《食品毒理学》实验指导

《食品毒理学》实验指导

实验一半衰期的测定•比色法测定水杨酸钠的血浆半衰期

实验二血液红细胞、白细胞计数

实验三四氯化碳对肝脏谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）

的影响实验

*所需实验仪器：电子天平、pH计（试纸）、显微镜、分光光度计、灌胃针头、（小）/

（大）离心机、注射器。

实验一半衰期的测定•比色法测定水杨酸钠的血浆半衰期

一、原理、目的

药物血浆半衰期2即血浆药物浓度下降一半所需的时间。绝大多数药物是按一级动力学规律消除(恒

比消除)，因此每种药物都有固定的旧，不因血浆浓度高低而改变。本实验用分光光度法测定水杨酸钠的

血浆浓度并计算口小水杨酸钠为抗炎药，经肝代谢，在酸性环境中与.三氯化铁生成一种紫色的络合物，

在520nm波长下比色，其光密度与水杨酸浓度成正比。

通过测定水杨酸钠的血浆半衰期，使学生了解水杨酸钠在体内的消除速度，并掌握其血浆半衰期的

测定方法。半衰期是判断毒物蓄积程度的重要参数，对中毒和解毒有一定的实践意义。

二、试剂、器材及动物

离心管、试管、磅秤、玻璃棒、注射器、吸管、离心机、721型分光光度计；三氯醋酸、水杨酸钠、

三氯化铁：兔。

三、方法步骤

1、取离心管和试管各5支，分别标为1〜5号，备用。5支离心管各加入10%三氯醋酸7ml。

2、取兔1只，称体重，从耳静脉取血2ml置入1号离心管，用玻璃棒搅拌。然而自耳静脉注入10%

水杨酸钠(剂量为150mg/kg),并立即和60min后两次自另一耳静脉取血2mL分别注入2、3号离心管中,

搅拌。4、5号离心管分别加入蒸储水和0.02%水杨酸钠2ml。

3、取上述5支离心管进行离心(2000r/min,5min),准确吸取上清液6ml放入编号相对应的试管中，

分别滴入10%三氯化铁12滴(0.6ml)摇匀5min后比色。

4、用721型分光光度计520nm波长比色，以4号管调“0”，读得5号管光密度为x,再以1号管调

“0”，读得2号管为xi，3号管为X2,将上述操作归纳为下表：

水杨酸钠血浆半衰期的测定

试管名编号二氯醋酸兔血0.02%水杨酸钠水离心上清液三氯化铁

(ml)(ml)(ml)(ml)(ml)(git)

对照172————612

立即272——612

60min372————612

空白47————2612

标准57—2—612

5、计算半衰期

①求k值：k=y/x;y=0.02

②求水杨酸钠血浓度：给药后立即血浓度yi=kxi：给药后60min血浓度y2=kx?。

③根据下列公式求半衰期：

0.301

tl/2=

0gyi-igy2)/t

四、结果

结果测定

5号管光密度(x)2号管光密度(XI)3号管光密度(x2)tl/2

实验二血液红细胞、白细胞计数

A【红细胞计数】

红细胞计数（redbloodcellcount,RBC）是指计算每升血液内所含红细胞的数目。红细胞计数

的方法有显微镜计数法、血沉管计数法、光电比色法、血细胞电子计数器计数法等。目前在临床上

使用最广泛的是显微镜计数法（计数板法）。

一、原理

血液经稀释后，充入血细胞计数板，用显微镜观察，计数一定容积内的红细胞数并换算成每贝

内的数目。

二、器材

1、改良式血细胞计数板：临床上最常用的是改良纽巴（Neubauer）氏计数板，它是由一块特制

的玻璃板构成，玻璃板中间有横沟将其分为三个狭窄的平台，两边的平台较中间的平台高01mm。

中央平台又有一纵沟相隔，其上各刻有一个计数室。每个计数室划分为9个大方格，每一大方格面

积为l.Omn?,深度为0.1mm；四角每一大方格划分为16个中方格，为计数白细胞川。中央一大方

格用双线划分为25个中方格，每个中方格又划分为16个小方格，共计40）个小方格，此为"细胞

计数之用。

2、血盖片：专用于计数板的盖

（•）iEA<4

玻片呈长方形，厚度为0.4mm。

3、沙利氏（shali）吸血管或红

细胞稀释管，5ml吸管、中试管。（c）放入后的力格网计敷室

4、显微镜，计数器等。*芦

5、稀释液:0.85%氯化钠溶液。辑

11

f1

（d）放大后的计教室

血球叶数板的构造

三、方法

试管稀释法

用5ml吸管吸取红细胞稀释液3.98ml（或4ml亦可）置于试管中。用沙利氏吸血管吸取全血样

品至2（刎刻度处（或吸血至刻度10处，红细胞稀释液用2ml）。擦去吸管外壁多余的血液，将此血

液吹入试管底部，再吸、吹数次，以洗出沙利氏管内粘附的血细胞，然后试管口加塞，颠倒混合数

次，再用毛细吸管（或玻棒）吸取已稀释好的血液，放于计数室与盖玻片接触处，即可自然流入计

数空中。注意充液不可过多或过少，过多则溢出而流入两侧槽内，过少则计数池中形成气泡，致使

无法计数。

计数时，先用低倍镜，光线要稍暗些，找到计数室的格后，把中央的大方格置于视野之中，然

后转用高倍镜。在此中央大方格内选择四角与最中的五个中方格（或用对角线的方法数五个中方格）,

每个中方格有16个小方格,所以共计数80个小方格。计数时注意压在左边双线上的红细胞计在内,

压在右边双线上的红细胞则不计数在内：同样，压在上线的计入，压在下线的不计入，此所谓嗷左

不数右，数上不数下”的计数法则。

四、计算

R/8（）x4（X）x2（X）x10=1mm3血液中红细胞个数。

R—5个中方格（即80个小方格）内的红细胞总数。

4（X）—一个大方格，即Imn?面积内共有4（X）个小方格。

200-稀释倍数。

10—血盖片与计数板的实际高度是WOmm,乘10后则为10mm。

上式简化后为Rx10,000=红细胞数/mm，

推算后即：每升血液中的红细胞数M=RK10"200倍稀释）

五、注意事项

（1）红细胞计数是一项细致的工作，稍有粗心大意，就会引起计数不准。关键是防凝、防溶、

取样正确。取抗凝血时，抗凝剂的量要合适，不可过少使血液部分呈小块凝集；采血时应注意及时

将抗凝剂与血液混匀。防溶是指防止过分振摇而使红细胞溶解，或是器材用水洗后未用生理盆水冲

洗而发生溶血，使计数结果偏低。取样正确是指吸血10或20W一定要准确，吸血管外的血液要擦

去，吸血管内的血液要全部洗入稀释液中，稀稀液的用量要准；允液量不可过多或过少，过多可使

血盖片浮起，过少则计数室中形成小的空气泡，使计数结果偏低甚至无法计数。此外，显微镜台未

保持水平，使计数室内的液体流向一侧，这些操作上的错误均可使计数结果不准确。

（2）器材清洗方法：沙利氏吸血管或试管，每次用完后，先用清水吸吹数次，然后用蒸谣水、

酒精、乙醛，按次序分别吸次数次，干后备下次使用。血细胞计数板用蒸储水冲洗后，用绒布轻轻

擦干即可，切不可用粗布擦试，也不可用酒精、乙醛等溶液冲洗。

六、参考值

家兔：（5.87±0.32凶0n必

成人男性：（4.0-55）X10%；成人女性：（3.5—50X10既

B【白细胞计数】

白细胞计数(whitebloodcellcount,WBC)是指计算每升血液内所含白细胞的数目。白细胞计

数的方法有显微镜计数法和血细胞电子计数器计数法等。

一、原理用稀释液将红细胞破坏后，计算出每微升血中白细胞数。

二、器材1.0ml或0.5M刻度吸管，其他与红细胞计数同。

三、试剂白细胞稀释液可用1〜2%的冰醋酸液，内加II%结晶紫液I滴，以便与红细胞稀释

液区别。

四、方法

试管稀释法

用1ml吸管吸取白细胞稀释液0.38ml(也可吸0.4ml)置一小试管中。用沙利氏管吸取被检血

至20回处，擦去管外粘附的血液，吹入小试管中，反复吸吹数次，以洗净管内所粘附的白细胞，充

分振荡混合，再用毛细吸管或沙利氏吸血管吸取被稀释的血液，充入已盖好盖玻片的计数室内，静

置1〜2min,低倍镜检查。

将计数室四角四个大方格内的全部白细胞依次数完，注意压在左线和上线的计入，压在右线和

下线的不计入。

五、计算：

R/4x20x|0=白细胞数加

R—四角四个大方格内的白细胞总数。

R/4—一个大方格(面积为1mm?)内的白细胞数。

20—稀释倍数

10—血盖片与计数板的实际高度是1/10mm,乘10后则为1mm。

上式简化后为Rx50=白细胞数/可

推算后即：每升血液中的白细胞数M=Rx5xl0?(20倍稀择)

六、注意事项防止把尘埃异物与白细胞混淆，可用高倍镜观察：白细胞有细胞核的结构，而

尘埃异物的形状不规则，无细胞结构。

七、参考值

家兔：(9.48±1.12)x10%：

成人：(4-l0)X109/L；

实验三四氯化碳对肝脏谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)

的影响实验

一、目的要求

通过本实验使学生掌握四氯化碳对肝脏谷丙转氨酹(GPT)两氨酸氨基转移陋(ALT)和谷草转

氨酶(GOT)/门冬氨酸氨基转移酶(AST)影响的测定方法。

二、原理

谷氨酸+丙酮酸弋GPT/AIT酮戊二酸+丙氨酹

以丙氨酸和a-酮戊二酸为基质，在一定条件下反应产生一定量的丙酮酸，加入1摩尔浓度酸后

酶反应终止，2,4•二硝基苯腓与丙酮酸作用生成丙酮酸2,人二硝基苯腺，在碱性条件下呈红棕色,

根据色泽深浅推算出的活力,虽然基质中剩余的a-酮戊二酸也能与2,4•二硝基苯脱生成苯朕，但

在500〜520nm波长下，丙酮酸2,小二硝基苯踪的显色强度约为a.酮戊二酸2,4-二硝基苯踪的3

倍，且a-酮戊二酸的用量较少，利用这一差别可以反映丙酮酸的生成量。

谷氨酸+草酰乙酸.GOT7AST衿一酮戊二酸+门冬氨酸

以门冬氨酸和*酮戊二酸为基质，在一定条件下反应产生一定量的草酰乙酸，草酰乙酸在反应

过程中又自行脱按成为丙酮骏，余下与2,4•二硝基苯腓的显色原理同ALT。

三、试剂与器材及动物

1.踊

⑴磷酸盐缓冲液(O.lmol/L，pH7.4)：取甲液420ml和乙液80mL混合均匀即得。

①甲液(O.lmol/L磷酸二氢钠)：取NaH2PO"12H2O35.82g,加蒸储水溶解后稀释至KXXhnlo

②乙液(0.1mol/L磷酸二氢钾)：取无水KH2Po413.61g,加蒸镯水溶解后稀释至1000ml。

⑵丙酮酸钠标准液(2mmol/L)：在100ml磷酸盐缓冲液中溶解22.0mg丙酮酸钠。

(3)0.4mol/L氢氧化钠溶液:先配Imol/LNaOH{(称取NaOH40g,用蒸偏水溶解后稀稀至KXJOml

即得)，以Imol/LNaOH稀释配成0.4mol/LNaOH。

(4)SGPT基质液：精确称取DL-丙氨酸L79g和a-酮戊二酸29.2mg,放于l(X)n】l烧杯内，加入

少量(约15ml)磷酸盐缓冲液及少量ImobL的NaOH溶液使其溶解，并调pH至7.4,放入100ml容

品瓶内，用磷酸盐缓冲液定容，4℃冰箱保存，此液每升含a-酮戊二酸2mmol、丙氨酸2(X)mmol.

(5)SGOT基质液：在100ml的烧杯中加入29.2mga-酮戊二酸和2.66gDL-天门冬氨酸，再加入

足量的Imol/L氢氧化钠，配成溶液，用lmol/L氢氧化钠调节pH为7.4,移入l(X)mg容量瓶中，用

磷酸盐缓冲液定容，4℃温箱保存。此液每升含a-酮戊二酸2mm。1、天门冬氨酸200mmol。

(6)24二硝基苯朋液(Immol/L)：称取19.8mg24二硝基苯助，加lmol/L盐酸至100ml便之成

为溶液。盛了•棕色瓶内备用。

⑺50%四氯化碳植物油溶液。

2.器材

分光光度计、注射爵、试管、兔笼。

3.嫡

健康、未妊娠的家兔。

四、方法步骤

1.损伤兔肝脏取健康、未妊娠家兔以50%四氯化碳植物油溶液股内皮下注射(0.5ml/kg)

损害其肝脏。

2.制备血清取损伤肝24h后的家兔全血入干净试管中，静置后取其血清。同法制取健康家

兔的血清(对照)，均置入火箱保存待用。

3.标准曲线的绘制SGOT和SGPT不能用一个标准曲线，在作标准曲线时，应分别加入基质

液，按表1操作。

表1SGOT和SGPT标准曲线制作步骤单位：ml

试剂空白12345

O.lmol/L磷酸盐缓冲液0.100.100.100.100.100.10

丙酮酸钠标/液Qmmol/L)00.050.100.150.200.25

SGPT/SGOT基质液0.500.450.400.350.300.25

相当于丙酮酸实际含量(mol)00.100.200.300.400.50

相当于GPT活力(IU)0285797150200

相当于GOT活力(IU)02461114190

置37℃水浴中预热5min

24二硝基苯肿液0.500.500.500.500.500.50

置37℃水浴中保温20min

0.4mol/L氢氧化钠5.05.05.05.05.05.0

混匀，37c保温lOmin后取出，冷却全室温，寸T2()nm处进行比色,以蒸储水调“0”读取各

管光密度。将各管光密度减去“空白”管光密度，所得差值与其对应的旃活力单位数作图。标准曲

线应作2M套，求其均值较为理想。

4.测定鼠肝脏谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性

(1)取干净试管3支，各标以“肝损”、“正常对照”、“水对照”，分别准确加入SGPT基质液或

SGOT基质液各LOmlo

⑵将试管置于37℃恒温水浴中温热2〜3min。然后在“肝损”管中加入0.2ml肝损兔血清；在

“正常对照”管中加入0.2ml正常兔血清；在“水对照”管中加入0.2ml蒸储水。

(3)将上述3支