基于单细胞数据剖析淋巴结中细胞因子的作用机制

基于单细胞数据剖析淋巴结中细胞因子的作用机制1、文献综述1.1淋巴结中细胞因子作用机制的研究现状细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞合成的具有多种生物学活性的小分子蛋白，在免疫系统中有着至关重要的作用ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1]。这些蛋白通过自分泌、旁分泌和内分泌的方式，参与调控免疫细胞的活化、增殖、分化及介导免疫反应等多种生物学过程ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Dinarello</Author><RecNum>2</RecNum><DisplayText><styleface="superscript"font="TimesNewRoman">[2]</style></DisplayText><record><rec-number>2</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="5pd0fr2s4frd03eswv8vzxxcwd5axtvas90z"timestamp="1745030746">2</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Dinarello,C.A.</author></authors><translated-authors><author>Eur,J.Immunol</author></translated-authors></contributors><auth-address>UniversityofColoradoHealthSciencesCenter,4200EastNinthAve.,B168,Denver,CO80262,USA.cdinare333@</auth-address><titles><title>Historicalinsightsintocytokines</title></titles><number>0014-2980(Print)</number><dates></dates><urls></urls><remote-database-provider>2007Nov</remote-database-provider><research-notes>0(Cytokines)</research-notes><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[2]。淋巴结作为次级淋巴器官，其独特的组织结构（包括皮质区、副皮质区和髓质区）为不同免疫细胞亚群提供了功能适配的微环境，而细胞因子网络正是维持这一微环境动态平衡的关键调控因素ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Junt</Author><Year>2008</Year><RecNum>3</RecNum><DisplayText><styleface="superscript"font="TimesNewRoman">[3]</style></DisplayText><record><rec-number>3</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="5pd0fr2s4frd03eswv8vzxxcwd5axtvas90z"timestamp="1745030823">3</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Junt,T.</author><author>Scandella,E.</author><author>Ludewig,B.</author></authors></contributors><auth-address>NovartisInstitutesforBioMedicalResearch,4002Basel,Switzerland.tobias.junt@</auth-address><titles><title>Formfollowsfunction:lymphoidtissuemicroarchitectureinantimicrobialimmunedefence</title><secondary-title>NatRevImmunol</secondary-title></titles><periodical><full-title>NatRevImmunol</full-title></periodical><pages>764-75</pages><volume>8</volume><number>10</number><edition>2008/10/01</edition><keywords><keyword>Animals</keyword><keyword>Antigen-PresentingCells/immunology/metabolism</keyword><keyword>B-Lymphocytes/immunology/metabolism</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>Infections/*immunology</keyword><keyword>LymphNodes/anatomy&histology/*immunology/metabolism</keyword><keyword>LymphoidTissue/anatomy&histology/*immunology/metabolism</keyword><keyword>Peyer'sPatches/anatomy&histology/*immunology/metabolism</keyword><keyword>Spleen/anatomy&histology/*immunology/metabolism</keyword><keyword>T-LymphocyteSubsets/immunology/metabolism</keyword></keywords><dates><year>2008</year><pub-dates><date>Oct</date></pub-dates></dates><isbn>1474-1733</isbn><accession-num>18825130</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1038/nri2414</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[3]。传统研究主要依赖酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）、流式细胞术和体外功能实验等技术手段。Mosmann等人于1986年建立的Th1/Th2细胞因子分泌模式为理解细胞因子的免疫功能奠定了基础ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4]。然而，这些方法存在明显的技术局限性：首先，群体水平上的分析难以探究细胞异质性的影响；其次，难以分析动态变化；最后，通量不足导致无法完成系统性的研究ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[5]。例如，传统ELISA只能检测培养上清中细胞因子的总浓度，而无法区分不同细胞亚群的贡献ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[6]。单细胞测序技术的出现为该领域的研究带来了革命性的突破。2015年，Macosko等人开发的Drop-seq技术首次实现了大规模单细胞转录组分析ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[7]。随后10xGenomics平台的商业化使该技术得以广泛应用ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[8]。这项技术的优势如下：（1）单细胞分辨率可识别稀有细胞亚群；（2）可同时检测数千个基因的表达谱；（3）能结合UMI技术实现准确定量ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[9]。这些特性使其成为研究淋巴结微环境中细胞因子作用的理想工具。在淋巴结细胞因子研究领域，有许多突破性的研究成果。ZhenhuaRen等人基于IL2和IL15，总结了嵌合细胞因子药物在癌症免疫治疗中的应用前景，详细阐述了这些药物在调节淋巴结T细胞和NK细胞功能中的作用机制ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Ren</Author><Year>2024</Year><RecNum>10</RecNum><DisplayText><styleface="superscript"font="TimesNewRoman">[10]</style></DisplayText><record><rec-number>10</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="5pd0fr2s4frd03eswv8vzxxcwd5axtvas90z"timestamp="1745030902">10</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Ren,Z.</author><author>Zhang,X.</author><author>Fu,Y.X.</author></authors></contributors><auth-address>ChangpingLaboratory,Beijing,China. DepartmentofBasicMedicalSciences,SchoolofMedicine,TsinghuaUniversity,Beijing,China. Tsinghua-PekingCenterforLifeSciences,TsinghuaUniversity,Beijing,China.</auth-address><titles><title>FactsandHopesonChimericCytokineAgentsforCancerImmunotherapy</title><secondary-title>ClinCancerRes</secondary-title></titles><periodical><full-title>ClinCancerRes</full-title></periodical><pages>2025-2038</pages><volume>30</volume><number>10</number><edition>2024/01/08</edition><keywords><keyword>Humans</keyword><keyword>*Neoplasms/therapy/immunology/drugtherapy</keyword><keyword>*Immunotherapy/methods</keyword><keyword>*RecombinantFusionProteins/immunology/therapeuticuse</keyword><keyword>*Cytokines/metabolism</keyword><keyword>Animals</keyword><keyword>Interleukin-2/therapeuticuse/immunology/adverseeffects</keyword></keywords><dates><year>2024</year><pub-dates><date>May15</date></pub-dates></dates><isbn>1078-0432</isbn><accession-num>38190116</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1158/1078-0432.Ccr-23-1160</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[10]。RichardD.Bell团队构建TNF转基因小鼠模型，通过对超声和近红外成像后的小鼠进行膝关节和淋巴结的组织学分析，验证了iNOS基因敲除能够延缓引流淋巴结的扩张，维持淋巴管收缩功能，并减轻滑膜炎和骨侵蚀ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[11]。JudongKim等揭示了S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）及其还原酶（GSNOR）抑制剂N6022在B细胞免疫调节中的关键作用，通过上调B细胞中的调节性细胞因子白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10），下调致病性效应细胞因子白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）的方式，有效缓解小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（ExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis,EAE）进展ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[12]。AngCui等创建了包含超过17种免疫细胞类型对86种细胞因子的单细胞转录组学特征免疫词典，并开发配套软件IREA（ImmuneResponseEnrichmentAnalysis），用于从基因表达数据评估细胞因子活性和免疫细胞极化，借此揭示免疫检查点阻断疗法后肿瘤中的细胞因子网络ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[13]。这些突破性研究共同表明，深入探究淋巴结中细胞因子的作用机制对开发新型免疫治疗策略具有重要意义。因此，未来研究需全面解析细胞因子对淋巴结不同细胞亚群的特异性调控网络，基于单细胞分辨率刻画细胞因子分泌-响应的时空动态图谱。1.2研究内容及意义本研究基于86种细胞因子处理的小鼠淋巴结单细胞转录组测序数据，采用系统生物学分析方法，从多维度解析了细胞因子在免疫微环境中的复杂调控机制。首先，通过高变基因筛选和标记基因鉴定，我们准确识别出淋巴结中12种主要免疫细胞类型，包括T细胞亚群、B细胞、树突状细胞等。在此基础上，研究从三个递进层面展开深入分析：在分子调控层面，我们首先对各细胞类型进行差异表达分析，通过构建细胞因子家族特异的差异表达矩阵，系统评估了不同家族细胞因子对各免疫细胞亚群转录组的调控特征。通过UpSet可视化分析，揭示了特定细胞因子家族（如白细胞介素家族、肿瘤坏死因子家族等）对多种免疫细胞类型具有跨细胞协同调控效应，这种家族内一致性调控模式暗示了免疫调控网络的模块化特征。在细胞互作层面，研究采用CellChat，首先解析了淋巴结免疫微环境的整体通讯特征。通过建立以PBS处理为基准的互作强度矩阵，我们识别出多个被特定细胞因子显著强化的细胞互作对。进一步分析发现，这些特异性增强的互作主要涉及Mif-（Cd74+Cd44）等关键受配体对，提示细胞因子可能通过重塑细胞间通讯网络来协调免疫应答。在动态调控层面，针对关键免疫细胞亚群（如CD4+T细胞）进行了亚群细分和拟时序分析。通过Slingshot构建的分化轨迹显示，特定细胞因子（如IL-2、IL-7、IFNα1和IFNβ）能显著改变免疫细胞的分化路径，且在拟时序上呈现阶段特异性表达模式。这种时序依赖性调控特征为理解免疫细胞命运决定提供了动态视角。本研究通过整合多维分析策略，不仅系统揭示了细胞因子调控免疫网络的家族一致性、互作特异性和时序依赖性三大特征，更重要的是发现了多个潜在的免疫调控关键节点。这些发现为发展精准免疫干预策略提供了理论依据，对疫苗研发、肿瘤免疫治疗等领域具有重要启示。未来研究可进一步结合空间转录组和代谢组数据，在更高分辨率下验证这些调控机制。

2、材料与方法2.1数据来源从GEO数据库中获取了分别由86种细胞因子和PBS处理后的引流淋巴结的10x单细胞测序数据，数据编号为GSE202186。处理数据的86种细胞因子是11个细胞因子家族：白细胞介素1（IL-1）;共同γ链（γc）家族（commonγ-chain/IL-13/TSLP）;共同β链（βc）家族（commonβ-chain）;白细胞介素-6/白细胞介素-12（IL-6/IL-12）;白细胞介素-10（IL-10）;白细胞介素17（IL-17）;干扰素(interferon);肿瘤坏死因子（TNF）;补体系统（complement）;生长因子（growthfactor）和其他蛋白家族（Other）中的主要成员。实验采用3只C57BL/6野生型雌性小鼠（每种细胞因子处理）作为生物学重复，并以14只同品系同性别小鼠的PBS（磷酸盐缓冲液）处理组作为统一对照。2.2技术路线首先从PubMed数据库中检索与小鼠细胞因子相关的文献，在AngCui等人的创建了包含超过17种免疫细胞类型对86种细胞因子的单细胞转录组学特征免疫词典一文ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[13]中找到相关数据。进入GEO数据库，获取对应的C57BL/6型小鼠的细胞因子处理的淋巴结单细胞测序数据，GEO页面显示该数据被处理为88个样本且为哈希标签的单细胞测序。并且，从SingleCellPortal数据库中获得整合的单细胞数据以及注释信息。其次使用Seurat包对数据进行预处理，筛选高变基因用于数据降维；在选取合适的PCA数后，对数据进行tSNE降维聚类；最后，基于标记基因对细胞类型进行手动注释。为评估细胞因子的家族特异性效应，首先根据细胞因子家族对处理组进行分组。对每组细胞因子处理的单细胞数据（相较于PBS对照组）分别进行差异表达分析，筛选各细胞类型（B细胞、T细胞、髓系细胞等）中的差异基因（DEGs）。通过UpSet图展示不同家族成员间DEGs的重叠情况，评估家族内调控的一致性。最后，绘制堆叠条形图比较处理组与对照组的分布差异，以此量化细胞因子对细胞组成的全局影响。使用CellChat首先绘制整体的细胞通讯网络，得到整体互作情况；其次，对不同处理分别进行细胞通讯分析，提取共有的细胞互作对的互作强度，减去PBS组的互作强度，绘制热图，得到特有的细胞因子影响的细胞互作对及其信号通路，通过计算通路中各信号通路的贡献程度，绘制贡献程度最强的信号通路的细胞互作网络，揭示细胞因子的特异性调控机制。为构建拟时序轨迹，首先对感兴趣的B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞做亚群注释，基于Slingshot对以上三类亚群做拟时序分析，提取每一条分化轨迹，对细胞类型和对应的细胞因子处理进行可视化。为了量化细胞因子对分化轨迹的影响程度，采用Kruskal-Wallis非参数检验方法进行显著性分析，剖析细胞因子对细胞分化的作用机制。图2-1流程图。Figure2-1Flowchart.2.3研究方法2.3.1数据预处理首先，将原始表达矩阵与样本注释信息整合构建Seurat对象，在去除双细胞后执行严格的质量控制：保留检测到500-1000个基因（nFeature_RNA>500）、UMI计数>1000（nCount_RNA>1000）且线粒体基因比例<5%（percent.mt<5）的高质量细胞，同时排除线粒体基因含量>10%的异常细胞，以确保数据可靠性。随后，使用NormalizeData函数对表达数据进行对数标准化处理（缩放因子=10,000），以消除技术噪音和测序深度差异。基于方差稳定性变换筛选出3000个高变基因用于下游分析。基于高变基因对数据做主成分分析，为后续的细胞亚群分析和功能研究奠定了坚实基础。2.3.2细胞类型注释根据肘部图选择合适的PCA数目用于后续聚类。在分辨率为2.0的前提下对数据进行tSNE降维聚类，获得63种细胞类型。通过Seurat软件包中的FindAllMarkers函数（logfc.threshold=0.25，min.pct=0.25）筛选各细胞簇的差异表达基因；同时从CellMarker2.0数据库中获得已验证的细胞标记基因。通过差异基因与已知标记基因的系统比对，我们初步鉴定了12种细胞亚群。为验证鉴定结果的可靠性，进一步绘制了标记基因的表达点图，图中显示各候选标记基因在其对应的细胞亚群中呈现特异性高表达模式，证实了细胞类型注释的准确性。2.3.2差异基因分析根据处理条件提取Seurat对象子集，分别比较86种细胞因子和PBS处理组的差异，利用Wilcoxon秩和检验，筛选log(FC)>0.25或log(FC)<-0.25且FDR<0.05的差异基因。将细胞因子按照家族进行分组，在家族内可视化细胞因子影响的各细胞类型的差异基因平均表达情况，揭示家族内细胞因子的调控共性及特性。结合UpSet图识别具有协同或拮抗作用的细胞因子组合。计算各处理组中细胞类型比例的变化（如B细胞占比=B细胞数/总细胞数），绘制条形图，对细胞因子对细胞全局影响进行可视化。2.3.3细胞通讯网络首先从整体上构建细胞互作网络，观察细胞的互作情况。接着按不同处理条件分别进行细胞通讯分析，提取对应的细胞互作对及其互作强度，基于共有的细胞互作对，构建细胞因子-细胞互作对的互作强度矩阵，矩阵中所有强度值均以PBS组的值作为基准。获得其中作用最显著的细胞因子后，进一步提取其中的通路，将贡献程度最高的通路映射到细胞互作图。2.3.4构建拟时序轨迹在对感兴趣的细胞类型做亚群注释后，使用Slingshot对各亚群做拟时序分析。提取单独的分化轨迹，绘制拟时序的细胞类型和细胞因子的图谱，探究细胞因子在分化时间中的作用；使用Kruskal-Wallis非参数检验方法分别对细胞因子家族间和家族内部做显著性检验，探究细胞因子对细胞分化影响是否显著及同类细胞因子的影响是否一致。3、结果3.1细胞类型注释图谱首先对单细胞转录组数据进行了系统的预处理和分析（图3-1A）。具体流程如下：首先基于原始数据（共386,703个细胞）创建Seurat对象，经过双细胞去除后，采用严格的质量控制标准：保留nFeature_RNA>500（每个细胞检测到的基因数）、nCount_RNA>1,000（每个细胞的UMI总数）且线粒体基因比例<5%的高质量细胞，最终获得372,161个细胞（质量控制保留率96.2%）。质控结果显示，绝大多数细胞的三个关键指标（线粒体基因含量、检测基因数和UMI总数）均符合正常细胞范围。随后，我们筛选出3,000个高变基因，利用前75%的主成分进行t-SNE非线性降维，最终鉴定出63个具有显著转录组差异的细胞亚群（分辨率参数=2.0）。该分析流程确保了后续细胞因子作用机制研究的可靠性。结合差异基因和标记基因，鉴定出12个细胞类型（图3-1B），分别为CD4+T细胞（CD4_T_cell）、CD8+T细胞（CD8_T_cell）、调节性T细胞（Treg）、B细胞（B_cell）、迁移性树突状细胞（MigDCs）、自然杀伤细胞（NK）、浆细胞样树突状细胞（pDCs）、1型经典树突状细胞（CDC1s）、巨噬细胞（Macro）、内皮细胞（Endothelial_cells）、中性粒细胞（Neutrophils）以及嗜碱性粒细胞（Basophils）。绘制了标记基因在12种细胞类型中表达情况的点图（图3-1C），特定标记基因在相应细胞类型中呈现阶梯状的高表达模式，如S100a8在中性粒细胞细胞、Cpa3在嗜碱性粒细胞、Cd79a在B细胞、Klrk1在NK细胞等均表现出特异性高表达，这些标记基因在相应细胞类型中的特异性表达模式，与已报道的文献结果高度一致，充分证实了细胞类型注释的可靠性。基于这一可靠的细胞分型结果，我们进一步开展了后续的深入分析，包括细胞亚群的拟时序分析、细胞间互作分析以及差异基因分析。图3-1细胞注释图。（A）细胞聚类；（B）细胞类型注释；（C）标记基因表达点图。Figure3-1Cellannotationmap.(A)Cellclustering;(B)celltypeannotation;(C)markergeneexpressiondotplot.3.2细胞因子对细胞类型的影响3.2.1细胞因子对细胞群体组成的影响通过对细胞因子处理后的细胞组成分析（图3-2），我们发现与PBS对照组相比，大多数细胞因子处理组的细胞类型分布未表现出显著差异。然而，白细胞介素-33（interleukin-33,IL-33）和淋巴毒素α（lymphotoxinalpha,LTα）与淋巴毒素β（LTβ）处理明显增加了B细胞的比例，而白细胞介素-1α（interleukin-1α,IL-1α）、白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）和白细胞介素-9（interleukin-9,IL-9）处理则明显提高了迁移性树突状细胞的比例。卡方检验结果显示Cramer'sV系数为0.047（p<0.05），表明虽然存在个别细胞因子的特异性影响，但从整体来看，不同细胞因子处理对细胞类型组成的改变效应较弱。这一结果提示，在本实验条件下，细胞因子对于细胞类型比例的改变基本可以忽略,细胞因子可能主要通过调控细胞功能状态而非显著改变细胞群体组成来发挥作用。

图3-2细胞类型比例堆积条形图。Figure3-2Celltypeproportionalstackingbarchart.3.2.2细胞因子对基因表达的调控特征分析对86种细胞因子处理的多种细胞类型进行了系统的差异基因分析，首先通过比较各细胞因子处理组与对照组的转录组数据，筛选出显著差异表达基因（|log2FC|>0.25且FDR<0.05）。随后基于细胞因子家族分类（如肿瘤坏死因子、白介素、干扰素等）对差异基因进行整合分析，通过热图可视化发现不同细胞因子家族呈现出明显的细胞类型偏好性调控模式，例如IL-1家族成员主要在T细胞或巨噬细胞中引起显著的基因表达变化。进一步利用UpSet图分析差异基因的交集关系，成功鉴定出多个具有协同调控作用的细胞因子组合，这些组合往往在相同细胞类型中共同调控特定功能基因集，表明它们可能在相关信号通路中发挥协同作用。IL-10对所有细胞类型均有影响，IL-10家族对B细胞和髓系细胞的影响最大（图3-3A）；IL10,IL19,IL20在所有细胞类型中均呈现高度一致的基因表达调控模式，表明它们在功能上具有协同性（图3-3B），这种协同效应可能源于它们共享IL-10Rβ受体亚基。如图3-3C，IL10rb在所有细胞类型中广泛表达，而α链则呈现细胞类型特异性。IL-10通常被认为是最典型的免疫抑制细胞因子，其与其他白细胞介素的协同，可能与限制炎症反应有关ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Burmeister</Author><Year>2018</Year><RecNum>14</RecNum><DisplayText><styleface="superscript"font="TimesNewRoman">[14]</style></DisplayText><record><rec-number>14</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="5pd0fr2s4frd03eswv8vzxxcwd5axtvas90z"timestamp="1745033651">14</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Burmeister,A.R.</author><author>Marriott,I.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofBiologicalSciences,TheUniversityofNorthCarolinaatCharlotte,Charlotte,NC,UnitedStates.</auth-address><titles><title>TheInterleukin-10FamilyofCytokinesandTheirRoleintheCNS</title><secondary-title>FrontCellNeurosci</secondary-title></titles><periodical><full-title>FrontCellNeurosci</full-title></periodical><pages>458</pages><volume>12</volume><edition>2018/12/14</edition><keywords><keyword>Il-19</keyword><keyword>Il-20</keyword><keyword>Il-22</keyword><keyword>Il-24</keyword><keyword>astrocytes</keyword><keyword>interleukin-10</keyword><keyword>microglia</keyword><keyword>neuroinflammation</keyword></keywords><dates><year>2018</year></dates><isbn>1662-5102(Print) 1662-5102</isbn><accession-num>30542269</accession-num><urls></urls><custom2>PMC6277801</custom2><electronic-resource-num>10.3389/fncel.2018.00458</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[14]。图3-3IL-10细胞因子家族的差异基因表达调控特征。（A）IL-10家族的差异基因平均表达环形热图；（B）IL-10家族细胞因子的一致性调控；（C）IL10rb和Il10ra在细胞类型的表达热图。Figure3-3CharacterizationofdifferentialgeneexpressionregulationoftheIL-10cytokinefamily.(A)HeatmapofthemeanexpressionringofdifferentialgenesoftheIL-10family;(B)ConsistentregulationofIL-10familycytokines;(C)HeatmapofIL10rbandIl10raexpressionincelltypes.Complement家族中，补体成分3a（complementcomponent3a,C3a）和补体成分5a（complementcomponent5a,C5a）在中性粒细胞中显著上调其目标基因，而在调节性T细胞和树突状细胞中影响较小(图3-4A)。不同细胞类型（如Treg、pDC、NK细胞）在C3a作用下表现出相似的基因表达模式，说明这些细胞对补体激活的响应可能存在共同的调控机制。此外，Neutrophils、MigDCs、Macro等细胞群体之间存在较强的基因表达交集，表明补体因子可能在免疫细胞的协同作用中发挥重要作用。已有研究证明，C3a和C5a通过激活MEK/ERK通路增加多发性骨髓瘤细胞系的迁移、侵袭和粘附ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[15]。这些细胞共享68个差异表达基因，提示补体因子可能通过相似的通路调控这些免疫细胞的功能（图3-4B）。IL-17家族中，该家族成员对特定免疫细胞群体表现出显著的调控作用（图3-5A）。结果表明，白细胞介素-17A（interleukin-17A、IL-17A）、白细胞介素-17B（interleukin-17B、IL-17B）、白细胞介素-17D（interleukin-17D、IL-17D）和白细胞介素-17E（interleukin-17E、IL-17E、亦称IL-25）对B细胞、嗜碱性粒细胞、迁移性树突状细胞、内皮细胞及中性粒细胞的激活作用最为显著。其中，IL-17E（IL-25）展现出最广泛的生物学活性，能够显著影响所有细胞类型。值得注意的是，IL-17B与IL-17E表现出高度一致的调控模式；IL-17A和IL-17D也具有协同作用（图3-5B）。已知，IL-17A、IL-17E在免疫促进免疫反应的发生，依据两者和其他IL-17家族细胞因子共同作用，可以从差异基因一致上调推断其他细胞因子具有相似的作用ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Iwakura</Author><RecNum>16</RecNum><DisplayText><styleface="superscript"font="TimesNewRoman">[16]</style></DisplayText><record><rec-number>16</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="5pd0fr2s4frd03eswv8vzxxcwd5axtvas90z"timestamp="1745035861">16</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Iwakura,Y.</author><author>IshigameHFau-Saijo,Shinobu</author><author>SaijoSFau-Nakae,Susumu</author><author>Nakae,S.</author></authors><translated-authors><author>Immunity,</author></translated-authors></contributors><auth-address>LaboratoryofMolecularPathogenesis,CenterforExperimentalMedicineandSystemsBiology,TheInstituteofMedicalScience,TheUniversityofTokyo,4-6-1Shirokanedai,Minato-ku,Tokyo,Japan.iwakura@ims.u-tokyo.ac.jpFAU-Ishigame,Harumichi</auth-address><titles><title>Functionalspecializationofinterleukin-17familymembers</title></titles><number>1097-4180(Electronic)</number><dates></dates><urls></urls><remote-database-provider>2011Feb25</remote-database-provider><research-notes>0(Interleukin-17) 0(Receptors,Interleukin-17)</research-notes><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[16]。图3-4Complement细胞因子家族的差异基因表达调控特征。（A）Complement家族的差异基因平均表达热图；（B）Complement家族细胞因子的一致性调控。Figure3-4CharacterizationofdifferentialgeneexpressionregulationoftheComplementcytokinefamily.(A)HeatmapoftheaverageexpressionofdifferentialgenesoftheComplementfamily;(B)ConsistentregulationofComplementfamilycytokines.图3-5IL-17细胞因子家族的差异基因表达调控特征。（A）IL-17家族的差异基因平均表达热图；（B）IL-17家族细胞因子的一致性调控。Figure3-5CharacterizationofdifferentialgeneexpressionregulationoftheIL-17cytokinefamily.(A)HeatmapoftheaverageexpressionofdifferentialgenesoftheIL-17family;(B)ConsistentregulationofComplementfamilycytokines.Commonβchain家族主要对髓系细胞有较强的作用，如中性粒细胞、内皮细胞和嗜碱性粒细胞，而对T、B等淋巴系细胞的调控作用相对有限（图3-6A）。白细胞介素-3（interleukin-3、IL-3）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor、GM-CSF）、白细胞介素-5（interleukin-5、IL-5）在细胞类型的差异表达调控中具有协同作用，且前两者的协同作用更强（图3-6B）。已知IL-3、IL-5和GM-CSF的共同受体beta链（CSF2RB）的磷酸化与急性髓细胞性白血病突变FLT3-ITD的作用密切相关ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[17]。图3-6Commonβchain细胞因子家族的差异基因表达调控特征。（A）Commonβchain家族的差异基因平均表达热图；（B）Commonβchain家族细胞因子的一致性调控。Figure3-6CharacterizationofdifferentialgeneexpressionregulationoftheCommonβchaincytokinefamily.(A)HeatmapoftheaverageexpressionofdifferentialgenesoftheCommonβchainfamily;(B)ConsistentregulationofComplementfamilycytokines.在Interferon家族中，该家族成员对各类免疫细胞具有广泛的转录调控作用（图3-7A），多种细胞共享相同的上调基因，除此之外，同一种细胞因子在相同细胞类型中既有上调基因，也有下调基因，如干扰素ε（interferonepsilon,IFNe）对中性粒细胞的影响。此外，干扰素α1（interferonalpha-1,IFNα1）和干扰素β（interferonbeta,IFNβ）处理的细胞共享1729个基因，说明两者一致地对各细胞类型产生影响（图3-7B）。IFNα1可能是通过延长或放大IFNβ的效应，协同发挥作用ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wittling</Author><RecNum>18</RecNum><DisplayText><styleface="superscript"font="TimesNewRoman">[18]</style></DisplayText><record><rec-number>18</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="5pd0fr2s4frd03eswv8vzxxcwd5axtvas90z"timestamp="1745035952">18</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wittling,M.C.</author><author>Cahalan,S.R.</author><author>Levenson,E.A.</author><author>Rabin,R.L.</author></authors><translated-authors><author>Front,Immunol</author></translated-authors></contributors><auth-address>DivisionofBacterial,Parasitic,andAllergenicProducts,OfficeofVaccinesResearchandReview,CenterforBiologicsEvaluationandResearch,USFoodandDrugAdministration,SilverSpring,MD,UnitedStates.FAU-Cahalan,ShannonR DivisionofBacterial,Parasitic,andAllergenicProducts,OfficeofVaccinesResearchandReview,CenterforBiologicsEvaluationandResearch,USFoodandDrugAdministration,SilverSpring,MD,UnitedStates.FAU-Levenson,EricA DivisionofBacterial,Parasitic,andAllergenicProducts,OfficeofVaccinesResearchandReview,CenterforBiologicsEvaluationandResearch,USFoodandDrugAdministration,SilverSpring,MD,UnitedStates.FAU-Rabin,RonaldL DivisionofBacterial,Parasitic,andAllergenicProducts,OfficeofVaccinesResearchandReview,CenterforBiologicsEvaluationandResearch,USFoodandDrugAdministration,SilverSpring,MD,UnitedStates.</auth-address><titles><title>SharedandUniqueFeaturesofHumanInterferon-BetaandInterferon-AlphaSubtypes</title></titles><number>1664-3224(Electronic)</number><dates></dates><urls></urls><remote-database-provider>2020</remote-database-provider><research-notes>0(AntiviralAgents) 0(ImmunologicFactors) 0(InterferonRegulatoryFactors) 0(Interferon-alpha) 77238-31-4(Interferon-beta)</research-notes><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[18]。

图3-7Interferon细胞因子家族的差异基因表达调控特征。（A）Interferon家族的差异基因平均表达热图；（B）Interferon家族细胞因子的一致性调控。Figure3-7CharacterizationofdifferentialgeneexpressionregulationoftheInterferoncytokinefamily.(A)HeatmapoftheaverageexpressionofdifferentialgenesoftheInterferonfamily;(B)ConsistentregulationofComplementfamilycytokines.IL-1细胞因子家族中，B细胞和中性粒细胞的响应最为强烈（图3-8A）。其中，该家族中所有细胞因子对B细胞的影响都非常显著，而中性粒细胞只对其中白细胞介素-1α（interleukin-1α、IL-1α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β、IL-1β）、白细胞介素-18（interleukin-18、IL-18）、白细胞介素-33（interleukin-33、IL-33）、白细胞介素-36α（interleukin-36α、IL-36α）响应较为强烈。从UpSet结果来看，IL-18和IL-36a在除了调节性T细胞以外的其他细胞中具有一致性作用。图3-8IL-1细胞因子家族的差异基因表达调控特征。（A）IL-1家族的差异基因平均表达热图；（B）IL-1家族细胞因子的一致性调控。Figure3-8CharacterizationofdifferentialgeneexpressionregulationoftheIL-1cytokinefamily.(A)HeatmapoftheaverageexpressionofdifferentialgenesoftheIL-1family;(B)ConsistentregulationofComplementfamilycytokines.IL-6/IL-12家族中。细胞因子对B细胞、NK细胞、巨噬细胞、1型经典树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、中性粒细胞和内皮细胞的作用较明显。IL-11对各细胞类型的作用最明显，且IL-11和IL-27的一致性作用相对于其他细胞因子组合（如：白细胞介素-11（interleukin-11、IL-11）、白细胞介素-33（interleukin-33、IL-33）；白细胞介素-11（interleukin-11、IL-11）、抑瘤素M（oncostatinM、OSM）和白细胞介素-27（interleukin-27、IL-27））更显著（图3-9）。图3-9IL-6/IL-12细胞因子家族中细胞因子的一致性调控。Figure3-9Characterizationcytokines’consistentregulationoftheIL-6/IL-12cytokinefamily.对Commonγchain/IL-13/TSLP家族细胞因子处理的细胞进行差异分析，我们发现该家族成员对多种免疫细胞具有广泛的调控作用（图3-10A）。结果显示，大多数细胞因子（包括IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15和胸腺基质淋巴细胞生成素（thymicstromallymphopoietin、TSLP））对B细胞、中性粒细胞、内皮细胞、巨噬细胞和迁移性树突状细胞均表现出显著的协同效应。其中，IL-2展现出最显著的细胞类型特异性影响，其与IL-15在所有细胞类型中均表现出强烈的协同作用（图3-10B）。图3-10Commonγchain/IL-13/TSLP细胞因子家族的差异基因表达调控特征。（A）Commonγchain/IL-13/TSLP家族的差异基因平均表达热图；（B）Commonγchain/IL-13/TSLP家族细胞因子的一致性调控。Figure3-10CharacterizationofdifferentialgeneexpressionregulationoftheCommonγchain/IL-13/TSLPcytokinefamily.(A)HeatmapoftheaverageexpressionofdifferentialgenesoftheCommonγchain/IL-13/TSLPfamily;(B)ConsistentregulationofComplementfamilycytokines.Growthfactor家族中，中性粒细胞和嗜碱性粒细胞共享相同的细胞因子，有上调基因集合交集；B细胞有独特的上调差异基因结合，且B细胞对细胞因子的响应最为强烈（图3-11A）。在G-CSF处理下，12种细胞共享最多的差异基因；粒细胞集落刺激因子（granulocytecolony-stimulatingfactor、G-CSF）、碱性成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactor-basic、FGF-basic）、巨噬细胞集落刺激因子（macrophagecolony-stimulatingfactor、M-CSF）、干细胞因子（stemcellfactor、SCF）都具有较强的协同作用（图3-11B）。图3-11Growthfactor细胞因子家族的差异基因表达调控特征。（A）Growthfactor家族的差异基因平均表达热图；（B）Growthfactor家族细胞因子的一致性调控。Figure3-11CharacterizationofdifferentialgeneexpressionregulationoftheGrowthfactorcytokinefamily.(A)HeatmapoftheaverageexpressionofdifferentialgenesoftheGrowthfactorfamily;(B)ConsistentregulationofComplementfamilycytokines.通过对TNF家族细胞因子的功能分析，发现不同免疫细胞亚群对细胞因子刺激表现出特征性的响应模式。其中，B细胞对细胞因子处理的响应最明显，在相同的细胞因子（例如：增殖诱导配体（aproliferation-inducingligand、APRIL）,B细胞活化因子（B-cellactivatingfactor、BAFF））处理下，B细胞对应的部分差异基因和pDCs一致，TNF家族对中性粒细胞和嗜碱性粒细胞具有一致性。肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα、TNFα）、TNF样配体1A（TNF-likeligand1A、TL1A）对细胞有较强的协同作用，可能共同影响免疫调控（图3-12）。图3-12TNF细胞因子家族的一致性调控。Figure3-12CharacterizationofconsistentregulationoftheTNFcytokinefamily.通过对Other蛋白家族的差异表达基因分析发现，除B细胞谱系表现出独特表达模式外，其他免疫细胞类型（包括T细胞、髓系细胞和NK细胞等）均存在显著的基因表达交集。这种广泛的共表达现象提示该蛋白家族可能通过核心调控因子如核心蛋白聚糖（Decorin/DCN）和脂联素（Adiponectin/ADIPOQ）介导的跨细胞调控机制发挥作用。具体而言，Decorin可能通过调控转化生长因子-β（transforminggrowthfactorbeta、TGF-β）信号通路（表现为p-Smad2/3水平上调），而Adiponectin则可能通过AMPK-mTOR信号轴（磷酸化水平变化）协调多种免疫细胞群体的功能。图3-13Other细胞因子家族的差异基因表达调控特征。（A）Other家族的差异基因平均表达热图；（B）Other家族细胞因子的一致性调控。Figure3-13CharacterizationofdifferentialgeneexpressionregulationoftheOthercytokinefamily.(A)HeatmapoftheaverageexpressionofdifferentialgenesoftheOtherfamily;(B)ConsistentregulationofComplementfamilycytokines.3.3细胞因子的互作特异性首先从整体上绘制细胞通讯网络（图3-14A,图3-14B）。从图中不难看出只有Endothelial（内皮细胞）和Basophils(噬碱性粒细胞)表现出独特的连接特性，可以和所有细胞类型有互作。其次，为进一步解析细胞因子对细胞互作的调控作用，通过计算各处理组相对于PBS对照的细胞互作强度变化，绘制了细胞因子基于细胞互作强度变化热图（图3-15）。从图中发现了双向特异性细胞通讯对：IL15对CD8+T细胞到cDC1s的互作有显著增强作用；IFN-α1对cDC1s到CD8+T细胞的互作有显著增强。图3-14整体细胞通讯网络。（A）全体细胞细胞通讯弦图；（B）细胞通讯强度热图。Figure3-14Integralcellularcommunicationnetwork.(A)Chorddiagramofcellularcommunicationinwholecells;(B)Heatmapofcellularcommunicationstrength.图3-15细胞因子对细胞互作强度的影响。Figure3-15Influenceofcytokinesonthestrengthofcellularinteractions.为深入解析特异性细胞通讯对互作的分子基础，分别对IL15和IFN-α1互作通路计算贡献值，并可视化。在IL15处理下的受体-配体气泡图中（图3-16A）找到CD8+T细胞到cDC1s的互作对应的信号最强的通路为Mif,通过计算Mif通路中受配体的贡献值（图3-16B）可以发现，Mif-（Cd74+Cd44）是其中贡献程度最高的受配体对。进一步将Mif-（Cd74+Cd44）映射到细胞互作网络上（图3-16C），可以看到，网络中CD8+T细胞到cDC1s的互作是最强的。从IFN-α1的相关分析结果（图3-17A）可以发现：Lgals9信号通路在cDC1s到CD8+T细胞的通讯中表现出最强的互作强度，并且，Lgals9-Cd45对Lgals9的贡献程度最大（图3-17B），在细胞通讯网络中可视化该受配体对（图3-17C），网络中除了cDC1s到CD8+T的互作较强以外，Treg到CD4+T细胞以及cDC1s到CD4+T细胞的互作也非常明显。在IFN-α1处理下，cDC1s和CD8+T细胞的双向互作中Mif和Lgals9信号通路的受配体互作均有显著的上升（p<0.05）。图3-16IL-15作用的细胞通讯。Figure3-16CellularcommunicationbyIL-15.图3-17IFN-α1作用的细胞通讯。Figure3-17CellularcommunicationbyIFN-α1.在IL-15和IFNα1特异的双向网络中，配体、受体基因的表达与对应细胞因子的处理相关：Mif作为配体基因在CD8+T细胞高表达，Cd74和Cd44则在受体细胞cDC1s中表达；Lgals9在配体细胞里高表达。并且，Mif基因在CD8+T细胞中均高表达，可能在双通讯网络中，Mif都有参与调节CD8+T细胞的功能。（图3-18）图3-18IFN-α1和IL-15作用下的配体-受体表达气泡图。Figure3-18Ligand-receptorexpressionbubbleplotinthepresenceofIFN-α1andIL-15.3.4细胞因子的时序依赖性调控为揭示细胞因子对于细胞命运的精准调控，对于所占比重较大的三种细胞类型（B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞）分别划分亚型。在此基础上使用Slingshot进行拟时序分析，并对细胞因子在每条分化轨迹上对细胞分化的影响做了可视化和显著性检验。3.4.1细胞因子对B细胞的时序性调控将B细胞分为7个细胞亚群：B_naïve（初始B细胞）,B_memory（记忆B细胞）,B_activated（活化B细胞）,B_germinal_center（生发中心B细胞）,B_pre_GC（前生发中心B细胞）,B_follicular（滤泡外B细胞）,B_prolif（增殖B细胞），拟时序分析后得到三条分化轨迹（图3-18A），分别对三条分化轨迹进行可视化并分析细胞因子对其作用。在第一条轨迹依次经历B_naïve、B_activated、B_memory、B_germinal_center、B_follicular（图3-19B，图3-19C）。Interferon家族的IFNa1、IFNb、IFNe和IFNg,Commonγchain家族的IL15以及IL-1家族的IL18都在B_memory的出现高表达（图3-18C,图3-18D）；Commonβchain家族在B_memory分化成其他细胞的节点上高表达；而在分化初期，大部分细胞因子的分布情况和PBS组一致，尤其是Complement家族，虽然它在分化初期的分布显著增高，但经Kruskal-Wallis检验发现，其对拟时序的影响并不显著，可能是组成性表达通路。从细胞因子分布的整体上看，大多数细胞因子贯穿于整个分化流程，这可能与B细胞群体对多个细胞因子家族都有强烈响应有关。此外，其他细胞因子家族通过特异性调控分化方向：例如，IL-13驱动B细胞向滤泡外B细胞分化。第二条轨迹为：B_naïve、B_activated、B_memory、B_pre_GC（图3-19B,图3-19C）。轨迹的前三个节点和第一条轨迹一致。B_pre_GC出现时，对轨迹影响最大的是Commonβchain家族的GM-CSF，而B_activated向下一个细胞类型分化时并没有出现特定细胞因子的高表达（图3-19C,图3-19D）。第三条轨迹：B_naïve、B_prolif（图3-20B,图3-20C）。影响B_naïve向B_prolif分化的细胞因子主要是Complement家族和TNF家族(图3-20C,图3-20D)，且IL-4的作用更明显。综上，Complement家族在B细胞分化初期是不可缺少的，而其他家族细胞因子的共同作用使得初始B细胞分化出不同的B细胞类型。这些发现表明，B细胞分化是由补体系统的早期支持、干扰素的全局调控以及其他细胞因子的特异性信号共同协调的复杂过程。图3-19B细胞拟时序分析——轨迹1。（A）B细胞拟时序分析图；（B）轨迹1的UMAP图;(C)轨迹1中细胞类型和细胞因子家族的联合密度图;(D)细胞因子在拟时序中的分布。Figure3-19TrajectoryAnalysisinBcell——Lineage1.(A)TrajectoryAnalysisinBcell;(B)UMAPplotoflineage1;(C)Jointdensityplotofcelltypesandcytokinefamiliesintrajectory1;(D)distributionofcytokinesinthepseudo-time.图3-20B细胞拟时序分析——轨迹2。（A）B细胞拟时序分析图；（B）轨迹2的UMAP图;(C)轨迹2中细胞类型和细胞因子家族的联合折线图;(D)细胞因子在拟时序中的分布。Figure3-20TrajectoryAnalysisinBcell——Lineage2.(A)TrajectoryAnalysisinBcell;(B)UMAPplotoflineage2;(C)Jointlinegraphofcelltypesandcytokinefamiliesintrajectory2;(D)Distributionofcytokinesinthepseudo-time.图3-21B细胞拟时序分析——轨迹3。（A）B细胞拟时序分析图；（B）轨迹3的UMAP图;(C)轨迹3中细胞类型和细胞因子家族的联合密度图;(D)细胞因子在拟时序中的分布。Figure3-21TrajectoryAnalysisinBcell——Lineage3.(A)TrajectoryAnalysisinBcell;(B)UMAPplotoflineage3;(C)Jointdensityplotofcelltypesandcytokinefamiliesintrajectory3;(D)Distributionofcytokinesinthepseudo-time.3.4.2细胞因子对CD4+T细胞的时序性调控对CD4+T细胞进行亚群注释，得到五个细胞亚群：CD4_Tn（初始CD4+T细胞）,CD4_Teff（效应CD4+T细胞）,CD4_Th17（Th17细胞）,CD4_Th3（Th3细胞）,CD4_Tcm（中央记忆CD4+T细胞）。使用Slingshot构建拟时序轨迹后，得到两条分化轨迹(图3-21A)。第一条轨迹为：CD4_Tn、CD4_Th17、CD4_Th3、CD4_Tcm（图3-21B,图3-21C）。在分化初期，所有细胞因子共同发挥作用，刺激初始CD4+T细胞分化为Th17细胞；生长因子家族、干扰素和白细胞介素-17一