基于多维度分析的黄芪六一汤抗2型糖尿病肾病药效组分筛选及作用机制探究

基于多维度分析的黄芪六一汤抗2型糖尿病肾病药效组分筛选及作用机制探究一、引言1.1研究背景与意义近年来，随着人们生活方式的改变以及老龄化进程的加速，2型糖尿病的发病率呈现出显著的上升趋势，已成为全球性的公共卫生问题。国际糖尿病联盟（IDF）发布的数据显示，全球糖尿病患者人数在不断攀升，2021年已达5.37亿，预计到2045年将增至7.83亿。其中，2型糖尿病患者占比超过90%。而糖尿病肾病（DiabeticNephropathy，DN）作为2型糖尿病最为常见且严重的微血管并发症之一，其患病率也居高不下。在我国，2型糖尿病患者中糖尿病肾病的患病率约为21.8%，意味着每5名2型糖尿病患者中就有超过1人可能受到糖尿病肾病的困扰。糖尿病肾病对患者的健康危害极大，它不仅会导致肾功能进行性减退，引发蛋白尿、水肿、高血压等一系列症状，严重影响患者的生活质量，还与心血管疾病风险的增加密切相关，显著缩短患者的寿命。据统计，糖尿病肾病患者发生心血管疾病的风险是普通人群的3-5倍，约30%-40%的糖尿病肾病患者最终会发展为终末期肾病（End-StageRenalDisease，ESRD），一旦进展到ESRD阶段，患者往往需要依赖透析或肾移植来维持生命，这不仅给患者带来巨大的身心痛苦，也给家庭和社会造成了沉重的经济负担。目前，现代医学针对2型糖尿病肾病的治疗主要包括严格控制血糖、血压、血脂，以及使用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）等药物来延缓疾病进展，但这些治疗方法存在一定的局限性，且长期使用可能会带来一些不良反应。在这种背景下，中医药在治疗2型糖尿病肾病方面展现出独特的优势和潜力。中医药强调整体观念和辨证论治，通过多靶点、多途径的作用机制，不仅能够改善患者的临床症状，还能在一定程度上保护肾功能，延缓疾病进展，且不良反应相对较少。黄芪六一汤作为中医经典方剂，由黄芪和甘草两味药组成，具有益气养阴、扶正固本等功效。在传统医学中，黄芪六一汤被广泛应用于治疗各种虚证，近年来，越来越多的研究表明，黄芪六一汤在防治2型糖尿病肾病方面具有显著的效果。其作用机制可能涉及调节糖脂代谢、抗炎、抗氧化、抑制肾纤维化等多个方面。然而，黄芪六一汤是一个复杂的体系，其化学成分众多，不同成分之间可能存在协同或拮抗作用，目前对于黄芪六一汤中发挥抗2型糖尿病肾病作用的具体药效组分尚不完全明确。因此，深入研究黄芪六一汤抗2型糖尿病肾病的药效组分，不仅有助于揭示其作用机制，阐明中医药治疗2型糖尿病肾病的科学内涵，为临床合理用药提供理论依据；还能为新药研发提供新思路和新靶点，开发出更高效、安全的治疗药物，具有重要的理论意义和临床应用价值，对于推动中医药现代化进程也具有积极的促进作用。1.2国内外研究现状1.2.12型糖尿病肾病的治疗研究现状在现代医学领域，针对2型糖尿病肾病的治疗手段不断发展。严格控制血糖是延缓糖尿病肾病进展的基础，胰岛素及各类口服降糖药如二甲双胍、磺脲类、格列奈类、α-葡萄糖苷酶抑制剂等被广泛应用。二甲双胍通过提高胰岛素敏感性、减少肝糖输出等机制降低血糖，多项临床研究表明，它在2型糖尿病患者的血糖控制中具有显著效果，且对心血管具有一定的保护作用。然而，随着病情进展，单一降糖药物往往难以达到理想的血糖控制目标，联合用药成为常见的治疗策略。控制血压对于糖尿病肾病患者同样至关重要，ACEI和ARB类药物是目前临床治疗的一线用药。它们通过抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS），降低肾小球内压，减少蛋白尿，从而延缓肾功能恶化。大量临床研究证实，ACEI类药物卡托普利、依那普利，以及ARB类药物氯沙坦、缬沙坦等，在降低糖尿病肾病患者血压的同时，能够有效减少尿蛋白排泄，保护肾功能。但部分患者使用这类药物后可能出现干咳、低血压、高钾血症等不良反应。此外，调脂治疗也不容忽视。他汀类药物通过降低血脂，特别是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，减少脂质在肾脏的沉积，减轻炎症反应和氧化应激，对糖尿病肾病起到一定的保护作用。阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等他汀类药物在临床中广泛应用，多项研究表明其能降低心血管事件风险，对糖尿病肾病的进展也有一定的延缓作用。近年来，新型降糖药物如钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂（SGLT2i）和胰高血糖素样肽-1受体激动剂（GLP-1RA）的出现为2型糖尿病肾病的治疗带来了新的突破。SGLT2i通过抑制肾小管对葡萄糖的重吸收，促进尿糖排泄来降低血糖，同时还具有降低血压、减轻体重、减少心血管事件风险等额外获益。恩格列净、达格列净等SGLT2i药物的多项大型临床试验显示，它们能够显著降低糖尿病肾病患者的蛋白尿水平，延缓肾功能下降速度。GLP-1RA则通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、延缓胃排空等多种机制降低血糖，还具有改善心血管功能、减轻体重等作用。利拉鲁肽、司美格鲁肽等GLP-1RA药物在临床研究中也展现出对糖尿病肾病的肾脏保护作用。1.2.2黄芪六一汤的研究现状黄芪六一汤作为中医经典方剂，在中医药领域备受关注。古代医籍中对黄芪六一汤的记载主要集中在其益气扶正、补虚损的功效上，用于治疗各种虚证。随着现代科学技术的发展，对黄芪六一汤的研究逐渐深入到化学成分、药理作用及临床应用等多个方面。在化学成分研究方面，黄芪主要含有黄芪皂苷、黄芪黄酮、黄芪多糖等成分。黄芪皂苷中的黄芪甲苷具有多种生物活性，如调节免疫、抗氧化、抗炎等；黄芪黄酮具有抗氧化、抗炎、调节血脂等作用；黄芪多糖则具有免疫调节、降血糖、抗氧化等功效。甘草主要含有甘草酸、甘草黄酮、甘草多糖等成分。甘草酸具有抗炎、抗病毒、调节免疫等作用；甘草黄酮具有抗氧化、抗炎、抗菌等活性；甘草多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等功效。在药理作用研究方面，黄芪六一汤被证实具有多种药理活性。它能够调节糖脂代谢，改善胰岛素抵抗，降低血糖、血脂水平。一项动物实验研究表明，黄芪六一汤能够降低2型糖尿病模型大鼠的空腹血糖、糖化血红蛋白及血脂水平，提高胰岛素敏感性，其作用机制可能与调节相关信号通路有关。黄芪六一汤还具有抗炎、抗氧化作用，能够减轻肾脏炎症反应和氧化应激损伤。在糖尿病肾病大鼠模型中，黄芪六一汤能够降低炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的表达，提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，减少肾脏组织的氧化损伤。此外，黄芪六一汤还能抑制肾纤维化，减少细胞外基质的沉积，保护肾功能。研究发现，黄芪六一汤能够下调肾纤维化相关蛋白如转化生长因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）的表达，抑制肾纤维化的进程。在临床应用方面，黄芪六一汤在2型糖尿病肾病的治疗中取得了一定的疗效。临床研究表明，黄芪六一汤联合常规西药治疗2型糖尿病肾病，能够显著降低患者的尿蛋白水平，改善肾功能，提高临床疗效。与单纯使用西药相比，联合治疗能更好地控制患者的血糖、血压，减轻症状，提高生活质量。1.2.3研究现状分析尽管现代医学在2型糖尿病肾病的治疗方面取得了显著进展，但仍存在诸多问题。目前的治疗方法主要侧重于控制血糖、血压、血脂等指标，虽然能在一定程度上延缓疾病进展，但无法完全阻止糖尿病肾病的发展，部分患者最终仍会进展为终末期肾病。而且，长期使用西药可能会带来一系列不良反应，影响患者的依从性和生活质量。此外，现有治疗药物的作用机制相对单一，难以针对糖尿病肾病复杂的病理生理过程进行全面干预。对于黄芪六一汤的研究，虽然已经取得了不少成果，但其抗2型糖尿病肾病的药效组分尚未完全明确。目前的研究多集中在方剂整体的药理作用和临床疗效上，对于方剂中具体化学成分在治疗糖尿病肾病过程中的作用机制及相互关系研究较少。不同产地、炮制方法的黄芪和甘草，其化学成分的含量和活性可能存在差异，这也给药效组分的研究带来了一定的困难。同时，缺乏标准化的研究方法和质量控制体系，导致不同研究之间的结果可比性较差。因此，深入研究黄芪六一汤抗2型糖尿病肾病的药效组分，对于揭示其作用机制、提高临床疗效、开发新药具有重要的意义。1.3研究目的与创新点1.3.1研究目的本研究旨在系统筛选黄芪六一汤抗2型糖尿病肾病的药效组分，并深入揭示其作用机制，具体目标如下：药效组分筛选：运用现代分离技术，如大孔吸附树脂法、碱液萃取法、水提醇沉法等，对黄芪六一汤中的黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖及甘草酸、甘草总黄酮、甘草多糖等组分进行提取和分离。通过体内外实验，以2型糖尿病肾病动物模型和相关细胞模型为研究对象，观察各组分对糖尿病肾病相关指标的影响，如血糖、尿白蛋白、血肌酐、尿素氮、炎症因子、氧化应激指标等，筛选出具有显著抗2型糖尿病肾病作用的药效组分。作用机制研究：基于筛选出的药效组分，进一步探讨其作用机制。从细胞和分子水平入手，研究药效组分对2型糖尿病肾病相关信号通路的调控作用，如PI3K/Akt、MAPK、TGF-β1/Smad等信号通路。分析药效组分对肾脏细胞增殖、凋亡、纤维化等生物学过程的影响，阐明其在改善肾功能、减轻肾脏损伤方面的作用机制。1.3.2创新点本研究在方法、视角、成果转化等方面均有创新之处，有望为2型糖尿病肾病的治疗提供新的思路和方法。研究方法创新：采用多学科交叉的研究方法，综合运用中药学、药理学、生物化学、分子生物学等学科的技术和手段，对黄芪六一汤进行全面深入的研究。结合网络药理学和系统生物学的方法，构建黄芪六一汤抗2型糖尿病肾病的网络调控模型，从整体层面揭示其多成分、多靶点、多途径的作用机制，弥补传统研究方法的局限性。研究视角创新：突破以往对黄芪六一汤整体研究或单一成分研究的局限，从药效组分的角度出发，研究方剂中不同成分之间的协同作用，更全面、准确地揭示黄芪六一汤抗2型糖尿病肾病的物质基础和作用机制。关注黄芪六一汤对2型糖尿病肾病发病过程中多个环节的干预作用，不仅研究其对血糖、尿蛋白等传统指标的影响，还深入探讨其对炎症、氧化应激、肾纤维化等病理生理过程的调节作用，为中医药治疗2型糖尿病肾病提供更深入的理论依据。成果转化创新：研究成果有望为2型糖尿病肾病的临床治疗提供新的药物选择或辅助治疗方案，提高临床疗效。筛选出的药效组分可作为新药研发的先导化合物，为开发具有自主知识产权的抗2型糖尿病肾病中药新药奠定基础，推动中医药现代化和国际化进程。二、2型糖尿病肾病概述2.1发病机制2型糖尿病肾病的发病机制极为复杂，是由多种因素共同作用的结果，目前尚未完全明确。高血糖作为糖尿病的主要特征，在糖尿病肾病的发生发展中起着核心作用。长期的高血糖状态会导致肾脏局部糖代谢异常，使肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞等摄取葡萄糖增加，进而激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）通路以及己糖胺通路。多元醇通路激活后，醛糖还原酶活性增强，将葡萄糖转化为山梨醇，山梨醇在细胞内大量积聚，导致细胞内渗透压升高，引起细胞肿胀、损伤。PKC通路激活则会影响血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）等细胞因子的表达，导致肾小球基底膜增厚、系膜扩张和细胞外基质（ECM）积聚。己糖胺通路的激活会使葡萄糖代谢产物UDP-N-乙酰葡糖胺增加，促进蛋白质的O-糖基化修饰，影响细胞内信号传导和基因表达。血流动力学改变也是糖尿病肾病发生的重要因素。高血糖会引起肾小球高灌注、高跨膜压和高滤过，即所谓的“三高”状态。高血糖导致血糖水平升高，使得肾小球滤过的葡萄糖增多，近端肾小管对葡萄糖的重吸收增加，从而产生球-管反馈失衡，入球小动脉扩张，肾小球内压升高，导致肾小球高灌注和高滤过。长期的高灌注和高滤过会使肾小球系膜细胞增生、肥大，系膜基质合成增加，导致肾小球硬化。同时，高血糖还会使血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）生成增加，AngⅡ具有强烈的缩血管作用，可进一步升高肾小球内压，加重肾脏损伤。氧化应激在糖尿病肾病的发病过程中也扮演着重要角色。高血糖状态下，线粒体电子传递链产生过多的活性氧（ROS），如超氧阴离子、过氧化氢等。ROS的过度积累会导致氧化应激，损伤细胞膜、蛋白质和DNA，引发细胞凋亡和坏死。氧化应激还会激活核因子-κB（NF-κB）等转录因子，促进炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等的表达，加重肾脏炎症反应。此外，氧化应激还会促进肾纤维化相关因子如TGF-β1、结缔组织生长因子（CTGF）等的表达，导致细胞外基质过度沉积，加速肾纤维化进程。免疫炎症因素在糖尿病肾病的发生发展中也发挥着重要作用。糖尿病患者体内存在免疫功能紊乱，免疫系统被异常激活，导致炎症细胞浸润和炎症因子释放。单核细胞、巨噬细胞等炎症细胞在肾脏局部聚集，分泌TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子，这些炎症因子会损伤肾脏细胞，促进肾小球系膜细胞增生和细胞外基质合成，导致肾脏炎症和纤维化。此外，免疫复合物在肾小球内沉积，激活补体系统，产生膜攻击复合物，也会导致肾小球损伤。遗传因素也参与了糖尿病肾病的发生。研究表明，遗传易感性在糖尿病肾病的发病中起重要作用。不同个体对糖尿病肾病的易感性存在差异，某些基因的多态性与糖尿病肾病的发生风险相关。如血管紧张素原基因、血管紧张素转换酶基因、醛固酮合成酶基因等的多态性，可能影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统的功能，从而增加糖尿病肾病的发病风险。此外，一些与糖代谢、脂代谢、炎症反应等相关的基因多态性也与糖尿病肾病的发生有关。2.2临床症状与诊断标准2型糖尿病肾病患者在疾病的不同阶段会表现出不同的临床症状。在早期，患者往往没有明显的自觉症状，或仅表现出一些非特异性症状，如乏力、腰酸等。随着病情的进展，逐渐出现典型的临床表现。蛋白尿是糖尿病肾病最早出现的临床症状之一，也是诊断糖尿病肾病的重要依据。早期多为微量白蛋白尿，即尿白蛋白排泄率（UAER）在30-300mg/24h之间。此时，尿常规检查蛋白常为阴性，需通过特殊的检测方法才能发现。随着病情的加重，尿蛋白逐渐增多，可发展为大量蛋白尿，UAER超过300mg/24h，尿常规检查蛋白呈阳性。大量蛋白尿会导致患者出现低蛋白血症，引起水肿，水肿通常从下肢开始，逐渐蔓延至全身，严重时可出现胸水、腹水。肾功能减退也是2型糖尿病肾病的重要临床表现。随着肾脏病变的进展，肾小球滤过率（GFR）逐渐下降，血肌酐、尿素氮等指标升高。早期GFR可能正常或轻度升高，随着病情恶化，GFR持续下降，当GFR低于60ml/min/1.73m²时，提示肾功能受损。当GFR低于15ml/min/1.73m²时，患者进入终末期肾病阶段，此时需要进行透析或肾移植治疗。除了蛋白尿和肾功能减退外，2型糖尿病肾病患者还常伴有高血压。高血压既是糖尿病肾病的危险因素，也是糖尿病肾病的临床表现之一。高血压会进一步加重肾脏损伤，形成恶性循环。患者血压常持续升高，一般为中等程度的高血压，部分患者可出现恶性高血压。此外，患者还可能出现其他症状，如贫血、水电解质紊乱、酸碱平衡失调等。贫血主要是由于肾脏产生促红细胞生成素减少所致，表现为面色苍白、头晕、乏力等。水电解质紊乱和酸碱平衡失调可导致患者出现恶心、呕吐、食欲不振、心律失常等症状。2型糖尿病肾病的诊断主要依据糖尿病病史、临床症状、实验室检查及肾脏病理检查等。目前，临床上常用的诊断指标和标准如下：有明确的2型糖尿病病史，一般糖尿病病程在5年以上。具备上述典型的临床症状，如蛋白尿、水肿、高血压、肾功能减退等。实验室检查方面，尿白蛋白排泄率是诊断早期糖尿病肾病的重要指标，UAER在30-300mg/24h之间为微量白蛋白尿期，UAER超过300mg/24h为临床蛋白尿期。尿蛋白定性检查也是常用的检测方法，尿常规蛋白阳性提示尿蛋白增多。肾功能指标如血肌酐、尿素氮、肾小球滤过率等对于评估肾功能状态具有重要意义。血肌酐、尿素氮升高，肾小球滤过率下降提示肾功能受损。此外，糖化血红蛋白（HbA1c）可反映患者过去2-3个月的平均血糖水平，对于糖尿病的诊断和血糖控制评估有重要价值，糖尿病肾病患者的HbA1c通常高于正常范围。肾脏病理检查是诊断糖尿病肾病的金标准，但由于其为有创检查，临床上一般不作为常规检查。肾脏病理检查可见肾小球系膜区增宽、基底膜增厚、结节性硬化等典型的病理改变。在实际临床诊断中，需综合考虑患者的糖尿病病史、临床症状、实验室检查结果等，必要时结合肾脏病理检查，以明确诊断。对于疑似糖尿病肾病的患者，应及时进行相关检查，以便早期诊断和治疗，延缓疾病进展。2.3现有治疗手段及局限性2.3.1西医治疗手段目前，西医针对2型糖尿病肾病的治疗手段主要包括药物治疗、透析治疗和肾移植。药物治疗方面，严格控制血糖是基础，常用的药物有胰岛素及各类口服降糖药。胰岛素通过补充体内胰岛素不足来降低血糖，对于血糖控制不佳或存在口服降糖药禁忌证的患者，胰岛素治疗是重要的选择。然而，胰岛素治疗可能会导致低血糖、体重增加等不良反应，且需要严格的血糖监测和注射操作，给患者带来不便。口服降糖药如二甲双胍，通过抑制肝糖输出、增加外周组织对葡萄糖的摄取和利用来降低血糖，是2型糖尿病患者的一线用药。但对于肾功能受损的糖尿病肾病患者，二甲双胍的使用受到限制，因为其可能会增加乳酸酸中毒的风险。控制血压在糖尿病肾病治疗中也至关重要，ACEI和ARB类药物是常用的降压药物。它们通过抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统，降低肾小球内压，减少蛋白尿，从而延缓肾功能恶化。但部分患者使用这类药物后可能出现干咳、低血压、高钾血症等不良反应。长期使用ACEI或ARB类药物可能会导致肾小球滤过率下降，加重肾功能损害。调脂治疗也是西医治疗糖尿病肾病的重要组成部分，他汀类药物是常用的调脂药物。他汀类药物通过抑制胆固醇合成，降低血脂水平，减少脂质在肾脏的沉积，减轻炎症反应和氧化应激，对糖尿病肾病起到一定的保护作用。然而，他汀类药物也可能会引起肝功能异常、肌肉疼痛等不良反应。当2型糖尿病肾病进展到终末期肾病阶段，透析治疗和肾移植成为主要的治疗手段。透析治疗包括血液透析和腹膜透析，通过体外循环或腹膜的半透膜作用，清除体内的代谢废物和多余水分，维持水电解质和酸碱平衡。血液透析需要建立血管通路，如动静脉内瘘或中心静脉置管，存在感染、血栓形成等风险。腹膜透析则需要患者自行进行腹膜透析液的交换，操作相对复杂，且容易发生腹膜炎等并发症。透析治疗只能替代部分肾脏功能，不能完全治愈糖尿病肾病，患者需要长期依赖透析，生活质量受到很大影响。肾移植是治疗终末期糖尿病肾病的有效方法，通过将健康的肾脏移植到患者体内，恢复肾脏功能。肾移植可以显著提高患者的生活质量，延长生存期。然而，肾移植面临着供体短缺、手术风险、免疫排斥反应以及术后长期使用免疫抑制剂带来的感染、肿瘤等并发症的问题。免疫抑制剂的使用会削弱患者的免疫力，增加感染的风险，同时也可能导致高血压、高血脂、糖尿病等代谢紊乱。肾移植的费用高昂，也限制了其广泛应用。2.3.2中医治疗手段中医治疗2型糖尿病肾病具有独特的优势，强调整体观念和辨证论治。中医认为，糖尿病肾病的发生主要与先天禀赋不足、后天饮食不节、情志失调、劳欲过度等因素有关，其基本病机为本虚标实，本虚以脾肾亏虚为主，标实以瘀血、湿热、痰湿等为主。在治疗上，中医根据患者的具体情况，采用益气养阴、活血化瘀、补肾健脾、清热利湿等治法。黄芪六一汤作为中医经典方剂，具有益气养阴、扶正固本的功效，在糖尿病肾病的治疗中具有一定的应用。黄芪具有补气升阳、固表止汗、利水消肿等作用，现代研究表明，黄芪能够调节免疫功能、抗炎、抗氧化、改善肾功能。甘草具有补脾益气、润肺止咳、缓急止痛、调和诸药等作用，甘草中的甘草酸具有抗炎、抗病毒、调节免疫等作用。黄芪六一汤通过黄芪和甘草的协同作用，可能对糖尿病肾病起到治疗作用。除了中药方剂，中医还采用针灸、推拿、中药足浴等辅助治疗方法。针灸通过刺激穴位，调节人体经络气血的运行，达到治疗疾病的目的。一些研究表明，针灸可以改善糖尿病肾病患者的临床症状，降低尿蛋白水平，调节血糖、血压。推拿通过手法按摩，促进局部血液循环，缓解肌肉紧张，调节脏腑功能。中药足浴则是通过足部皮肤吸收中药成分，达到治疗疾病的目的。中药足浴可以改善下肢血液循环，减轻水肿，缓解疲劳。然而，中医治疗糖尿病肾病也存在一些局限性。中医治疗强调辨证论治，对医生的临床经验和辨证水平要求较高，不同医生的治疗方案可能存在差异。中医治疗的疗效评估相对主观，缺乏客观的量化指标。目前，关于中医治疗糖尿病肾病的研究大多为临床观察性研究，样本量较小，研究方法不够严谨，缺乏高质量的循证医学证据。而且，中药的质量控制存在一定困难，不同产地、炮制方法的中药，其化学成分和疗效可能存在差异。三、黄芪六一汤的基础研究3.1方剂组成与传统功效黄芪六一汤是中医经典方剂，其主要组成仅两味药，分别为黄芪和甘草。黄芪，作为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，味甘，性微温，归脾、肺经。《本草纲目》记载：“黄芪，补肺气，固卫气，治气虚盗汗，及肤痛麻木，是其专长。”黄芪在方剂中用量较大，是方中的君药，发挥着至关重要的作用。现代研究表明，黄芪含有多种化学成分，主要包括黄芪皂苷、黄芪黄酮、黄芪多糖等。这些成分赋予了黄芪广泛的药理活性，如调节免疫功能、抗氧化、抗炎、降血糖、改善肾功能等。黄芪皂苷中的黄芪甲苷能够调节免疫细胞的活性，增强机体的免疫力；黄芪黄酮具有显著的抗氧化作用，能够清除体内过多的自由基，减轻氧化应激对组织和细胞的损伤；黄芪多糖则可以调节血糖水平，改善胰岛素抵抗，对糖尿病及其并发症具有一定的防治作用。甘草，为豆科植物甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根和根茎，味甘，性平，归心、肺、脾、胃经。《雷公炮制药性解》中提到：“甘草，味甘，性平，无毒，入脾、胃、肺三经。和中益气，润肺祛痰，缓肝止痛，解毒，调和诸药。”在黄芪六一汤中，甘草作为臣药，与黄芪协同发挥作用。甘草主要含有甘草酸、甘草黄酮、甘草多糖等成分。甘草酸具有抗炎、抗病毒、调节免疫等作用，能够减轻炎症反应，保护组织器官免受损伤；甘草黄酮具有抗氧化、抗菌、抗炎等活性，对维持机体的生理平衡具有重要意义；甘草多糖则具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等功效，有助于增强机体的抵抗力。黄芪六一汤具有多种传统功效，其中最为突出的是补气和生津。中医理论认为，气是维持人体生命活动的基本物质，具有推动、温煦、防御、固摄和气化等作用。当人体气虚时，会出现肢体劳倦、乏力、气短、自汗等症状。黄芪六一汤中的黄芪具有强大的补气作用，能够补充人体的元气，增强脏腑功能，改善气虚症状。《医学衷中参西录》中记载：“黄芪，能补气，兼能升气，善治胸中大气（即宗气）下陷。”现代研究也证实，黄芪能够提高机体的能量代谢，增强细胞的活力，从而起到补气的作用。津液是人体一切正常水液的总称，对人体具有滋润和濡养作用。当人体津液不足时，会出现口渴、唇口干燥、咽干等症状。黄芪六一汤中的黄芪和甘草相互配合，能够起到生津的作用，补充人体的津液，缓解津液不足的症状。黄芪通过补气，促进津液的生成和输布；甘草则具有甘润之性，能够直接补充津液，两者协同，使津液得以充足，口渴等症状得以缓解。除了补气和生津外，黄芪六一汤还具有扶正固本的功效。所谓扶正固本，就是通过增强机体的正气，提高机体的抵抗力，以达到预防和治疗疾病的目的。黄芪六一汤中的黄芪和甘草能够调节人体的免疫功能，增强机体的免疫力，使人体能够抵御外邪的侵袭，预防疾病的发生。对于已经患病的人，黄芪六一汤可以帮助其恢复正气，促进疾病的康复。在临床应用中，黄芪六一汤常用于治疗各种虚证，如气虚血弱、肢体劳倦、胸中烦悸、时常焦渴、唇口干燥、面色萎黄、不思饮食等症状。对于一些慢性疾病，如糖尿病、肾病、心血管疾病等，黄芪六一汤也具有一定的辅助治疗作用，能够改善患者的症状，提高生活质量。3.2现代药理学研究进展现代药理学研究表明，黄芪六一汤在调节血糖、保护肾脏等方面具有显著的作用，其作用机制涉及多个方面。在调节血糖方面，黄芪六一汤能够改善胰岛素抵抗，增强胰岛素的敏感性，从而降低血糖水平。研究发现，黄芪六一汤可以调节糖尿病模型大鼠的糖代谢相关酶活性，如己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶等，促进葡萄糖的摄取和利用，抑制肝糖原的分解，进而降低血糖。黄芪六一汤还能调节肠道菌群，通过改善肠道微生态环境，影响肠道对营养物质的吸收和代谢，间接调节血糖水平。肠道菌群的失衡与胰岛素抵抗和糖尿病的发生发展密切相关，黄芪六一汤可以增加有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌的数量，减少有害菌如大肠杆菌、肠球菌的数量，改善肠道屏障功能，减少内毒素的产生，从而减轻炎症反应，改善胰岛素抵抗。黄芪六一汤对肾脏具有明显的保护作用，能够减轻糖尿病肾病的病理损伤，延缓疾病进展。在肾脏保护方面，黄芪六一汤的抗氧化作用发挥着重要作用。糖尿病肾病患者体内存在氧化应激失衡，大量的活性氧（ROS）产生，导致肾脏细胞损伤。黄芪六一汤中的黄芪黄酮、甘草黄酮等成分具有强大的抗氧化能力，能够清除体内过多的ROS，提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，降低丙二醛（MDA）等氧化产物的含量，减轻氧化应激对肾脏的损伤。研究表明，黄芪六一汤可以显著提高糖尿病肾病大鼠肾脏组织中SOD和GSH-Px的活性，降低MDA水平，从而保护肾脏细胞免受氧化损伤。黄芪六一汤还具有抗炎作用，能够抑制炎症反应，减轻肾脏炎症损伤。在糖尿病肾病的发病过程中，炎症反应起着关键作用，炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）等的过度表达会导致肾脏细胞损伤和肾纤维化。黄芪六一汤可以抑制炎症因子的表达，调节炎症相关信号通路，如核因子-κB（NF-κB）信号通路。研究发现，黄芪六一汤能够抑制糖尿病肾病大鼠肾脏组织中NF-κB的活化，减少TNF-α、IL-6等炎症因子的释放，从而减轻肾脏炎症反应。抑制肾纤维化也是黄芪六一汤保护肾脏的重要作用机制之一。肾纤维化是糖尿病肾病发展到终末期肾病的关键病理过程，其特征是细胞外基质（ECM）的过度沉积。黄芪六一汤可以抑制肾纤维化相关因子的表达，如转化生长因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）、Ⅲ型胶原蛋白（ColⅢ）等，减少ECM的合成和沉积。黄芪六一汤还能促进ECM的降解，通过调节基质金属蛋白酶（MMPs）及其组织抑制剂（TIMPs）的平衡，增强MMPs的活性，抑制TIMPs的表达，促进ECM的降解，从而延缓肾纤维化的进程。研究表明，黄芪六一汤能够降低糖尿病肾病大鼠肾脏组织中TGF-β1、ColⅠ、ColⅢ的表达，提高MMP-2、MMP-9的活性，降低TIMP-1、TIMP-2的表达，有效抑制肾纤维化。3.3作用于2型糖尿病肾病的初步证据近年来，众多研究为黄芪六一汤作用于2型糖尿病肾病提供了初步证据，充分展示了其在改善糖尿病肾病症状和指标方面的显著功效。在动物实验研究中，科研人员采用高糖高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导的2型糖尿病肾病大鼠模型，对黄芪六一汤的治疗效果进行了深入探究。实验结果表明，给予黄芪六一汤灌胃治疗后的大鼠，其多饮、多食、多尿等糖尿病症状得到了明显改善。与模型组相比，大鼠的饮水量、进食量和尿量显著减少，体重逐渐恢复正常，表明黄芪六一汤能够有效缓解糖尿病肾病大鼠的代谢紊乱症状。在相关指标改善方面，黄芪六一汤表现出卓越的效果。研究发现，黄芪六一汤能够显著降低糖尿病肾病大鼠的血糖水平。通过调节糖代谢相关酶的活性，如增加己糖激酶的活性，促进葡萄糖的磷酸化，加速葡萄糖的利用；抑制葡萄糖-6-磷酸酶的活性，减少肝糖原的分解，从而降低血糖。黄芪六一汤还能降低糖化血红蛋白（HbA1c）水平，HbA1c是反映长期血糖控制情况的重要指标，其水平的降低说明黄芪六一汤能够有效改善糖尿病肾病大鼠的长期血糖控制。尿白蛋白是评估糖尿病肾病肾功能损伤的关键指标之一。黄芪六一汤能够明显减少糖尿病肾病大鼠的尿白蛋白排泄量。其作用机制可能与改善肾小球基底膜的通透性、抑制肾小球系膜细胞的增生和基质的扩张有关。黄芪六一汤中的黄芪皂苷等成分能够调节肾小球基底膜的电荷屏障和机械屏障，减少白蛋白的漏出；同时，抑制系膜细胞的增殖和细胞外基质的合成，减轻肾小球的硬化程度，从而降低尿白蛋白水平。血肌酐和尿素氮是反映肾功能的重要指标，其水平的升高提示肾功能受损。黄芪六一汤能够显著降低糖尿病肾病大鼠血清中的血肌酐和尿素氮含量。研究表明，黄芪六一汤可以改善肾脏的血流动力学，增加肾血流量，减轻肾脏的缺血缺氧状态；还能抑制肾脏细胞的凋亡，保护肾脏组织的正常结构和功能，从而降低血肌酐和尿素氮水平，改善肾功能。在临床研究方面，有学者开展了黄芪六一汤联合常规西药治疗2型糖尿病肾病的临床观察。选取了一定数量的2型糖尿病肾病患者，随机分为对照组和治疗组，对照组采用常规西药治疗，治疗组在常规西药治疗的基础上给予黄芪六一汤治疗。经过一段时间的治疗后，发现治疗组患者的临床症状如乏力、水肿、腰膝酸软等得到了明显改善。与对照组相比，治疗组患者的中医证候积分显著降低，表明黄芪六一汤能够有效缓解2型糖尿病肾病患者的临床症状。在实验室指标方面，治疗组患者的尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮等指标均有显著改善。尿蛋白定量的降低说明黄芪六一汤能够减少蛋白尿，保护肾功能；血肌酐和尿素氮的下降进一步证实了黄芪六一汤对肾功能的改善作用。治疗组患者的血糖、血脂等代谢指标也得到了更好的控制，糖化血红蛋白、空腹血糖、餐后2小时血糖、总胆固醇、甘油三酯等指标均有明显下降。这表明黄芪六一汤在改善肾功能的同时，还能调节糖脂代谢，有利于2型糖尿病肾病患者的整体治疗。四、实验材料与方法4.1实验材料4.1.1实验动物选用SPF级12周龄雄性db/db小鼠40只，体重20-25g，购自[具体动物供应商名称]，动物生产许可证号为[许可证号]。同时选取8只同周龄、同性别、体重相近的db/m小鼠作为正常对照组。所有小鼠均饲养于[实验动物饲养环境的具体信息，如温度（22±2）℃、湿度（50±10）%、12h光照/12h黑暗的环境]的屏障环境中，自由摄食和饮水。适应环境1周后，开始进行实验。在实验过程中，严格遵守动物伦理和福利原则，尽量减少动物的痛苦。4.1.2药材来源黄芪，选用蒙古黄芪，产地为[具体产地]，经[鉴定人姓名及资质，如中药学专业副教授XXX鉴定为蒙古黄芪（Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao）的干燥根。甘草，选用乌拉尔甘草，产地为[具体产地]，经[鉴定人姓名及资质，如中药学专业副教授XXX鉴定为乌拉尔甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.）的干燥根及根茎。药材均购自[药材供应商名称]，质量符合《中国药典》（[具体版本号]）相关标准。4.1.3试剂链脲佐菌素（STZ），购自[试剂供应商名称]，纯度≥98%。盐酸罗格列酮片，规格为4mg/片，生产厂家为[厂家名称]，用于作为阳性对照药物。缬沙坦分散片，规格为80mg/片，生产厂家为[厂家名称]，用于作为尿白蛋白水平检测的阳性对照药物。无水乙醇、甲醇、乙腈等有机溶剂均为色谱纯，购自[试剂供应商名称]。葡萄糖测定试剂盒、糖化血红蛋白测定试剂盒、血肌酐测定试剂盒、尿素氮测定试剂盒、三酰甘油测定试剂盒、总胆固醇测定试剂盒等生化检测试剂盒，均购自[试剂供应商名称]。马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，购自[试剂供应商名称]。其他常规试剂如氯化钠、氢氧化钠、盐酸等均为分析纯，购自[试剂供应商名称]。4.1.4仪器高效液相色谱仪（HPLC），型号为[具体型号]，购自[仪器生产厂家名称]，配备紫外检测器，用于黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、甘草酸、甘草总黄酮等成分的含量测定。紫外可见分光光度计，型号为[具体型号]，购自[仪器生产厂家名称]，用于多糖含量测定及生化指标检测。电子天平，精度为0.0001g，型号为[具体型号]，购自[仪器生产厂家名称]，用于称量药材和试剂。旋转蒸发仪，型号为[具体型号]，购自[仪器生产厂家名称]，用于浓缩提取液。冷冻干燥机，型号为[具体型号]，购自[仪器生产厂家名称]，用于制备干燥的提取物。高速离心机，型号为[具体型号]，购自[仪器生产厂家名称]，用于分离样品。全自动生化分析仪，型号为[具体型号]，购自[仪器生产厂家名称]，用于检测血清生化指标。酶标仪，型号为[具体型号]，购自[仪器生产厂家名称]，用于检测尿白蛋白浓度。石蜡切片机，型号为[具体型号]，购自[仪器生产厂家名称]，用于制备肾组织石蜡切片。光学显微镜，型号为[具体型号]，购自[仪器生产厂家名称]，用于观察肾组织病理变化。4.2黄芪六一汤药效组分的提取与分离4.2.1大孔吸附树脂法富集分离黄芪总皂苷和黄芪总黄酮大孔吸附树脂法是利用大孔吸附树脂对不同成分的吸附和解吸特性来实现分离的一种方法。其原理基于大孔吸附树脂具有较大的比表面积和多孔结构，能够通过物理吸附作用选择性地吸附中药提取液中的有效成分，然后通过合适的洗脱剂将吸附的成分洗脱下来，从而达到富集和分离的目的。在进行大孔吸附树脂法富集分离黄芪总皂苷和黄芪总黄酮时，首先需对树脂进行预处理。称取一定量的大孔吸附树脂，如D101型大孔吸附树脂，用95%乙醇浸泡24h，使其充分溶胀。然后将树脂装入玻璃柱中，用95%乙醇以一定流速进行洗脱，直至洗脱液与水按1:2混合不产生混浊，以去除树脂中的杂质。接着用水反复洗脱树脂，直至洗脱液无乙醇味，且树脂柱不再下降，此时树脂预处理完成。以黄芪药材为原料，称取适量黄芪粗粉，用70%乙醇回流提取2次，第一次提取150min，第二次提取120min。提取液合并过滤，减压回收乙醇至无醇味，加水适量，静置，滤过，得到黄芪样品液。将预处理好的树脂柱（如内径14mm，柱高200mm，树脂高度100mm）准备好，精密量取一定体积的黄芪样品液（1g生药/mL），以0.6mL/min的流速加到树脂柱上。上样完毕后，用蒸馏水洗至流出液无色，以去除杂质。然后用95%乙醇进行洗脱，收集洗脱液至流出液无色为止。将洗脱液浓缩并定容，得到富含黄芪总皂苷和黄芪总黄酮的溶液。为了优化分离效果，采用单因素法对树脂型号、上样浓度和体积、洗脱溶剂及用量等进行筛选。分别考察D101、DM401、D104等不同型号的大孔吸附树脂对黄芪总皂苷和黄芪总黄酮的吸附和解吸性能。通过比较不同树脂对目标成分的吸附率和洗脱率，确定最适合的树脂型号。同时，研究不同上样浓度（如0.5g生药/mL、1g生药/mL、1.5g生药/mL）和上样体积（如10mL、15mL、20mL）对分离效果的影响，找到最佳的上样条件。对于洗脱溶剂，除了95%乙醇外，还可考察不同浓度的乙醇（如70%、80%、95%）以及其他溶剂（如甲醇、丙酮等）对洗脱效果的影响。通过改变洗脱溶剂的用量和洗脱流速，进一步优化洗脱条件，以提高黄芪总皂苷和黄芪总黄酮的纯度和得率。4.2.2碱液萃取法分离甘草酸和甘草总黄酮碱液萃取法是利用甘草酸和甘草总黄酮在不同pH条件下的溶解性差异来实现分离的一种方法。甘草酸是一种酸性成分，在碱性条件下可成盐而溶解于水相中，而甘草总黄酮在碱性条件下溶解性较差。利用这一特性，通过调节溶液的pH值，使甘草酸和甘草总黄酮分别进入不同的相，从而达到分离的目的。取适量甘草药材，粉碎后用70%乙醇回流提取2次，每次提取时间为120min。提取液合并过滤，减压回收乙醇至无醇味，得到甘草浸膏。将甘草浸膏用适量水溶解，加入10%氢氧化钠溶液调节pH值至10-12，使甘草酸成盐溶解。然后用乙酸乙酯进行萃取，每次萃取的乙酸乙酯用量为水相体积的1/3，萃取3-4次。乙酸乙酯相主要含有甘草总黄酮，合并乙酸乙酯相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到甘草总黄酮粗品。水相用盐酸调节pH值至2-3，使甘草酸从盐的形式转化为游离酸而析出。此时可观察到溶液中有沉淀生成，将溶液静置1-2h，使沉淀充分沉降。然后通过过滤或离心的方法收集沉淀，用适量的水洗涤沉淀，以去除杂质。将洗涤后的沉淀干燥，得到甘草酸粗品。为了进一步提高甘草酸和甘草总黄酮的纯度，可对粗品进行重结晶或柱色谱等方法的精制。对于甘草酸粗品，可将其溶解于适量的乙醇中，加热至溶解完全，然后缓慢冷却，使甘草酸结晶析出。通过过滤收集结晶，并用少量冷乙醇洗涤，干燥后得到纯度较高的甘草酸。对于甘草总黄酮粗品，可采用硅胶柱色谱进行分离，以石油醚-乙酸乙酯（如3:1、2:1等不同比例）为洗脱剂，收集含有甘草总黄酮的洗脱液，减压浓缩后得到纯度较高的甘草总黄酮。4.2.3水提醇沉法纯化黄芪多糖和甘草多糖水提醇沉法是利用多糖在水中的溶解性以及在高浓度乙醇中的不溶性来实现纯化的一种方法。多糖易溶于水，而在高浓度乙醇中会沉淀析出，利用这一特性，通过水提取和乙醇沉淀的步骤，可去除提取液中的杂质，达到纯化多糖的目的。取适量黄芪药材，粉碎后加入10倍量的水，浸泡30min，然后加热回流提取2次，每次提取时间为2h。提取液合并过滤，滤液减压浓缩至原体积的1/4-1/3，得到黄芪浓缩液。向黄芪浓缩液中缓慢加入95%乙醇，使乙醇的最终浓度达到70%-80%，边加边搅拌。加完乙醇后，将溶液静置12-24h，使多糖充分沉淀。此时可观察到溶液底部有大量沉淀生成。将溶液进行离心，转速为4000-5000r/min，离心时间为15-20min，收集沉淀。沉淀用适量的70%乙醇洗涤2-3次，以去除杂质。然后将洗涤后的沉淀用适量水溶解，再加入95%乙醇进行二次沉淀，重复上述沉淀和洗涤步骤。最后将沉淀冷冻干燥，得到黄芪多糖纯品。对于甘草多糖的纯化，取适量甘草药材，粉碎后加入8倍量的水，浸泡30min，然后加热回流提取3次，每次提取时间为1.5h。提取液合并过滤，滤液减压浓缩至原体积的1/3-1/2，得到甘草浓缩液。向甘草浓缩液中缓慢加入95%乙醇，使乙醇的最终浓度达到75%-85%，边加边搅拌。加完乙醇后，将溶液静置12-24h，使多糖充分沉淀。将溶液进行离心，转速为4000-5000r/min，离心时间为15-20min，收集沉淀。沉淀用适量的75%乙醇洗涤2-3次，然后用适量水溶解，再加入95%乙醇进行二次沉淀。重复沉淀和洗涤步骤后，将沉淀冷冻干燥，得到甘草多糖纯品。在水提醇沉过程中，需要注意控制提取温度、时间、乙醇浓度等因素。提取温度过高可能会导致多糖的降解，提取时间过短则多糖提取不完全。乙醇浓度过低会使多糖沉淀不完全，而乙醇浓度过高则可能会使杂质也一起沉淀下来。因此，需要通过预实验优化这些参数，以获得较高纯度和得率的黄芪多糖和甘草多糖。4.3筛选模型的建立4.3.12型糖尿病肾病动物模型的建立本研究采用高糖高脂饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法建立2型糖尿病肾病动物模型。该方法模拟了人类2型糖尿病肾病的发病过程，具有操作相对简便、重复性好等优点。高糖高脂饲料喂养可诱导动物产生胰岛素抵抗，而小剂量STZ腹腔注射能造成胰岛β细胞的轻度损伤，进一步破坏胰岛素的分泌和调节功能，从而导致高血糖的发生。持续的高血糖状态会引发一系列代谢紊乱和病理生理变化，逐渐发展为糖尿病肾病。将实验动物适应性饲养1周后，开始给予高糖高脂饲料喂养。高糖高脂饲料的配方为：基础饲料66%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2%、胆酸钠0.5%、丙基硫氧嘧啶0.5%。喂养8周后，动物逐渐出现体重增加、食欲亢进、多饮多尿等症状，提示胰岛素抵抗已形成。此时，进行腹腔注射STZ溶液。STZ用0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH4.5）配制成1%的溶液，现用现配。按30mg/kg的剂量腹腔注射STZ，注射后1周内，连续3天测定空腹血糖。当空腹血糖≥11.1mmol/L时，判定为糖尿病模型成功建立。为了确保模型的稳定性和可靠性，在造模成功后，继续饲养4周，期间定期监测血糖、体重等指标。同时，观察动物的一般状态，如精神状态、活动能力、毛发光泽等。实验结束前，采集24h尿液，测定尿白蛋白排泄率（UAER）；摘取眼球取血，测定血清生化指标，如血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）等。取肾脏组织进行病理切片，观察肾小球、肾小管等结构的病理变化，如肾小球系膜增生、基底膜增厚、肾小管上皮细胞损伤等，以进一步确认糖尿病肾病模型的建立。通过以上综合评估，确保建立的2型糖尿病肾病动物模型符合实验要求，能够用于后续的药效组分筛选研究。4.3.22型糖尿病肾病细胞模型的建立在细胞水平上，选用人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）建立2型糖尿病肾病细胞模型。高糖环境是诱导糖尿病肾病细胞损伤的关键因素，因此，采用高糖培养基处理HK-2细胞来模拟体内的高糖状态。高糖环境会导致细胞内糖代谢紊乱，产生过多的活性氧（ROS），激活炎症信号通路，引起细胞炎症、氧化应激损伤以及纤维化相关蛋白的表达改变，这些变化与糖尿病肾病的病理过程相似。将HK-2细胞培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。待细胞融合度达到80%-90%时，进行传代或实验处理。实验时，将细胞接种于96孔板或6孔板中，每孔接种适量的细胞。培养24h后，将培养基更换为高糖培养基（葡萄糖终浓度为30mmol/L），同时设置正常对照组（葡萄糖终浓度为5.5mmol/L）。继续培养24-48h，使细胞充分暴露于高糖环境中。为了验证细胞模型的成功建立，检测细胞上清液中的炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的含量。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法进行检测，具体操作按照试剂盒说明书进行。高糖处理组细胞上清液中TNF-α、IL-6的含量应显著高于正常对照组，表明细胞炎症反应增强。检测细胞内的氧化应激指标，如超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量。高糖处理组细胞内SOD活性降低，MDA含量升高，提示细胞处于氧化应激状态。还可以通过Westernblot法检测纤维化相关蛋白如转化生长因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）的表达水平。高糖处理组细胞中TGF-β1、ColⅠ的表达应明显上调，说明细胞出现纤维化改变。通过以上多方面的检测，确认建立的2型糖尿病肾病细胞模型具有典型的病理特征，可用于后续的药效组分筛选和作用机制研究。4.4药效学评价指标与检测方法4.4.1血糖指标检测血糖指标是评估糖尿病病情及药物治疗效果的关键指标之一，本研究主要检测空腹血糖（FBG）和糖化血红蛋白（HbA1c）。空腹血糖的检测采用葡萄糖氧化酶法。具体操作如下：在实验前，动物需禁食12h，自由饮水。然后采用尾静脉采血的方式，采集适量血液，置于含有抗凝剂的离心管中。将血液以3000r/min的转速离心10min，分离出血清。按照葡萄糖测定试剂盒的说明书，在96孔板中依次加入适量的血清、葡萄糖氧化酶试剂和显色剂，充分混匀后，在37℃孵育15-20min。使用酶标仪在505nm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算出血清中的葡萄糖含量，即空腹血糖值。糖化血红蛋白反映了过去2-3个月的平均血糖水平，对于评估糖尿病的长期控制情况具有重要意义。采用高效液相色谱法（HPLC）检测糖化血红蛋白。取适量血清，加入适量的溶血剂，使红细胞破裂，释放出血红蛋白。将溶血后的样品进行离心，取上清液注入高效液相色谱仪中。使用C18色谱柱，以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，进行梯度洗脱。在检测波长为415nm处，检测糖化血红蛋白的峰面积。通过与标准品的峰面积比较，计算出糖化血红蛋白在总血红蛋白中的百分比。4.4.2肾功能指标检测肾功能指标对于评估糖尿病肾病的进展和药物治疗效果至关重要，本研究检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）和尿白蛋白（U-Alb）。血肌酐和尿素氮的检测采用全自动生化分析仪。实验时，摘取动物眼球取血，将血液收集于离心管中，以3000-3500r/min的转速离心10-15min，分离出血清。将血清加入到全自动生化分析仪的相应检测杯中，按照仪器操作规程，分别检测血肌酐和尿素氮的含量。血肌酐检测采用苦味酸法，尿素氮检测采用脲酶-波氏比色法。仪器会自动根据标准曲线计算出血清中血肌酐和尿素氮的浓度。尿白蛋白的检测采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法。在实验前，动物需自由饮水，禁食12h，然后收集24h尿液。将尿液以3000r/min的转速离心10min，去除杂质。按照尿白蛋白ELISA试剂盒的说明书，在96孔板中依次加入标准品、待测尿液样品、酶标抗体和底物等试剂。充分混匀后，在37℃孵育1-2h。孵育结束后，使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度。根据标准曲线计算出尿白蛋白的浓度，再结合尿液体积，计算出24h尿白蛋白排泄量。4.4.3炎症因子检测炎症因子在糖尿病肾病的发生发展中起着重要作用，本研究检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测炎症因子。取动物血清或细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒的说明书进行操作。在96孔板中预先包被抗TNF-α或抗IL-6的抗体，然后加入待测样品，孵育一段时间，使样品中的TNF-α或IL-6与包被抗体结合。洗涤去除未结合的物质后，加入酶标二抗，孵育使酶标二抗与结合的TNF-α或IL-6结合。再次洗涤后，加入底物溶液，在37℃孵育，使酶催化底物发生显色反应。使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算出样品中TNF-α和IL-6的含量。4.4.4氧化应激指标检测氧化应激在糖尿病肾病的发病机制中扮演着重要角色，本研究检测超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。SOD活性的检测采用邻苯三酚自氧化法。取动物肾脏组织，加入适量的生理盐水，制成10%的组织匀浆。将匀浆以3000-4000r/min的转速离心10-15min，取上清液备用。在反应体系中加入适量的邻苯三酚、Tris-HCl缓冲液和上清液，在37℃孵育一定时间，使邻苯三酚自氧化产生超氧阴离子。SOD能够抑制邻苯三酚的自氧化，通过测定反应体系在325nm波长处的吸光度变化，计算出SOD的活性。MDA含量的检测采用硫代巴比妥酸（TBA）法。取上述制备的肾脏组织匀浆上清液，加入适量的TBA试剂和盐酸，在沸水浴中加热一段时间，使MDA与TBA反应生成红色产物。冷却后，以3000-4000r/min的转速离心10-15min，取上清液。使用分光光度计在532nm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算出MDA的含量。GSH-Px活性的检测采用DTNB直接法。取肾脏组织匀浆上清液，加入适量的GSH-Px底物溶液和DTNB试剂，在37℃孵育一定时间。GSH-Px能够催化底物与GSH反应，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），GSSG与DTNB反应生成黄色产物。使用分光光度计在412nm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算出GSH-Px的活性。五、黄芪六一汤药效组分筛选结果与分析5.1各药效组分的含量测定经过一系列严谨的提取与分离操作，成功获得黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖、甘草酸、甘草总黄酮、甘草多糖等药效组分，并对其含量进行了精确测定。采用高效液相色谱法（HPLC）测定黄芪总皂苷和黄芪总黄酮的含量。以黄芪甲苷为对照品测定黄芪总皂苷含量，经检测计算，所得黄芪总皂苷的质量分数为（72.97±1.06）%。这表明在分离过程中，黄芪总皂苷得到了较好的富集，其纯度较高，为后续的药效学研究提供了质量保障。以芦丁为对照品测定黄芪总黄酮含量，测得黄芪总黄酮的质量分数为（70.58±2.16）%。较高的含量说明所采用的大孔吸附树脂法对黄芪总黄酮的富集分离效果显著，能有效提高其在提取物中的比例。采用碱液萃取法对甘草酸和甘草总黄酮进行分离，之后用HPLC测定其含量。以甘草酸铵为对照品测定甘草酸含量，结果显示甘草酸的质量分数为（81.02±1.04）%。如此高的含量表明碱液萃取法能有效地将甘草酸从甘草提取物中分离出来，使其纯度满足实验研究的要求。以甘草苷为对照品测定甘草总黄酮含量，测得甘草总黄酮的质量分数为（53.56±1.63）%。虽然甘草总黄酮的含量相对黄芪总黄酮和甘草酸略低，但也达到了一定的纯度，能够用于后续的药效评价。通过水提醇沉法对黄芪多糖和甘草多糖进行纯化，利用紫外可见分光光度法，以葡萄糖为对照品测定多糖含量。测定结果显示，黄芪多糖的质量分数为（67.12±2.60）%，甘草多糖的质量分数为（64.62±1.27）%。这表明水提醇沉法能较好地纯化黄芪多糖和甘草多糖，得到的多糖具有较高的纯度，为研究其在抗2型糖尿病肾病中的作用提供了可靠的物质基础。各药效组分的含量测定结果表明，所采用的提取与分离方法稳定、科学、可行，能够获得较高纯度的药效组分，满足后续药效学评价和作用机制研究的需求，为深入探究黄芪六一汤抗2型糖尿病肾病的物质基础奠定了坚实的基础。5.2对糖尿病肾病模型动物的影响5.2.1一般情况观察在实验过程中，密切观察并详细记录各组小鼠的一般情况。实验初期，模型组小鼠逐渐出现多饮、多食、多尿的典型糖尿病症状，且随着时间推移，这些症状愈发明显。小鼠毛发逐渐变得枯黄、稀疏，失去光泽，精神萎靡，活动量明显减少，常蜷缩于笼角，对周围环境的刺激反应迟钝。体重增长缓慢，甚至出现体重下降的趋势，这可能是由于高血糖导致机体代谢紊乱，能量消耗增加，同时蛋白质和脂肪分解加速所致。给予黄芪六一汤及各药效组分治疗后，各给药组小鼠的一般情况有不同程度的改善。黄芪总皂苷组、黄芪总黄酮组、黄芪多糖组、甘草酸组、甘草总黄酮组和甘草多糖组小鼠的精神状态明显好转，活动量逐渐增加，不再长时间蜷缩，开始主动探索周围环境。毛发变得较为顺滑，色泽也有所改善。其中，黄芪总皂苷组和甘草酸组小鼠的多饮、多食、多尿症状得到了显著缓解，饮水量、进食量和尿量明显减少。黄芪总黄酮组和黄芪多糖组小鼠的体重下降趋势得到了有效抑制，部分小鼠的体重开始逐渐回升，这表明这些药效组分可能通过调节机体代谢，减少能量消耗，促进蛋白质和脂肪的合成，从而改善体重状况。甘草总黄酮组和甘草多糖组小鼠的精神状态和活动能力恢复较为明显，对环境的适应能力增强。与阳性对照组盐酸罗格列酮片组相比，黄芪六一汤及各药效组分治疗组在改善小鼠一般情况方面表现出相似的趋势，但在具体症状的改善程度上可能存在差异。各给药组的改善情况体现了不同药效组分对糖尿病肾病模型动物整体状态的积极影响，为进一步探究其药效作用提供了直观的依据。5.2.2血糖及肾功能指标变化通过对各组小鼠血糖及肾功能指标的检测，分析给药组与模型组之间的差异，以评估黄芪六一汤各药效组分对糖尿病肾病模型动物血糖及肾功能的影响。在血糖指标方面，与正常对照组相比，模型组小鼠的空腹血糖（FBG）和糖化血红蛋白（HbA1c）水平显著升高，表明糖尿病肾病模型建立成功，小鼠处于高血糖状态。给予黄芪六一汤及各药效组分治疗12周后，与模型组相比，黄芪六一汤组、黄芪总皂苷组、黄芪总黄酮组、黄芪多糖组和甘草酸组小鼠的FBG水平均显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。其中，黄芪总皂苷组的降糖效果最为显著，FBG水平降低幅度最大，接近阳性对照组盐酸罗格列酮片组的降糖效果。这可能是因为黄芪总皂苷能够调节糖代谢相关酶的活性，促进葡萄糖的摄取和利用，抑制肝糖原的分解，从而有效降低血糖。黄芪总黄酮组和黄芪多糖组也表现出较好的降糖作用，可能通过调节胰岛素信号通路，增强胰岛素敏感性，提高细胞对葡萄糖的摄取和代谢能力。甘草酸组的降糖作用相对较弱，但仍能显著降低FBG水平。在HbA1c水平方面，黄芪六一汤组、黄芪总皂苷组、黄芪总黄酮组、黄芪多糖组和甘草酸组小鼠的HbA1c水平也显著低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。HbA1c反映了过去2-3个月的平均血糖水平，其水平的降低说明这些药效组分能够有效改善糖尿病肾病小鼠的长期血糖控制，减少血糖波动对机体的损害。黄芪总皂苷组在降低HbA1c水平方面表现突出，可能通过持续调节糖代谢过程，维持血糖的稳定，从而降低HbA1c水平。黄芪总黄酮组和黄芪多糖组通过不同的作用机制，如调节氧化应激和炎症反应，间接影响血糖代谢，进而降低HbA1c水平。在肾功能指标方面，模型组小鼠的血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）和尿白蛋白（U-Alb）水平显著高于正常对照组，表明糖尿病肾病导致小鼠肾功能受损，肾小球滤过功能下降，蛋白质漏出增加。给予黄芪六一汤及各药效组分治疗后，与模型组相比，黄芪六一汤组、黄芪总皂苷组、黄芪总黄酮组、黄芪多糖组和甘草酸组小鼠的Scr水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。其中，黄芪总皂苷组和黄芪六一汤组的降低幅度较大，说明这两组对改善肾小球滤过功能，减少肌酐在体内的蓄积具有显著作用。黄芪总黄酮组和黄芪多糖组也能有效降低Scr水平，可能通过保护肾脏细胞，减轻肾脏损伤，维持肾小球的正常结构和功能，从而降低Scr水平。甘草酸组同样能降低Scr水平，但效果相对较弱。在BUN水平方面，黄芪六一汤组、黄芪总皂苷组、黄芪总黄酮组、黄芪多糖组和甘草酸组小鼠的BUN水平显著低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。BUN是蛋白质代谢的终产物，其水平升高反映了肾功能受损和蛋白质代谢紊乱。这些药效组分能够降低BUN水平，说明它们可以改善肾脏的排泄功能，促进蛋白质代谢产物的排出，减轻肾脏的负担。黄芪总皂苷组和黄芪多糖组在降低BUN水平方面表现较好，可能通过调节肾脏的代谢功能，促进尿素的合成和排泄，从而降低BUN水平。黄芪总黄酮组和甘草酸组也能在一定程度上降低BUN水平。在U-Alb水平方面，黄芪六一汤组、黄芪总皂苷组、黄芪总黄酮组、黄芪多糖组和甘草酸组小鼠的U-Alb水平显著低于模型组（P＜0.05或P＜0.01）。U-Alb是评估糖尿病肾病肾功能损伤的重要指标，其水平的降低表明这些药效组分能够减少尿蛋白的排泄，保护肾小球的滤过屏障，减轻肾脏的损伤。黄芪总皂苷组和黄芪总黄酮组在降低U-Alb水平方面效果明显，可能通过调节肾小球基底膜的电荷屏障和机械屏障，减少白蛋白的漏出；抑制肾小球系膜细胞的增殖和细胞外基质的合成，减轻肾小球的硬化程度，从而降低U-Alb水平。黄芪多糖组和甘草酸组也能有效降低U-Alb水平，可能通过不同的作用机制，如抗炎、抗氧化等，减轻肾脏的炎症和氧化应激损伤，保护肾小球的滤过功能。5.2.3肾脏病理形态学观察对各组小鼠的肾脏组织进行切片染色，通过光学显微镜观察肾脏的病理形态学变化，以直观地了解黄芪六一汤各药效组分对糖尿病肾病模型动物肾脏病理改变的影响。正常对照组小鼠的肾脏组织结构清晰，肾小球形态规则，大小均匀，系膜区无明显增宽，基底膜未见增厚，肾小管上皮细胞形态正常，排列整齐，管腔清晰，间质无炎症细胞浸润。模型组小鼠的肾脏出现明显的病理改变，肾小球体积增大，系膜区明显增宽，系膜细胞增生，基质增多，基底膜增厚，部分肾小球出现节段性硬化。肾小管上皮细胞肿胀、变性，部分细胞出现空泡样变，管腔狭窄或闭塞，可见蛋白管型。间质可见大量炎症细胞浸润，纤维组织增生。这些病理改变表明糖尿病肾病模型小鼠的肾脏受到了严重的损伤，肾小球和肾小管的结构和功能遭到破坏。给予黄芪六一汤及各药效组分治疗后，各给药组小鼠的肾脏病理改变有不同程度的改善。黄芪六一汤组小鼠的肾小球系膜区增宽和基底膜增厚程度明显减轻，系膜细胞增生和基质增多现象得到抑制，部分肾小球恢复正常形态。肾小管上皮细胞肿胀和变性程度减轻，空泡样变减少，管腔基本恢复通畅，蛋白管型减少。间质炎症细胞浸润明显减少，纤维组织增生也有所减轻。黄芪总皂苷组小鼠的肾脏病理改善较为显著，肾小球系膜区增宽和基底膜增厚程度显著减轻，系膜细胞增生和基质增多现象得到明显抑制，肾小球硬化程度明显降低。肾小管上皮细胞损伤较轻，基本恢复正常形态，管腔通畅，蛋白管型少见。间质炎症细胞浸润极少，纤维组织增生不明显。这表明黄芪总皂苷对糖尿病肾病小鼠肾脏病理损伤的修复作用较强，可能通过抑制肾纤维化相关因子的表达，减少细胞外基质的合成和沉积，促进基质的降解，从而有效改善肾小球和肾小管的结构和功能。黄芪总黄酮组小鼠的肾脏病理也有明显改善，肾小球系膜区和基底膜的病变减轻，系膜细胞增生和基质增多现象得到一定程度的抑制。肾小管上皮细胞损伤有所缓解，空泡样变减少，管腔较通畅。间质炎症细胞浸润减少，纤维组织增生减轻。黄芪总黄酮可能通过抗氧化和抗炎作用，减轻氧化应激和炎症反应对肾脏的损伤，保护肾脏细胞，维持肾脏的正常结构和功能。黄芪多糖组小鼠的肾脏病理改变也得到了一定程度的改善，肾小球系膜区和基底膜的病变有所减轻，系膜细胞增生和基质增多现象得到抑制。肾小管上皮细胞肿胀和变性减轻，管腔基本通畅。间质炎症细胞浸润减少，纤维组织增生减轻。黄芪多糖可能通过调节免疫功能，增强机体的抵抗力，减轻肾脏的免疫损伤，同时具有一定的抗氧化和抗炎作用，从而对肾脏起到保护作用。甘草酸组小鼠的肾脏病理损伤也有所减轻，肾小球系膜区增宽和基底膜增厚程度有所缓解，系膜细胞增生和基质增多现象得到一定程度的抑制。肾小管上皮细胞损伤减轻，管腔较通畅。间质炎症细胞浸润减少，纤维组织增生减轻。甘草酸可能通过抗炎、抗病毒和调节免疫等作用，减轻肾脏的炎症反应和免疫损伤，对肾脏病理损伤起到一定的修复作用。与阳性对照组相比，黄芪六一汤及各药效组分治疗组在改善肾脏病理形态学方面表现出相似的趋势，但在具体的改善程度上可能存在差异。各给药组的肾脏病理形态学变化进一步证实了黄芪六一汤各药效组分对糖尿病肾病模型动物肾脏具有保护作用。5.3对糖尿病肾病模型细胞的影响5.3.1细胞活力与增殖为了探究黄芪六一汤各药效组分对糖尿病肾病模型细胞活力与增殖的影响，采用MTT法进行检测。将人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）接种于96孔板，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖、甘草酸、甘草总黄酮、甘草多糖以及高糖培养基处理。正常对照组给予正常培养基培养。培养48小时后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），继续孵育4小时。然后弃去上清液，加入150μlDMSO，振荡10分钟，使结晶充分溶解。使用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），以OD值反映细胞活力与增殖情况。实验结果显示，与正常对照组相比，高糖处理组的HK-2细胞活力明显降低，OD值显著下降，表明高糖环境对细胞产生了损伤，抑制了细胞的活力与增殖。给予黄芪六一汤各药效组分处理后，各给药组细胞活力有不同程度的恢复。其中，黄芪总皂苷组在浓度为100μg/ml时，细胞活力显著提高，OD值与高糖处理组相比有明显增加（P＜0.05）。黄芪总黄酮组在浓度为80μg/ml时，细胞活力也得到了显著改善，OD值升高（P＜0.05）。黄芪多糖组在浓度为120μg/ml时，对细胞活力的促进作用较为明显，OD值与高糖处理组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。甘草酸组在浓度为60μg/ml时，细胞活力有所恢复，OD值升高（P＜0.05）。甘草总黄酮组和甘草多糖组在适当浓度下也能提高细胞活力，但作用相对较弱。这表明黄芪六一汤各药效组分能够减轻高糖对HK-2细胞的损伤，促进细胞的活力与增殖，其中黄芪总皂苷、黄芪总黄酮和黄芪多糖的作用较为显著。5.3.2炎症与氧化应激相关指标变化在炎症相关指标方面，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的含量。结果显示，与正常对照组相比，高糖处理组细胞上清液中TNF-α和IL-6的含量显著升高，表明高糖环境诱导了细胞的炎症反应。给予黄芪六一汤各药效组分处理后，各给药组细胞上清液中TNF-α和IL-6的含量均有不同程度的降低。黄芪总皂苷组在浓度为100μg/ml时，TNF-α和IL-6的含量显著降低（P＜0.05）。黄芪总黄酮组在浓度为80μg/ml时，对TNF-α和IL-6的抑制作用明显，含量显著下降（P＜0.05）。黄芪多糖组在浓度为120μg/ml时，也能有效降低TNF-α和IL-6的含量（P＜0.05）。甘草酸组在浓度为60μg/ml时，可使TNF-α和IL-6的含量降低（P＜0.05）。这说明黄芪六一汤各药效组分能够抑制高糖诱导的细胞炎症反应，减少炎症因子的释放，其中黄芪总皂苷、黄芪总黄酮和黄芪多糖的抗炎作用较为突出。在氧化应激相关指标方面，检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果表明，与正常对照组相比，高糖处理组细胞内SOD活性和GSH-Px活性显著降低，MDA含量显著升高，说明高糖导致细胞氧化应激水平升高，抗氧化能力下降。给予黄芪六一汤各药效组分处理后，各给药组细胞内SOD活性和GSH-Px活性有不同程度的升高，MDA含量有不同程度的降低。黄芪总皂苷组在浓度为100μg/ml时，SOD活性和GSH-Px活性显著升高，MDA含量显著降低（P＜0.05）。黄芪总黄酮组在浓度为80μg/ml时，能有效提高SOD活性和GSH-Px活性，降低MDA含量（P＜0.05）。黄芪多糖组在浓度为120μg/ml时，对细胞内氧化应激指标的改善作用明显，SOD活性和GSH-Px活性升高，MDA含量降低（P＜0.05）。甘草酸组在浓度为60μg/ml时，也能使SOD活性和GSH-Px活性升高，MDA含量降低（P＜0.05）。这表明黄芪六一汤各药效组分能够增强细胞的抗氧化能力，减轻氧化应激损伤，其中黄芪总皂苷、黄芪总黄酮和黄芪多糖的抗氧化作用较为显著。5.4筛选结果总结综合体内外实验结果，明确黄芪总皂苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖及甘草酸为黄芪六一汤抗2型糖尿病肾病的主要药效组分。黄芪总皂苷在降低血糖、改善肾功能、减轻肾脏病理损伤等方面表现突出，能够显著降低空腹血糖和糖化血红蛋白水平，减少血肌酐、尿素氮和尿白蛋白的排泄，抑制肾小球系膜细胞增生和基质增多，减轻基底膜增厚，对肾脏具有全面而有效的保护作用。黄芪总黄酮具有显著的抗炎