化的水解反应有水参与，但由于水的量很大，可视

为其浓度是恒定不变的，也属于单底物反应。

多底物反应是有两个或多个底物参与的反应。其底物浓度对反应速度的影响较为复杂，根据底物

与酶的结合顺序，可分别用有序机制(Orderedbibimechanism)＞随机机制(Randombibimechanism)和乒

乓机制(Ping-pangbibimechanism)解释。

1单底物反应中底物浓度对酶促反应速度的影响

从图4—1可以看到，在底物浓度较低的情况下，反应速度与底物浓度成正比。

当底物达到一定浓度时，反应速度的上升不再与底物浓度的增加成正比，而逐步达到一个极限值

(最大反应速度丫山)。

1902年，Henri根据图4—1的结果，提出中间产物学说。

E+S昌ES冬E+P(4-1)

K；

1913年，Michaelis和Menten提出快速平衡(Rapidequilibrium)理论，运用数学方法推导出米

氏方程。其推导过程基于下列三点假设：

(1)所测定的酶促反应速度为反应的初速度。在反应刚开始的一段时间内，产物的量很少，因

此由P十E逆反应生成ES的可能性可不予考虑。

(2)底物浓度［S］大大超过酶的浓度［E］,ES的生成对底物浓度没有明显的影响，可用起始的底

物浓度［S］进行计算。

(3)酶和底物结合生成中间产物ES的速度显著大于ES生成产物的速度。即在反应开始后，E

+S=ES快速达到平衡，ES生成产物的速度不足以破坏这个平衡。

根据上述三点假设，推导出米氏方程：

忏皆看?2)

式中V—反应速度

Vm-最大反应速度

Ks—ES解离常数，&=跖'/跖

［S］一底物浓度

1925年，Briggs和Haldene认为，当K2>K「时，快速平衡理论不一定能够成立，他们考虑了更有普遍

性的酶催化反应式：

E+S裳ES占E+P

K\K；

提出稳态(Steadystate)理论，认为测定反应初速度的过程中，底物浓度电不断减少，产物浓度［P］不断

增加，而中间复合物的浓度［ES］在一开始增高以后，可在相当一段时间内保持平衡，称之为稳态，即

ES的生成速度与消耗速度相等，达到动态平衡，称之为稳态。

,UtnESj

斤所以二冗+⑹

尸1/2%时，/=［印。即米氏常数等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。这两个式子均

称为米氏常数。

2多底物反应中底物浓度对酶催化反应速度的影响

现以双底物反应为例分述如下：

(1)有序机制(Orderedbibimechanism)此类反应中，底物与酶的结合严格地按顺序进行，即酶先与底

物A结合，然后再与底物B结合，反应后底物的释放也按规定顺序进行，即先释放产物P、再释放产

物Q。

⑵随机机制(Randombibimechanism)此类反应中，酶与底物结合的先后是随机的，可以先A后B,

也可以先B后A,反应后产物的释放先后也是随机的。

(3)乒乓机制(Pingpongbibimechanism)此类反应中，酶先与底物A结合，释放出产物P以后，再

与另一底物B结合，放出产物Q,并释放出游离酶E。底物与产物交替进出，就像打乒乓球一样.故

称为乒乓机制。

（-）酶浓度对催化反应速度的影响

在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。其反应速度方程为:

dLSJ5一

v==K\_E1

dZ

（三）温度对酶催化反应速度的影响

反应速度的温度效应常以温度系数Qio表示,Qio是指在其他条件相同的情况下,温度升高10℃时,

反应速度增加的倍数。对于一般化学反应，Qi°=l〜2。当温度超过一定界限时，酶的活力会受到影响，

甚至引起变性而丧失其催化活性。

酶的最适反应温度与反应时间的长短有关，一般反应时间延长，最适温度会有所降低。

（四）pH值对酶催化反应的影响

只有在有效pH范围内，酶才显示其催化活性，在最适pH条件下，酶催化反应的速度最大。

pH值之所以影响酶的催化作用，主要是由于在不同的pH条件下，酶分子和底物分子的解离状态

不同，从而影响酶促反应的进行。

（五）抑制剂对酶催化反应的影响

凡是能够使酶的催化活性降低或丧失的物质称为酶的抑制剂。抑制剂可与酶催化作用的必需基团

结合，影响酶的结构和性质，从而降低酶催化反应的速度。

根据抑制剂与酶相结合的情况，抑制作用可分为不可逆抑制和可逆抑制两种类型。

不可逆抑制剂对酶的抑制程度随抑制剂浓度的增加和抑制时间的延长而增大。

可逆抑制剂与酶的结合是可逆的。可以用透析、超滤等方法将抑制剂除去，而使酶的催化活性恢

复的抑制作用称为可逆抑制。可逆抑制又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。

1.竞争性抑制

抑制剂和底物竞相与酶分子结合而引起的抑制作用称为竞争性抑制。

2.非竞争性抑制

在非竞争性抑制中，酶分子可在不同的位点上分别与抑制剂和底物结合形成各自的复合物EI或

ES,也可生成三元复合物EIS。

3.反竞争性抑制

在反竞争性抑制中，底物与酶分子结合生成中间复合物ESB,抑制剂再与中间复合物结合生成

EIS三元复合物。

（六）激活剂对酶催化反应速度的影响

能够增加酶的催化活性的物质称为激活剂。常见的激活剂有Ca2+、Mg?*、Co2\Zn2\Mi?+等金

属离子和cr等无机负离子。

三、酶的分类与命名

根据国际酶学委员会的建议，每种具体的酶都有其推荐名和系统命名。

酶的推荐名，是在惯用名称的基础上，加以选择和稍加修改而成。一般由两部分组成：（1）底物

的名称，（2）催化反应的类型后面加一个“酶”字（一ase）。例如，葡萄糖氧化酶，表明该酶作用底物

是葡萄糖，所催化的反应类型属于氧化反应。对于水解酶类，催化反应的类型为水解反应，在命名时

可省去“水解”字样。有时还在底物名称前面在加上酶的来源，如胰蛋白酶。

系统命名包括了酶催化作用的底物，酶作用的基团以及催化反应的类型。

系统命名法根据酶所催化的反应类型，将酶分成六大类。即：

第1类，氧化还原酶；第2类，转移酶；第3类，水解酶；第4类，裂合酶；第5类，异构酶；

第6类,连接酶(或称合成酶)。

每一种酶都有其一定的系统编号，系统编号采用四码编号方法，每个号码之间用圆点(.)分开。第

一个号码表示该酶属于六大类中的某一类，第二个号码表示属于该类中的某一亚类，第三个号码表示

属于该亚类中的某一小类，第四个号码表示这一具体的酶在该小类中的序号。有关详细内容，请参看

有关'酶的分类与命名'的书籍或资料。

四、酶活力的测定

1酶活力测定方法

酶活力测定包括两个阶段。首先要在一定条件下，将酶与其作用底物混合均匀，反应一段时间，

然后再测定反应液中底物或产物变化的量。一般采用如下步骤：

(1)根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配置成一定浓度的底物溶液。

(2)确定酶催化反应的温度、pH值等条件。

(3)在一定的条件下，将一定量的酶液与一定量的底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。

(4)反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种适合的生化检测技术，测定产物的生成量或

底物的减少量。

终止酶反应的方法：

①反应时间一到，立即取出一定量的反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活。

②立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活。

③立即加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离酶促反应的最适pH值，从而终止反应。

④将取出的反应液立即置于冰粒堆或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低到10℃以下。

2酶活力单位

1961年，国际生物化学联合会规定：在特定的条件下(温度可采用25℃或其他选用温度，pH等条

件均采用最适条件)，每分钟催化gmol底物转化为产物的酶量，定义为1个酶活力单位。这个单位称

为酶的国际单位(IU)。

酶的比活力是指酶制剂中，每1mg蛋白质所具有的某种酶的活力单位数。即：

酶比活力=酶活力(u)/蛋白质质量(mg)

第二节药用酶的生产

1药用酶具有治疗和预防疾病功效的酶称为药用酶。

2药用酶的生产方法

(1)提取法

运用各种生化分离技术，从动物、植物、微生物等的含酶细胞、组织或器官中提取、分离和纯化各

种药用酶的方法称为提取法。例如，从动物胃中提取分离胃蛋白酶；从动物胰脏中提取胰蛋白酶、胰

淀粉酶、胰脂肪酶，或这些酶的混合制剂胰酶；从动物血液中提取超氧化物歧化酶(SOD)等。

(2)生物合成法

生物合成法是利用各种动物、植物和微生物细胞的生命活动而获得人们所需的酶。主要是利用微

生物细胞进行生产。例如，用枯草芽泡杆菌生产淀粉酶，用大肠杆菌生产青霉素酰化酶。

(3)化学合成法

由于酶的化学合成要求作为单体底物的各种氨基酸达到很高的纯度，合成的成本高昂，而且只能

合成那些已搞清化学结构的酶，这就使化学合成法受到限制，至今仍停留在实验室阶段。

酶生物合成及其调节理论

（一）酶的生物合成

1RNA的生物合成一转录

某种细胞能否合成某种酶分子，首先取决于细胞中的遗传信息载体一DNA分子中是否存在有该酶

所对应的基因。

DNA分子可以通过复制生成新的DNA,再通过转录生成对应的RNA,然后再翻译成为多肽链，

经加工而成为具有完整空间结构的酶分子。

转录是以DNA为模板，以核甘三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA的

过程。按其结构和功能不同，可分为mRNA,tRNA和rRNA。

2蛋白质的生物合成一翻译

以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多

肽链的过程，称为翻译。

新合成的肽链释放出来后，还需经过加工才能形成完整空间结构的酶或蛋白质。

（-）酶生物合成的调节

酶的生物合成要经过一系列的步骡，需要诸多因素的参与。故此，在转录和翻译过程中，许多因

素都会影响酶的生物合成。有关研究表明，至少在原核生物中，甚至在所有生物中，转录水平的调节

控制对酶的生物合成是至为重要的。转录水平的调节控制，又称为基因的调节控制。

基因对酶生物合成的调节控制方式：

1分解代谢物阻遏作用

分解代谢物阻遏画是指容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。例如，葡

萄糖阻遏止半乳糖昔酶的生物合成，果糖阻遏a-淀粉酶的生物合成等。

2酶生物合成的诱导作用

加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程，称为|酶生物合成的诱导作用（简称为诱

导作用。起诱导作用的物质，称为诱导剂。例如，乳糖诱导夕-乳糖甘酶的合成，淀粉诱导如淀粉酶的

合成等。

3酶生物合成的反馈阻遏作用

又称为产物阻遏作用，指的是酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受阻的过

程。引起反馈阻遏的物质，称为共阻遏物。

二药用酶生产细胞的选择

（一）用于酶发酵生产细胞需具备的条件

（1）酶的产量高；（2）容易培养和管理；（3）产酶稳定性好;（4）利于酶的分离纯化。（5）安全可靠。

（二）常用产酶微生物

1枯草芽泡杆菌

芽抱杆菌属细菌。可用于生产a-淀粉酶、蛋白酶、P-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。

2大肠杆菌

可生产多种酶，一般都属于抱内酶，需经过细胞破碎才能分离得到。如谷氨酸脱竣酶、天冬氨酸

酶、苇青霉素酰化酶、限制性核酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶。

3黑曲霉曲霉属黑曲霉群霉菌

糖化酶、a-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、过氧化氢酶等。

4米曲霉曲霉属黄曲霉群霉菌

可用于生产糖化酶、蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶Pi、果胶酶等。

5青霉青霉属半知菌纲。

青霉菌分布广泛，种类很多。其中产黄青霉用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶（主要

作用于青霉素V）、果胶酶、纤维素酶Cx等；橘青霉用于生产5，一磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧

化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶Si、核酸酶Pi。

6木霉属于半知菌纲。

是生产纤维素酶的重要菌株。此外，木霉中含有较强的17a-羟化酶，常用于留体转化。

7根霉

用于生产糖化酶、⑺淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半

纤维素酶等。根霉有强的17a-羟化酶，是用于幽体转化的重要菌株。

9链霉菌是一种放线菌，形成分支的菌丝体。

链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、

中性蛋白酶、几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16d-羟化酶，可用于密体转化。

10啤酒酵母

用于转化酶、丙酮酸脱竣酶、醇脱氢酶等的生产。

11假丝酵母

假丝酵母是单细胞蛋白的主要生产菌。在酶工程方面可用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊索酶、转

化酶、醇脱氢酶。假丝酵母具有较强的17—羟基化酶，可用于留体转化制造睾丸素等。

12植物细胞

植物细胞培养生产次级代谢物的研究是20世纪80年代才发展起来的新技术。首无从植物的外植

体根、茎、叶、花、果实、种子等）中诱导得到愈伤组织，再经筛选、诱变、原生质体融合、基因重组

等技术选育得到优良的产酶细胞。然后在反应器中如同微生物那样进行培养而得到各种所需的酶。例

如用大蒜细胞生产超氧化物歧化酶，用木瓜细胞生产木瓜蛋白酶，用菠萝细胞生产菠萝蛋白酶等。

三提高药用酶产量的措施

在酶的发酵生产过程中，为了提高酶产量，除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条件并根据需

要和变化情况及时加以调节控制以外，还可以采取某些行之有效的措施，诸如添加诱导物、控制阻遏

物浓度、添加表面活性剂或其他产酶促进剂等。

1添加诱导物

对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。例如乳糖诱

导半乳糖昔酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕楣酸酯诱导蔗糖酶等。

诱导物一般分为三类：酶的作用底物、酶的反应产物、酶的底物类似物。

2控制阻遏物浓度

有些酶的生物合成受到阻遏物的阻遏作用。阻遏作用有产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。阻遏物

可以是酶催化反应产物，代谢途径的末端产物以及分解代谢物（葡萄糖等容易利用的碳源）。

控制阻遏物浓度是解除阻遏，提高酶产量的有效措施。

3添加表面活性剂

表面活性剂可分为离子型和非离子型两大类。离子型表面活性剂又有阳离子型、阴离子型和两性

离子型之别。

由于离子型表面活性剂有些对细胞有毒害作用，特别像季镀型离子表面活性剂（如“新洁而灭”等）

是消毒剂，不能用于酶的发酵生产。

非离子型表面活性剂，如：吐温（Tween）、特里顿（Triton）等，可积聚在细胞膜上，增加细胞的通透

性，有利于酶的分泌，所以可增加酶的产量。例如，在霉菌发酵生产纤维素酶的培养基中，添加1%的

吐温，可使产酶量提高1〜20倍。要注意表面活性剂添加量应控制在最佳浓度范围内。此外，添加表

面活性剂有利于提高某些酶的稳定性和催化能力。

4添加刺激剂

在植物细胞培养生产次级代谢物的过程中，添加某些刺激剂，往往可以显著提高次级代谢物的产

量。

刺激剂主要有真菌的细胞壁碎片或其有效成分、微生物胞外酶及一些小分子物质等。例如，在大

蒜细胞培养液中添加LOu/mL果胶酶，使SOD的产最提高27%。

5添加产酶促进剂

产酶促进剂|是指可以促进产酶,但作用机理并未阐明清楚的物质。添加产酶促进剂往往对提高酶

产量有显著效果；例如，添加植酸钙镁可使霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的产量提高1〜20倍。

四药用酶的分子修饰

通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程，称为酶分子修

饰。

1金属离子置换修饰

通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。

在离子置换修饰的过程中，首先要加入一定量的乙二胺四乙酸(EDTA)等金属螯合物到酶液中，使

酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物，此时酶成为无活性状态。通过透析或超滤、分子筛层析等

方法，可将EDTA-金属螯合物从酶液中分离除去。然后用不同的金属离子加到酶液中，酶蛋白与金属

离子结合。根据离子种类的不同，经离子置换后的酶将会出现不同的特性。

2大分子结合修饰

利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的

方法称为大分子结合修饰法，简称为|大分子结吾族。

通常使用的水溶性大分子修饰剂有右旋糖酎、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物(Ficoll)、聚氨基酸

等。这些大分子在使用前，一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分子以共价键结合，对酶分子进

行修饰。经过此法修饰的酶可显著提高酶活力，增加稳定性或降低抗原性。

3肽链有限水解修饰

酶的催化功能主要决定于酶的活性中心的构象，活性中心部位的肽段对酶的催化作用是必不可少

的，而活性中心以外的肽段起到维持酶的空间构象的作用。

酶蛋白的肽链被水解以后，将可能出现以下3种情况的一种。若肽链水解后引起酶活性中心的破

坏，则酶将失去其催化功能；若将肽链的一部分水解后，仍可维持其活性中心的完整构象，则酶的活

力仍可保持或损失不多；若肽链的一部分水解除去以后，有利于活性中心与底物的结合并形成准确的

催化部位的话，则酶可显示出其催化功能或使酶活力提高。在后两种情况下，肽链的水解在限定的肽

键上进行，称为肽链有限水解。

利用肽链的有限水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，

称为肽链有限水解修饰。

4酶蛋白侧链基团修饰

酶蛋白侧链基团就是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。这些功能团主要有氨基、竣基、筑

基、咪嚏基、酚羟基、羟基、胭基、甲硫基等。这些基团可组成各种副键，对于蛋白质空间结构的形

成和稳定起着重要作用。如果这些功能团发生改变，就会引起副键的改变，使空间结构发生某些改变,

从而引起酶的特性和功能的改变。

常用的小分子侧链基团修饰剂：

(1)氨基修饰剂凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物，称为氨基修饰剂。主要有二硝基

氟苯、醋酸酎、琥珀酸酎、二硫化碳、亚硝酸、乙亚胺甲酯、O-甲基异胭、顺丁烯二酸酎等。

(2)竣基修饰剂可与酶蛋白侧链上的竣基反应的小分子化合物称为竣基修饰剂、竣基修饰剂可使

竣基酯化、酰基化或结合生成其他物质，改变酶蛋白的空间构象，从而改变酶的某些特性与功能。如

乙醇一盐酸试剂，水溶性的碳化二亚胺、异嗯唾盐等。

(3)服基修饰剂精氨酸含有胭基。服基可与二液基化合物缩合生成稳定的杂环。所以二翔基化合

物，如环已二酮、乙二醛、苯乙二醛等，都可以用做胭基修饰剂。

(4)筑基修饰剂蛋白质的半胱氨酸残基侧链中含有毓基。

常用的疏基修饰剂有二硫苏糖醇、毓基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠等还原剂以及各种酰化剂、

烷基化剂等。

(5)酚基修饰剂蛋白质的酪氨酸残基上含有酚基。修饰酚基的主要方法有碘化法、硝化法和琥珀

酰化法等。经酚基修饰剂修饰后，酶分子由于引入负电荷，因而增加了对带正电荷的底物的结合力，

有利于酶催化功能的发挥。

(6)分子内交联剂用含有双功能团的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，与酶分子内

两个侧链基团反应，在分子内共价交联，可使酶分子空间构象更加稳定，从而也使酶的催化稳定性增

加。

5氨基酸置换修饰

酶蛋白是由各种氨基酸通过肽键连结而成的。在特定位置上的各种氨基酸是酶的化学结构和空间

结构的基础。若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则会引起酶蛋白空间构象的某些改变，

从而改变酶的某些特性和功能，这种修饰方法称为氨基酸置换修饰。

6物理修饰

通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称

为物理修饰。

物理修饰的特点在于不改变酶的组分和基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理方法的

作用下，副键发生某些变化和重排。

酶分子空间构象的改变还可在某些变性剂的作用下，先使酶原有空间构象破坏；然后在不同的条

件下，使酶分子重新构建新的构象。

五、酶在疾病预防和治疗方面的应用

酶作为药物可以预防和治疗多种疾病，而且具有疗效显著、副作用小等待点。其应用越来越广泛

(P290表4—2)。

第三节药物的酶法生产

利用酶的催化作用，将前体物质转化为有用药物的过程称为药物的酶法生产。

一酶的选择与反应条件的优化

在药物的酶法生产过程中，首先要根据下列几点选择好适当的前体物(原料)、酶及其反应条件。

(1)根据欲制造的药物的结构特点，选择好原料、反应步骤及所使用的酶或酶系。

(2)根据药物的用途和要求，选择的酶需经过一定步骤进行纯化，以达到产品的要求，

(3)根据酶的反应动力学特点，确定并优化反应的工艺条件，包括底物浓度、酶浓度、温度、pH值、

激活剂的浓度等。

(4)要求前体物质达到一定的纯度要求并廉价易得，以提高产品质量，降低生产成本。

二酶和菌体固定化

固定化酶是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。

固定化菌体(固定化死细胞)：采用含酶菌体或菌体碎片进行固定化，直接应用菌体或菌体碎片中的酶

或酶系进行催化反应。

(-)酶和菌体固定化的方法

1吸附法

利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称

为吸附法。

物理吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石

等。

优点：操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用。

缺点：结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落。

2包埋法

将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。

包埋法制备固定化酶或固定化菌体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜

包埋法两大类。

(1)凝胶包埋法凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定

化酶或固定化菌体。

常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交

联树脂等合成凝胶。

(2)半透膜包埋法半透膜包埋法是将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。

常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。

半透膜包埋法适用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化。例如胭酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、

过氧化氢酶等。

3结合法

选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。

(1)离子键结合法通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。

离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维

素、DEAE-葡聚糖凝胶等。

制备方法：在一定的pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液

缓慢地流过处理好的离子交换柱，就可使酶结合在离子交换剂上，制备得到固定化酶。

(2)共价键结合法通过共价健将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。

共价键结合法所采用的载体主要有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、

甲基丙烯酸共聚物等。

酶分子中可以形成共价键的基团主要有氨基、竣基、筑基、羟基、酚基和咪哇基等。

要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进某一活泼基

团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。

使载体活化的方法主要有重氮法、叠氮法、浪化氤法和烷化法等。

4交联法

借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联

法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。

常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酎、双偶氮苯等。

5热处理法

将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处

理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化。

(―)固定化酶的性质

1稳定性

固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表现在：对热的稳定性提高，可以耐受较高的

温度；保存稳定性好；对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解；对变性剂的耐受性提高。

2最适温度

固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有些会有较明显的变化。

固定化酶作用的最适温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响。

3最适pH值

酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。

影响因素：

(1)载体性质对最适pH值的影响

一般说来，用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH值比游离酶的最适pH值为高(即向碱

性一侧移动)；用带正电荷载体制备的固定化酶的最适pH值比游离酶的最适pH值为低(即向酸性一侧

移动)；而用不带电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH值一般不改变。

(2)产物性质对最适pH值的影响

一般说来，催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH值要比游离酶的最适pH值高一些；产

物为碱性时，固定化酶的最适pH值要比游离酶的最适pH值低一些；产物为中性时，最适pH值一般

不改变。这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应产物向外扩散受到一定的限制所造成的。

4底物特异性

固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。对

于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化。例如氨基酰化酶、葡萄糖氧

化酶、葡萄糖异构酶等。而对于那些可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶而言，固定化

酶的底物特异性往往会发生变化。固定在竣甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变,

而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3%左右。

固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使大分

子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不

受影响，故与游离酶的作用没有显著不同。

(三)固定化酶的应用

1固定化酶的优点：

(1)酶的稳定性增加，减少温度、pH值、有机溶剂和其他外界因素对酶活力的影响，可以较长期

地保持较高的酶活力。

(2)固定化酶可反复使用或连续使用较长的时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。

(3)固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。

2工业化生产的固定化酶

(1)氨基酰化酶用DEAE—葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，用于拆分D,L-乙

酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。

(2)固定化青霉素酰化酶用于合成新的具有不同侧链基团的青霉素或头抱霉素。

此外，还有葡萄糖异构酶、天冬氨酸酶、延胡索酸酶、卅半乳糖甘酶、天冬氨酸脱竣酶。

三酶的非水相催化

1非水相催化反应体系特点：

(1)提高非极性底物和产物的溶解度，从而提高反应速度。

(2)可催化水解反应的逆反应，而合成多肽、酯类等化合物。

(3)有利于反应后酶与产物的分离。

(4)解除或减少某些产物对酶的抑制作用.

(5)提高酶的稳定性。

2非水相催化反应体系

酶的非水相催化反应体系与常规的水相催化反应体系的主要差别在于催化反应介质的不同。一般

可分为微水相体系、反胶团体系、水-水溶性有机溶剂体系和水-水不溶性有机溶剂体系等四种。

不管何种体系，非水相催化反应的介质中都含有较多的有机溶剂和一定量的水。

(1)在非水相催化反应中，有机溶剂对反应主要有三方面的影响：

A有机溶剂影响反应过程中底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应速度。

B有机溶别影响酶分子微环境的水化层，从而影响酶的催化作用。

C有机溶剂影响酶蛋白的空间结构，对酶的催化活性起抑制作用或使酶失活。

常用的有机溶剂有辛烷、正己烷、苯、叱咤、季丁醇、丙醇、己酯、二氯甲烷等。

(2)非水相催化反应介质中，水也是不可缺少的成分之一：

A酶蛋白分子需要一层水化层，才可维持其催化活性。

B水的含量影响到催化反应的化学平衡和反应速度。

C水的含量与有机溶剂的种类以及酶分子的结构和性质有密切关系。

3酶在非水相介质中的催化特性

(1)底物特异性

在非水相介质中，由于酶分子结构发生变化，