疫苗菌毒种培育工工艺作业技术规程

疫苗菌毒种培育工工艺作业技术规程文件名称：疫苗菌毒种培育工工艺作业技术规程编制部门：综合办公室编制时间：2025年类别：两级管理标准编号：审核人：版本记录：第一版批准人：一、总则

本规程适用于疫苗菌毒种培育工艺作业过程中的技术规范，包括菌毒种的筛选、保存、繁殖、纯化等环节。规程要求参与人员具备相应的专业知识，严格遵守操作规程，确保菌毒种的纯度和稳定性，为疫苗生产提供合格的菌毒种原料。同时，操作过程中应注重环境保护和生物安全。

二、技术准备

1.技术条件：

-操作人员应经过专业培训，具备菌毒种培育的相关知识和技能。

-工作环境应满足无菌操作要求，包括温度、湿度、洁净度等。

-实验室应配备必要的生物安全柜、超净工作台、显微镜、离心机、培养箱等设备。

-使用的水质应符合GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》。

2.设备校验：

-生物安全柜、超净工作台等无菌操作设备应定期进行无菌检测，确保其性能符合操作要求。

-培养箱、离心机等关键设备应进行性能校验，确保其温度、转速等参数准确可靠。

-水浴锅、电子天平等辅助设备应定期进行校准，确保其测量精度。

3.材料准备：

-菌种来源：选用经过鉴定和验证的菌种，确保其纯度和活力。

-培养基：按照GB/T604.1-2002《微生物培养基通用试验方法》制备培养基，并确保其无菌性。

-抗生素：选用对目标菌种有效的抗生素，并按照规定浓度添加。

-其他试剂：根据实验需求准备必要的试剂，如指示剂、缓冲液等。

4.参数设置：

-培养温度：根据菌种特性，设定适宜的培养温度，通常在25-37℃之间。

-培养时间：根据菌种生长曲线，确定适宜的培养时间，一般为24-48小时。

-液体培养基的pH值：根据菌种需求，调整培养基的pH值，通常在6.5-7.5之间。

-培养基浓度：根据实验目的，调整培养基的浓度，确保菌种能够正常生长。

5.实验室安全管理：

-操作人员应穿戴合适的防护服、手套、口罩等个人防护用品。

-实验室内禁止吸烟、饮食和化妆，防止交叉污染。

-严格按照生物安全操作规程进行操作，防止菌种逃逸和感染。

-定期对实验室进行消毒处理，确保实验环境的安全。

6.文档记录：

-操作人员应详细记录实验过程，包括菌种名称、培养基成分、操作步骤、观察结果等。

-实验记录应清晰、完整，便于后续分析和追溯。

三、技术操作程序

1.菌种复苏与纯化

-将保存的菌种从冻存管中取出，置于37℃水浴中复温30分钟。

-使用无菌接种环取适量菌种，接种于适宜的培养基平板上。

-将平板置于37℃培养箱中培养24-48小时，观察菌落生长情况。

-挑选单菌落进行纯化，重复接种直至获得纯菌。

2.菌种扩大培养

-将纯化后的菌种接种于液体培养基中，置于摇床或培养箱中培养。

-根据菌种生长曲线，调整培养温度和转速，确保菌种正常生长。

-观察菌液浊度，当浊度达到预设标准时，终止培养。

3.菌种纯度检测

-从扩大培养的菌液中取适量样品，进行涂布平板法检测。

-将涂布后的平板置于37℃培养箱中培养24-48小时，观察菌落形态。

-对菌落进行分类，确认菌种纯度。

4.菌种保存

-将纯化后的菌种接种于冻存培养基中，置于-80℃冰箱中保存。

-定期对冻存菌种进行复苏和纯化，确保菌种活力。

5.操作顺序与注意事项

-操作前，确保实验室内环境符合无菌要求。

-按照无菌操作规程进行操作，避免交叉污染。

-操作过程中，严格遵循无菌技术，如使用无菌器械、消毒双手等。

-操作顺序：复苏→纯化→扩大培养→纯度检测→保存。

6.技术方法

-使用无菌操作技术进行菌种接种、培养和保存。

-根据菌种特性，选择合适的培养基和培养条件。

-利用显微镜观察菌落形态，判断菌种纯度。

7.故障处理

-若菌种生长缓慢或停止生长，检查培养基、温度、pH值等条件，排除故障。

-若出现污染，立即停止操作，对污染源进行消毒处理，并对设备进行清洗和消毒。

-若菌种活力下降，重新复苏纯化，确保菌种活力。

-若出现意外情况，立即向相关人员报告，并采取相应措施处理。

四、设备技术状态

1.技术参数标准

-生物安全柜：确保无菌操作区风速符合ISO14644-1标准，风速均匀分布，无死角。

-超净工作台：风速应符合ISO14644-1标准，工作区风速应稳定在0.45m/s，无涡流。

-培养箱：温度控制精度应在±0.5℃，湿度控制精度应在±5%。

-离心机：转速精度应在±1%，运行平稳，无异常振动。

-显微镜：放大倍数应准确，调焦系统应灵敏，图像清晰。

-水浴锅：温度控制精度应在±0.5℃，温度稳定，无泄漏。

-电子天平：称量精度应符合GB/T8170标准，读数稳定，操作简便。

2.异常状态识别

-生物安全柜：风速不稳定、气流方向异常、报警灯亮等。

-超净工作台：风速异常、工作区污染、报警灯亮等。

-培养箱：温度波动大、湿度异常、设备故障等。

-离心机：转速不稳定、震动过大、报警灯亮等。

-显微镜：放大倍数不准确、调焦困难、图像模糊等。

-水浴锅：温度不稳定、泄漏、操作面板故障等。

-电子天平：读数不准确、故障代码显示等。

3.状态检测方法

-定期进行设备性能测试，如生物安全柜的风速测试、超净工作台的风速和压力测试等。

-使用校准仪器对设备进行校准，如温度计、压力计等。

-通过目视检查和听觉检查来识别设备是否有明显的物理损伤或异常声音。

-运行过程中，记录设备的工作参数，如温度、湿度、转速等，并与标准值进行对比。

-对设备进行定期维护和保养，如更换空气过滤器、清洁设备表面等。

4.维护与保养

-设备应按照制造商的维护指南进行定期保养。

-操作人员应接受专业培训，了解设备的维护保养知识。

-设备的维护保养记录应详细记录，包括保养日期、保养内容、保养人员等信息。

-发现设备异常时，应立即停止使用，并通知维修人员进行检查和维修。

5.状态报告

-定期对设备的技术状态进行评估，并形成状态报告。

-状态报告应包括设备名称、型号、检测日期、检测结果、维护保养情况等。

-状态报告应提交给相关部门，以便进行设备管理和决策。

五、技术测试与校准

1.测试方法

-生物安全柜测试：使用风速仪测量无菌操作区的风速，确保其符合ISO14644-1标准。

-超净工作台测试：使用风速计和压力计，检查风速和压力是否稳定，工作区风速是否符合要求。

-培养箱测试：使用温度计和湿度计，检测培养箱的温度和湿度控制是否符合设定标准。

-离心机测试：使用转速计和振动计，验证离心机的转速和运行时的振动是否在规定范围内。

-显微镜测试：通过目测和图像质量检查，确保显微镜的放大倍数和调焦性能符合要求。

-水浴锅测试：使用温度计，检查水浴锅的温度控制是否准确。

-电子天平测试：使用标准砝码，校准电子天平的称量精度。

2.校准标准

-生物安全柜、超净工作台、培养箱、离心机等设备的校准应符合ISO17025标准。

-显微镜的校准应符合制造商的技术规范。

-水浴锅的校准应符合GB/T8170标准。

-电子天平的校准应符合GB/T8170标准。

3.结果处理

-测试和校准的结果应详细记录，包括测试日期、测试人员、测试设备和测试方法。

-对于不符合标准的设备，应立即停止使用，并采取措施进行维修或更换。

-对于测试和校准中发现的任何异常，应分析原因，并制定相应的纠正和预防措施。

-结果记录应保存至少五年，以便于未来的审计和追溯。

-定期对测试和校准结果进行审查，确保设备始终处于良好的技术状态。

4.校准周期

-生物安全柜、超净工作台、培养箱、离心机等设备的校准周期应根据制造商的推荐和使用频率来确定，通常为6个月至1年。

-显微镜、水浴锅和电子天平的校准周期也应根据制造商的推荐和使用频率来确定，通常为1年。

5.校准机构

-选择具有资质的校准机构进行设备的校准，确保校准结果的准确性和可靠性。

-校准机构的资质应经过认证，并符合国家相关法规和标准。

六、技术操作姿势

1.操作姿态

-站立时，双脚与肩同宽，保持身体平衡。

-腰部挺直，避免长时间低头或弯腰，以减少腰背负担。

-臂部自然下垂，肘部微曲，避免过度伸展。

-头部保持正直，视线水平，避免颈部过度前倾或后仰。

-操作时，手腕放松，避免长时间重复性动作导致的腕部疲劳。

2.移动范围

-操作台周围留有足够的空间，便于操作者移动和取用物品。

-移动时，使用正确的步伐，避免突然转身或跳跃，以防跌倒或扭伤。

-避免长时间站立或坐姿，适时调整位置，减少疲劳。

3.休息安排

-每工作45-60分钟后，应至少休息5-10分钟，进行身体放松和眼部休息。

-休息时，可进行轻微的伸展运动，如颈部、肩部、腰部和下肢的伸展。

-休息区域应舒适，避免在嘈杂或通风不良的环境中休息。

4.环境调节

-工作环境应保持适宜的温度和湿度，避免过热或过冷。

-确保良好的照明，避免眼睛疲劳。

5.安全防护

-操作过程中，穿戴适当的个人防护装备，如防护服、手套、眼镜等。

-使用安全工具和设备，如防滑鞋、防静电手环等。

-遵守实验室的安全规定，避免接触有害物质和生物危害。

6.姿势调整

-定期检查和调整操作姿势，确保身体舒适，避免长时间保持同一姿势导致的肌肉紧张。

-对于需要长时间操作的设备，如显微镜、电脑等，应调整高度和距离，以适应操作者的身体条件。

7.培训与监督

-新员工应接受专业培训，学习正确的操作姿势和安全规范。

-定期对操作者进行姿势和操作的监督，确保规范执行。

七、技术注意事项

1.技术要点

-确保所有操作均遵循无菌技术原则，避免污染。

-在进行菌毒种操作前，应仔细阅读相关文献和操作手册，了解菌种特性和安全注意事项。

-操作过程中，应保持实验室环境的清洁和整洁，定期进行消毒。

-使用设备前，应确保其处于正常工作状态，并按照操作规程进行操作。

-对于特殊试剂和化学品，应严格按照说明书进行使用，注意个人防护。

2.避免的错误

-避免在操作过程中随意离开实验台，防止操作中断或污染。

-避免在操作过程中交谈或分心，确保操作准确无误。

-避免使用未经消毒的物品接触菌种或培养基。

-避免在操作过程中直接接触菌种或培养基，应使用无菌器械。

-避免在实验室内进食、饮水或吸烟，以防交叉污染。

3.必须遵守的纪律

-严格遵守实验室安全规程，如穿戴防护服、手套、口罩等。

-未经允许，不得将实验室内物品带出实验室。

-不得随意更改实验设备或操作流程。

-实验室内禁止使用手机等电子设备，以免干扰实验操作。

-实验室内禁止进行与实验无关的活动，如大声喧哗、打闹等。

-实验结束后，应清理实验台，确保所有用品归位，并做好记录。

4.数据记录与报告

-操作过程中，应详细记录实验数据，包括时间、温度、压力、观察结果等。

-实验数据应真实、准确，不得篡改或伪造。

-实验报告应完整、规范，包括实验目的、方法、结果和讨论。

5.应急处理

-了解并熟悉实验室内的应急设备和使用方法，如灭火器、急救箱等。

-发生意外情况时，应立即停止操作，并按照应急预案进行处理。

-确保所有人员了解紧急疏散路线和集合点。

6.持续学习与改进

-操作人员应不断学习新技术、新方法，提高自身技能水平。

-定期对实验流程和操作规范进行审查，发现不足及时改进。

八、作业收尾处理

1.数据记录

-完成操作后，应立即对实验数据进行整理和记录，确保数据的准确性和完整性。

-数据记录应包括实验目的、方法、结果、观察现象以及任何异常情况。

-数据记录应使用规范化的格式，便于查阅和分析。

2.设备状态确认

-使用完毕后，应检查所有设备是否处于正常工作状态，如有异常，应立即报告并采取措施。

-清洁并整理实验设备，确保下次使用时设备能够正常运行。

-对设备进行必要的维护和保养，如更换耗材、校准仪器等。

3.资料整理

-将实验记录、数据报告、操作手册等相关资料整理归档，确保资料的安全和便于检索。

-实验记录和报告应按照实验室规定的时间段进行归档，并确保归档资料的安全保密。

4.实验室清洁

-清理实验台，移除所有实验用品，确保工作区域干净整洁。

-清洁实验设备，去除残留物和污染物，使用适当的清洁剂和消毒剂。

-检查实验室废物处理是否符合规定，确保有害废物得到正确处理。

5.安全检查

-确认所有实验操作都已安全结束，所有实验用品都已妥善存放。

-关闭所有不必要的电源和水源，确保实验室安全。

6.环境检查

-确认实验室环境符合安全标准，无安全隐患，如通风良好、温度适宜等。

九、技术故障处理

1.故障诊断

-当设备或系统出现故障时，操作人员应立即停止操作，并记录故障现象。

-根据故障现象，结合设备操作手册和故障代码，初步判断故障原因。

-如无法自行诊断，应立即通知设备维护人员或技术支持人员。

2.排除程序

-维护人员或技术支持人员到达现场后，应详细询问故障现象，并再次确认故障。

-根据