基于网络药理学探究淫羊藿防治宫颈癌分子机制

目录TOC\o"1-3"\h\u26577摘要 I14473Abstract II22777目录 3235651绪论 443741.1淫羊藿概述 4135361.2宫颈癌概述 4183721.3淫羊藿的主要化学成分 5326441.4淫羊藿中主要成分的抗癌作用机制 513881.5网络药理学概述 6125201.6研究目的与意义 6268252网络药理学及分子对接 8318332.1筛选淫羊藿活性成分和主要靶点 844842.2筛选宫颈癌相关靶点 877132.3筛选核心靶点 884142.4构建中药-成分-交集靶点网络图 8143612.5GO功能注释与KEGG通路富集分析 821772.6分子对接 9142543体外实验部分 10248073.1实验材料 10146363.1.1仪器 1030713.1.2药品与试剂 10149273.1.3细胞株 10199593.2实验方法 10159733.2.1实验药液制备 1054603.2.2细胞培养及分组 11226713.3WesternBlot法检测AKT1和MAPK1信号通路关键蛋白表达 11134973.4数据统计学处理 11299124实验结果 1292374.1网络药理学及分子对接 12161914.1.1药物主要成分和靶点以及疾病相关靶点 12194714.1.2绘制venny图 13163644.1.3筛选核心靶点 13137894.1.4构建中药-成分-交集靶点网络图 15159064.1.5GO和KEGG通路富集分析 1528084.1.6分子对接验证 18183534.2WesternBlot实验结果 23274654.2.1淫羊藿促凋亡时相关蛋白的表达 23268585讨论 255559结论 2716755参考文献 2832327致谢 35

1绪论1.1淫羊藿概述淫羊藿（EpimediumbrevicornuMaxim,EM）是小檗科植物REF_Ref3413\r\h[1]，其干燥叶片入药。《神农本草经》将其列为中品，别名仙灵脾。淫羊藿有多个品种，包括朝鲜淫羊藿、箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿以及柔毛淫羊藿等[2]，全世界大约有55种淫羊藿，主要分布在北非、黑海、喜马拉雅、中国和日本REF_Ref5813\r\h[3]。淫羊藿味辛甘、性温，归肝肾二经。其主要功效为补肾助阳、强筋健骨、祛风除湿等REF_Ref23055\r\h[4]，在临床中常用于改善阳痿遗精、腰膝痿软等肾虚症状，以及半身不遂、风湿痹痛等经络痹阻病症REF_Ref12269\r\h[5]。多项现代研究揭示，淫羊藿的黄酮类、生物碱类及挥发油等成分蕴含丰富药理活性。其不仅对心脑血管具有保护作用，还在提升免疫功能、抗炎、抗氧化、抗疲劳及抑制肿瘤发展等方面展现显著效果REF_Ref12919\r\h[6-REF_Ref4347\r\h9]。淫羊藿一般在夏秋季节采收，采割茎叶繁茂的植株，去除粗梗及杂质后阴干或晒干。炮制时可拣净杂质切丝，或通过炒制、酒炙炒增强药效。但阴虚火旺或相火易动者不宜使用REF_Ref23198\r\h[10]。此外，淫羊藿还可作为观赏植物，其资源保护和可持续利用也受到关注REF_Ref1247\r\h[11]。1.2宫颈癌概述宫颈癌（CervicalCancer,CC）作为全球高发恶性肿瘤REF_Ref23872\r\h[12]，在女性恶性肿瘤发病率统计中位列第二REF_Ref21184\r\h[13]，尤其在低收入和中等收入地区更为常见，对女性健康构成严重威胁REF_Ref20210\r\h[14]。据统计，全球每年宫颈癌新增确诊病例超50万，病死人数逾30万REF_Ref29851\r\h[15]。在中国，女性癌症患者群体中，宫颈癌的罹患率与病死率均处于高位REF_Ref30008\r\h[16]。临床上，医生依据国际妇产科联合会分期为癌患者选择合适的治疗方案，根据国际妇产科联盟2018年分期标准，IA2至IB2期及IIA1期的早期宫颈癌患者，临床多采用根治性子宫切除术进行治疗[17]。美国国家癌症研究所SEER数据库数据表明，在宫颈癌患者群体中，45岁以下育龄期女性占比达36%。相当比例的年轻宫颈癌患者存在生育保留需求，鉴于此，子宫切除术并非首选治疗策略REF_Ref30488\r\h[18]。探索新的宫颈癌的疗法和安全有效的抗宫颈癌药物，尤其是开发能靶向抑制宫颈癌细胞的药物对于医务工作者至关重要。中医药凭借协同增效与低不良反应的优势，在肿瘤治疗领域的应用日益广泛，已成为备受关注的研究热点REF_Ref30736\r\h[19-REF_Ref30749\r\h21]。1.3淫羊藿主要化学成分目前已从淫羊藿属植物中成功鉴定出约260种化学成分REF_Ref31102\r\h[22]，其主要成分包括生物碱、木脂素及黄酮类化合物等。黄酮类物质是淫羊藿发挥药效的关键成分REF_Ref31229\r\h[23]，包含淫羊藿苷、宝藿苷I、朝藿定A、B、C以及淫羊藿次苷II等典型化合物，这些活性成分共同构成了淫羊藿的物质基础，对阐明其药理机制具有重要意义。淫羊藿苷是其关键生物活性成分之一,具有保护骨、神经、生殖功能等药理作用REF_Ref1446\r\h[24]。此外，淫羊藿多糖作为其重要的活性成分，由多种单糖聚合而成，主要包含葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖和木糖等，这些成分共同构筑了淫羊藿的生物活性基础，对其药用价值的发挥具有重要意义REF_Ref31481\r\h[25]。在现代药理研究中，其展现出多元化的生物活性，在疾病防治与机体健康维护领域具有重要的研究价值与应用潜力REF_Ref31699\r\h[26REF_Ref31709\r\h27]。1.4淫羊藿中主要成分的抗癌作用机制研究证实，淫羊藿的关键成分淫羊藿素具备抗癌活性。作为黄酮类化合物的淫羊藿苷，在肠道内经过酶解代谢后可转化为淫羊藿素，二者共同构成了淫羊藿发挥药理作用的重要物质基础REF_Ref3967\r\h[28-REF_Ref3980\r\h29]。ITC有着广泛的药理活性，其药理研究集中在抗肿瘤REF_Ref4205\r\h[30-REF_Ref4209\r\h31]、骨保护REF_Ref4496\r\h[32]和抗炎REF_Ref4542\r\h[33]等领域。淫羊藿素也能够通过影响细胞内部的信号通路，促使肿瘤细胞自我毁灭，即凋亡，亦可经由细胞坏死途径引发死亡进程。淫羊藿素能够干预肿瘤生长和存活所依赖的信号通路，通过作用于AKT1、MAPK1等信号转导通路REF_Ref7330\r\h[34]。淫羊藿素能够通过诱导肿瘤细胞周期阻滞，抑制肿瘤血管新生，从而有效限制肿瘤的进展。具体而言，该成分可干扰肿瘤细胞的周期性活动，使其无法顺利完成增殖过程；同时，通过调控相关因子的表达，阻碍肿瘤血管的形成，切断肿瘤的营养供应途径，最终实现对肿瘤生长和扩散的抑制作用REF_Ref26499\r\h[35]。淫羊藿素能够抑制炎症介质的合成与释放，有效减轻炎症反应，从而阻断炎症介导的肿瘤恶化过程。此外，淫羊藿还能激活免疫细胞活性，增强机体对肿瘤细胞的免疫识别与杀伤功能，实现对肿瘤细胞的免疫监控与清除。淫羊藿素能够靶向作用于肿瘤干细胞，抑制其自我更新能力，从根源上遏制肿瘤的发生、发展及复发转移。1.5网络药理学概述网络药理学作为系统生物学驱动的前沿交叉学科，通过生物网络解析揭示疾病病理机制。可以从恢复或改善生物网络平衡的角度解析药物与机体的相互作用，具有“多靶点协同、多基因调控”特性REF_Ref2621\r\h[36]，其通过系统性整合调控机制，突破传统单靶点治疗局限，为临床精准干预策略开发提供理论支撑与实践依据。该学科利用计算机和高通量组学数据分析等技术，与中医整体观念及辨证施治理念高度契合，既传承中医理论精髓，又融入现代科学方法，对推动中药理论创新与临床实践发展具有重要意义。利用网络药物学方法，研究人员可以预测植物成分的去向，并通过实验验证，从而深入理解中药的治疗效果。1.6研究目的与意义本研究采用网络药理学和分子对接方法及体外实验，探索淫羊藿治疗宫颈癌的潜在分子机制。研究目标为识别淫羊藿的活性成分及其靶点，分析其对宫颈癌相关信号通路的影响，还通过体外实验测试淫羊藿对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响，为临床应用提供科学依据和理论支持。本研究旨在探索中药在现代医学中的价值，为宫颈癌治疗提供一种新思路。现有研究显示，超过60%的临床抗癌药物源自天然产物[37]，其中植物来源的化合物已超3000种被应用于癌症治疗[38]。相较于普通植物化合物，生物活性分子展现出更为显著的抗癌效能[39]，这使得天然产物抗癌研究成为学术界关注焦点。基于此，本研究着重探究淫羊藿的抗肿瘤特性，以期为抗癌药物研发提供新方向。淫羊藿首载于《\t"/item/%E6%B7%AB%E7%BE%8A%E8%97%BF/_blank"神农本草经》，有着上千年的用药史REF_Ref11008\r\h[40]。中国是其地理分布中心，拥有40个品种，其中15个种类形成药材商品，是《中华人民共和国药典》2015年版收录的关键物种之一REF_Ref11279\r\h[41]。淫羊藿在医药领域应用广泛，其具备多重药理活性[42]，该药材对骨骼、神经系统、心血管系统及免疫系统具有显著保护作用，同时可调节生殖机能。临床上，淫羊藿常被用于骨质疏松症、不孕症、健忘症、老年功能障碍、心血管疾病REF_Ref11439\r\h[43]、勃起功能障碍REF_Ref11488\r\h[44]、焦虑抑郁、激素紊乱REF_Ref11530\r\h[45]、炎症REF_Ref11592\r\h[46]及肿瘤等REF_Ref11625\r\h[47]。在肝癌治疗中，淫羊藿提取物可抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡REF_Ref11690\r\h[48]。在甲状腺癌治疗中，可诱导细胞凋亡，抑制癌细胞活性REF_Ref11755\r\h[49]。在食管癌治疗中，可增强裸鼠的Fas-FasL蛋白表达，抑制食管癌细胞生长并诱导凋亡REF_Ref11798\r\h[50]，在膀胱癌的治疗进程中，该物质能够有效调控关键蛋白表达，发挥抗癌作用。其主要可抑制细胞增殖核抗原（PCNA）的蛋白合成，降低Bcl-2蛋白水平，同时提升Bax蛋白表达量，通过这种协同作用，诱导膀胱癌细胞走向程序性死亡，进而达到抑制肿瘤发展的目的REF_Ref11827\r\h[51]。还可通过诱导肿瘤细胞CD54和CD18表达，增加细胞对细胞因子诱导杀伤细胞的敏感性REF_Ref11876\r\h[52]。然而，淫羊藿治疗宫颈癌相关研究很少，其机制不明。本研究基于网络药理学和分子对接及体外实验，结合中医多通路、多成分、多靶点协同作用的特点，探索淫羊藿治疗宫颈癌的潜在药理和分子机制，为淫羊藿在宫颈癌临床治疗中的应用提供理论基础和思路。2网络药理学及分子对接2.1筛选淫羊藿活性成分和主要靶点本研究借助中药系统药理学TCMSP数据库（/tcmsp.php），对淫羊藿的活性成分展开筛选工作，类药性（DrugLikeness,DL）和口服生物利用度（OralBioavailability,OB）是评价药物在体内有效利用的关键指标。设定阈值为OB≥30，DL≥0.18，筛选淫羊藿的主要成分，并收集其相关靶点，统一转换为GeneSymbol。2.2筛选宫颈癌相关靶点以“CervicalCancer”作为检索词，在GeneCards（https:∥/）和OMIM（https:∥/）数据库中进行检索，获取宫颈癌相关靶点信息，并将其保存，以备后续研究使用。2.3筛选核心靶点探究药物与疾病相关靶点的联系，先将前期获取的相关靶点数据，导入至在线分析工具Venny2.1.0（b.csic.es/tools/venny/）。利用该工具交集分析功能，筛选出药物与疾病的共有靶点。随后，把得到的交集靶点信息，提交至STRING数据库（https:∥/），设置物种为“人类”（Homosapiens），置信度设阈值＞0.9，并隐藏无关靶点，生成PPI网络结构图。随后导入Cytoscape3.9.0软件，利用NetworkAnalyzer模块分析网络图，依据节点的度数和中介中心度值筛选关键基因。2.4构建中药-成分-交集靶点网络图为深入探究淫羊藿活性成分和宫颈癌靶点的关联，将淫羊藿的主要成分和靶点数据输入Cytoscape3.8.2软件开展可视化剖析。基于Degree值对网络图进行解析与可视化处理，构建出包含中药成分以及交集靶点的关系网络图。2.5GO功能注释与KEGG通路富集分析借助DAVID数据库（https:∥/）与微生信平台（https:∥/），进行基因本体（GO）功能及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路的富集分析。将交集靶点上传至Metascape网站，以H.Sapiens为物种进行CustomAnalysis，设置p值＜0.01，MinOverlap为3，MinEnrichment为1.5。通过这些分析，明确淫羊藿治疗宫颈癌的潜在作用靶点的生物学功能及参与的通路,进而预测其治疗宫颈癌的可能机制。2.6分子对接首先，于PDB数据库（/）内检索核心靶点的晶体结构，筛选含有配体且分辨率较低的蛋白质结构，在PubChem（/）数据库中获取淫羊藿主要活性成分的小分子配体的2D结构。运用Chem3D软件把2D结构转化为3D结构，将其以SDF格式存储。接着，执行能量最小化操作，再把处理后的结构以Mol2格式保存。之后，利用AutoDockVina软件开展分子对接实验。并借助DiscoveryStudio2019Client软件展示3D和2D图。

3体外实验部分3.1实验材料3.1.1仪器THC-20B型数控超声波提取机太阳集团tyc5997（中国）股份有限公司LE204E/02电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司旋转蒸发仪上海亚荣MCO-15ACCO2培养箱上海巴玖科学仪器有限公司酶标仪上海闪谱生物科技有限公司显影仪深圳市矢量科学仪器有限公司3.1.2药品与试剂淫羊藿哈尔滨三棵树药材市场BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天生物科技有限公司ECL荧光显色试剂碧云天生物科技有限公司PBS试剂碧云天生物科技有限公司细胞凋亡试剂盒碧云天生物科技有限公司DMEM培养基HyClone公司胰蛋白酶HyClone公司AKT1RabbitMonoclonalAntibody一抗PI3K（Erk2）RabbitPolyclonalAntibody（KOValidated）一抗GoatAnti-rabbitIgG/HRPantibody二抗碧云天生物科技有限公司3.1.3细胞株宫颈癌Hela细胞上海富衡生物科技有限公司，FH03093.2实验方法3.2.1实验药液制备将淫羊藿叶片洗净后粉碎，过10-20目筛。加入70%-80%的乙醇，加热回流提取2-4次，每次2-3小时。完成提取后进行过滤，合并所得滤液，经减压浓缩直至无酒精气味。随后，添加适量水稀释，静置后再次过滤，便可得到淫羊藿提取液。3.2.2细胞培养及分组从液氮罐中取出Hela细胞，在37℃温水浴中快速复温解冻，将细胞置于添加了1%青霉素-链霉素混合液、10%胎牛血清的DMEM培养基内，于37℃且二氧化碳浓度为5%的标准环境下培养。待细胞充分贴壁，使用胰酶消化进行传代处理，将生长良好的对数期Hela细胞以每孔2mL的量接种到6孔板，培养24h后分组，设置未处理的细胞为对照组，实验组分别用低、中、高剂量的淫羊藿浸出液处理Hela细胞。3.3WesternBlot法检测AKT1和MAPK1信号通路关键蛋白表达先从各组细胞中提取总蛋白，再用BCA试剂盒精确检测其浓度。随后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，再将分离后的蛋白质转移到PVDF膜上。为降低非特异性结合，将膜浸入含5%脱脂乳粉的TBST封闭液中，室温条件下，将膜置于摇床上低速振荡，封闭2小时。封闭结束，向膜内添加按1:500稀释的AKT1、MAPK1抗体，随后将膜放入4℃冰箱，孵育过夜，促进抗体充分结合。次日，取出膜用TBST溶液清洗，再加入稀释至1:2000的二抗，室温下孵育2小时。完成孵育后，多次用TBST洗涤膜，直至膜洁净，最后利用ECL化学发光液使蛋白质条带显影。最终，以β-actin为内参，利用成像分析系统扫描蛋白条带，测定其灰度值，从而量化目标蛋白的表达水平。3.4数据统计学处理所有实验结果均取至少三次独立实验的平均值。数据处理与分析采用IBMSPSSStatistics21软件完成，并以均值±标准误差(±s)表示。组间差异性通过t检验评估，当（P<0.01）时，认为两组间存在显著差异。4实验结果4.1网络药理学及分子对接4.1.1药物主要成分和靶点以及疾病相关靶点本研究共搜集到23种淫羊藿的主要成分，其中Magnograndiolide的OB值最高（63.71%），IcarisideA7的DL值最高（0.86）。按OB值降序排列的成分（见表1）。进一步收集淫羊藿的相关靶点，去除重复项后共得198个靶点。同时，在Genecard数据库中检索到宫颈癌相关靶点6314个。表1淫羊藿主要活性成分MolIDMoleculeNameOB(%)DLMOL000622Magnograndiolide63.710.19MOL004367olivil62.230.41MOL0043886-hydroxy-11,12-dimethoxy-2,2-dimethyl-1,8-diox0-2,3,4,8-tetrahydro-1H-isochromeno[3,4-h]isoquinolin-2-ium60.640.66MOL004382YinyanghuoA56.960.77MOL0043961,2-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-1,3-diol52.310.22MOL004386YinyanghuoE51.630.55MOL0043918-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenyl-chromone48.540.25MOL000098quercetin46.430.28MOL004384YinyanghuoC45.670.5MOL004373Anhydroicaritin45.410.44MOL001645Linoleylacetate42.10.2MOL000422kaempferol41.880.24MOL004394Anhydroicaritin-3-0-alpha-L-rhamnoside41.580.61MOL004425Icariin41.580.61MOL004380Homoerythrinan,1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-,(3.beta.)39.140.49MOL0035428-Isopentenyl-kaempferol38.040.39MOL00151024-epicampesterol37.580.71MOL001771poriferast-5-en-3beta-0l36.910.75MOL000359sitosterol36.910.75MOL000006luteolin36.160.25MOL003044Chryseriol35.850.27MOL001792DFV32.760.18MOL004427IcarisideA731.760.864.1.2绘制venny图将淫羊藿靶点与宫颈癌靶点上传至在线平台上，生成Venny图（见图2），最终筛选出173个交集靶点。图2Venny图4.1.3筛选核心靶点将交集靶点上传至STRING网站，构建PPI网络图（见图3），得到172个节点，628条边，平均节点度值为3，平均局部集聚系数为0.393，p-value＜1.0e-16。利用Cytoscape3.8.2进一步构建交集靶点的网络图（见图4）。图中，内圈、颜色深、形状大的节点Degree值高，可能是淫羊藿治疗宫颈癌的关键靶点。在这些靶点中，AKT1、TP53、MAPK1等靶点的Degree值各异。具体而言，AKT1的Degree值为39，TP53、MAPK1的Degree值均为36，JUN的Degree值是35，ESR1为31，JUN为26，RELA为24，MAPK14为23，FOS、MAPK8的Degree值同为22，CDKN1A的Degree值也是22。图3PPI网络图4交集靶点的网络图注：越在内圈，颜色越深，形状越大，Degree值越大4.1.4构建中药-成分-交集靶点网络图依据网络药理学理论，筛选出淫羊藿的主要活性成分，并借助Cytoscape3.8.2软件进行可视化分析（见图5），图中，黄色圆圈标识淫羊藿的主要活性成分，红色圆圈代表淫羊藿，靶点以绿色长方形标识。节点形态大小与色彩深浅直观反映Degree值，尺寸越大、颜色越浓，对应Degree值越高。此次分析共得到195个节点、411条边，其中MOL000098（Quercetin）的Degree值最高为128，其次，MOL000006（木犀草素）值为52，MOL000422（山柰酚）值为49，MOL004373（脱水淫羊藿素）值为30。图5淫羊藿-成分-靶点网络图注：以红色圆圈表征中药淫羊藿，黄色圆圈标识其核心活性成分，绿色长方形代表靶点。节点的色泽深度与形态尺寸正比于Degree值，颜色越深、形状越大，对应Degree值越高。4.1.5GO和KEGG通路富集分析对173个交集靶点开展基因本体（GO）功能及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集解析，绘制前20个靶点气泡图（见图6-9）。图6GO分析中BP前20气泡图图7GO分析中MF前20气泡图图8GO分析中CC前20气泡图图9KEGG分析中前20气泡图4.1.6分子对接验证进一步探究淫羊藿治疗宫颈癌的活性，配体与受体结合能越小，结合稳定性越高。当结合能呈负值时，意味着配体与受体可自发结合。本研究选择Quercetin与核心靶点TP53、AKT1、JUN、MAPK1、RELA、ESR1、MAPK14、FOS、MAPK8、CDKN1A进行对接打分，结果均小于-6kcal/mol。其中，RELA与Quercetin的对接打分最低（Affiffiffinity为-9.2kcal/mol），而FOS与Quercetin的对接打分最高（Affiffiffinity为-6.5kcal/mol），具体对接打分如下（见表2）。最后，利用DiscoveryStudio2019Client软件展示对接结果的3D和2D图（见图10A-J）。表2Quercetin对接打分TargetsPDBIDAffinity(kcal/mol)TP535hmk-8AKT13os5-8.7JUN3ptg-8.4MAPK15k4i-8.6RELA3rc0-9.2ESR15acc-7.6MAPK14lozl-8.4FOS5fv8-6.5MAPK84glw-7.9CDKN1A5oai-6.9图10Quercetin与TP53、RELA、MAPK14、MAPK8、MAPK1、JUN、FOS、ESR1、CDKN1A、AKT1的对接图像。A：Quercetin与TP53；B:Quercetin与RELA；C:Quercetin与MAPK14；D:Quercetin与MAPK8；E:Quercetin与MAPK1；F:Quercetin与JUN；G:Quercetin与FOS；H:Quercetin与ESR1；I:Quercetin与CDKN1A；J:Quercetin与AKT1。表3分子对接的相互作用参数TargetsHydrogenbPi-AIKylPi-SigmaPi-PiTP53GLN-72LYS-51LEU-54TYR-67TYR-67ARG-208RELAARG-358LEU-205LEU-362GLU-360THR-307LEU-171MAPK14LEU-104ALA-51THR-106VAL-38THR-106TYR-35LYS-53LEU-104LYS-53MAPK8LYS-55GLU-73ARG-69ARG-69MAPK1ALA-52GLU-71VAL-39ILE-31LEU-156ASP-167CYS-166ASP-111ILE-31LYS-54VAL-78JUNGLU-147MET-149VAL-196ALA-91ILE-70LEU-206ASP-150ILE-70LEU-206FOSARG-28ARG-16ALA-21ALA-21LYS-11LYS-14ESRIPRO-324PRO-324ARG-394ILE-326TRP-393PRO-325GLU-353CDKNIAILE-19ILE-19LEU-54HIS-96GLN-24ASN-265AKT1TYR-335ILE-223ALA-226TRP-352ASN-296HIS-2964.2WesternBlot实验结果4.2.1淫羊藿促凋亡时相关蛋白的表达通过体外实验检测淫羊藿对Hela细胞中促凋亡相关蛋白指标AKT1和MAPK1表达的调控作用，结果显示，淫羊藿显著抑制AKT1蛋白的表达，显著激活MAPK1蛋白的表达（P<0.01），且呈剂量依赖性（见表4、图11、图12）。淫羊藿能双向调节Hela细胞关键信号通路，这表明淫羊藿可通过调控AKT1和MAPK1信号网络发挥抗肿瘤作用。表4淫羊藿对Hela细胞中相关蛋白表达情况影响（±s，n=3）组别AKT1（相对表达量）MAPK1（相对表达量）空白组(0μg/mL)1.00±0.081.00±0.07低剂量组(300μg/mL)0.82±0.07**1.28±0.09**中剂量组(500μg/mL)0.61±0.06**▲▲1.55±0.11**▲▲高剂量组(700μg/mL)0.45±0.05**▲▲▼▼1.85±0.14**▲▲▼▼注：与空白组相比，**P<0.01；与低剂量组相比，▲▲P<0.01；与中剂量组相比，▼▼P<0.01图11不同剂量淫羊藿WesternBlot实验结果图图12淫羊藿对AKT1、MAPK1蛋白表达量统计图5讨论宫颈恶性肿瘤是严重威胁全球女性生殖系统健康的恶性疾患，其流行病学特征和临床防治现状始终是医学界关注的焦点问题REF_Ref5021\r\h[53]。世界卫生组织国际癌症研究机构最新统计数据显示，该疾病在全球范围内的疾病负担呈现持续增长态势，在发展中国家，宫颈恶性肿瘤的年龄标化发病率明显高于发达国家[54]。该疾病不仅会对患者生理机能造成永久性损害，还会引发一系列心理及社会问题，同时也给医疗卫生体系带来沉重经济负担[55]。我国作为人口大国，宫颈恶性肿瘤的防治形势尤为严峻REF_Ref6148\r\h[56]。国家癌症中心最新肿瘤登记年报数据显示，在我国女性恶性肿瘤发病情况中，该疾病处于高发位置，其年龄标化发病率与死亡率均大幅高于全球平均水平[57]。流行病学调查显示，近年来该疾病的发病年龄呈现明显的年轻化趋势，这与性行为模式改变、HPV感染率上升等因素密切相关REF_Ref7601\r\h[58]。这一流行病学特征的变化，使得临床治疗面临更多挑战，特别是对于有生育需求的患者群体。在临床诊疗规范方面，目前国际上普遍采用国际妇产科联盟制定的分期系统作为治疗决策的主要依据。目前，根治性子宫切除术辅以淋巴结清扫仍是早期患者的常规治疗手段REF_Ref9645\r\h[59]。但临床观察显示，约三成患者处于生育年龄，且生育需求尚未满足，这使得传统手术方案的适用性受到限制REF_Ref10413\r\h[60]。虽然保留生育功能的手术方式如宫颈广泛切除术等已在临床开展，但此类手术易引发术后妊娠风险，导致流产、早产等不良的后果REF_Ref11086\r\h[61]。这一临床困境促使研究人员必须探索更为精准的治疗策略。在肿瘤治疗领域，传统中医药因其独特的理论体系和丰富的临床经验，正逐渐受到国际医学界的重视REF_Ref11432\r\h[62]。与现代化学合成药物相比，中药复方凭借多组分、多作用靶点及整体调理的特性，在复杂病症的防治中彰显出独特价值REF_Ref11713\r\h[63]。据统计，目前临床应用的抗肿瘤药物中，超过半数的先导化合物来源于天然植物提取物REF_Ref12578\r\h[64]。值得关注的是，经证实超三千种植物活性成分具有潜在抗肿瘤功效[65]，为创新抗肿瘤药物研发构筑了重要资源基础。本研究选取传统中药淫羊藿作为研究对象，淫羊藿在我国药用历史源远流长。其最早见于东汉《神农本草经》[66]，被列为中品药材，亦收录于现代《中华人民共和国药典》[67]。现代药理研究显示，该药材富含黄酮、生物碱、多糖等多种活性成分[68]。这些活性成分通过复杂的协同作用，表现出广泛的药理活性，在骨质疏松、神经退行性疾病等慢性病症的防治中，亦展现出显著疗效，在抗肿瘤领域也展现出巨大潜力REF_Ref14260\r\h[69]。已有实验证据表明，淫羊藿提取物可通过调控多种信号通路，调控肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及转移等恶性表型REF_Ref14540\r\h[70]。本研究采用整合生物信息学与实验科学的研究策略，系统探索淫羊藿抗宫颈恶性肿瘤的作用机制REF_Ref14808\r\h[71]。采用网络药理学技术，构建活性成分、潜在靶点与信号通路的关联网络。经拓扑分析，成功筛选出多个核心靶点蛋白，筛选出的核心靶点涵盖AKT1、MAPK1等调控细胞增殖与凋亡的关键信号分子REF_Ref15128\r\h[72]。进一步的蛋白质免疫印迹分析证实，淫羊藿能双向调节Hela细胞关键信号通路，显著抑制AKT1，明显激活MAPK1。该提取物确实可以调控相关蛋白的表达水平，这些发现与前期生物信息学预测结果具有高度一致性。这种将计算预测与实验验证相结合的研究范式，为解析中药多效作用机制开辟了新路径REF_Ref15938\r\h[73]。通过系统生物学的方法，可以更全面地理解中药多组分、多靶点的作用特点，克服传统研究方法的局限性REF_Ref16242\r\h[74]。本研究不仅深化了对淫羊藿药理作用的认识，为宫颈恶性肿瘤靶向治疗及创新药物开发也提供了关键分子靶点与重要方向。后续研究将聚焦提取工艺的优化改进，将深入探究分子作用机制，为创制拥有自主知识产权的新型抗癌药物提供理论支撑。从临床转化角度看，本研究揭示了活性物质及其作用机理，为宫颈癌患者，或为有生育诉求的年轻患者提供创新治疗方案。与现有治疗手段相比，中药提取物可能具有更好的安全性和耐受性，这对于需要长期治疗的患者尤为重要REF_Ref18126\r\h[75]。当然，要实现真正的临床应用，还需要进行系统的药效学、毒理学评价以及规范的临床试验验证。此外，考虑到肿瘤异质性和个体差异，后续研究需着重探索生物标志物筛选与个性化用药策略制定。本研究整合多学科研究手段，系统阐释了传统中药淫羊藿抗宫颈恶性肿瘤的潜在作用机制，为中医药现代化研究提供了范例。本研究成果兼具理论价值，更为创新抗癌药物研发与个体化治疗策略制定夯实科学基础。随着研究的深入，传统中医药必将在恶性肿瘤综合治疗中发挥更加重要的作用。

结论1、本研究基于网络药理学和分子对接技术，预测了中药淫羊藿治疗宫颈癌的分子机制可能与调控AKT1、MAPK1蛋白有关，为淫羊藿的进一步实验验证奠定了基础。2、通过WB实验，验证了中药淫羊藿可以调控宫颈癌细胞AKT1、MAPK1蛋白的表达。这一发现为今后相关药物的开发奠定了基础，有利的指引了后续的研究方法。参考文献姚辛敏,周晓洁,周妍妍,等.远志化学成分及药理作用研究进展[J].中医药学报,2022,50(2)：103-107.翟英茹,罗江南,李慧,等.不同基原淫羊藿综合品质研究[J].中成药,2024,46(10)：3197-3203.马晓辉,刘立,孙少伯,等.淫羊藿资源现状及潜在分布区划研究[J].中国现代中药,2020,22(7)：5.国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版.一部[M].中国医药科技出版社,2015.李莉,王嘉瑞,王晶,等.淫羊藿的主要化学成分,药理作用研究进展及质量标志物的预测分析[J].中华中医药学刊,2023,41(11)：143-151.廖玉玲,莫镇涛,李文娜,等.淫羊藿苷的药理学研究进展[J].中华中医药学刊,2020,38(08)：139-142.孟宁,孔凯,李师翁.淫羊藿属植物化学成分及药理活性研究进展[J].西北植物学报,2010(5)：11.邢中夫,于慧,万新焕.淫羊藿多糖提取,分离纯化,结构特征和生物活性研究进展[J].药学研究,2023,42(10)：830-836.张利,李佳莉,高苑,等.淫羊藿素的药理作用及机制研究进展[J].中草药,2024,55(17)：6069-6077.李堂帅,纪宝玉,陈琳,等.基于“药用部位-化学成分-药理活性-性味功效”的刺类药用植物相关性[J].中国实验方剂学杂志,2024,30(22).梁利香,付雪丽,王海燕,等.基于不同炮制方法的淫羊藿黄酮类成分含量研究[J].FeedIndustry,2024,45(9).王建红,肖雪,姚远.宫颈癌多组学研究进展[J].四川大学学报(医学版)[2025-04-21].刘腾达,马欣原,崔云鹤,等.淫羊藿治疗心肌损伤的网络药理学分析[J/OL].北华大学学报(自然科学版),1-6[2025-04-03].徐睿锋,王泓睿,车云,等.中美癌症流行特征及长期趋势对比研究[J/OL].中国胸心血管外科临床杂志,1-12[2025-04-27].UbswchzhaSC.WorldHealthOrganizationGeneva[J].2010.LeiT,MaoWM,LeiTH,etal.IncidenceAndMortalityTrendofCervicalCancerin11CancerRegistriesofChina[J].ChineseJournalofCancerResearch,2011(01):10-14.CibulaD,PötterR,PlanchampF,etal.TheEuropeanSocietyofGynaecologicalOncology/EuropeanSocietyforRadiotherapyandOncology/EuropeanSocietyofPathologyGuidelinesfortheManagementofPatientswithCervicalCancer[J].VirchowsArchiv:aninternationaljournalofpathology,2018.Cui,Rosa,R,etal.TrendsinUseandSurvivalAssociatedWithFertility-SparingTrachelectomyforYoungWomenWithEarly-StageCervicalCancer[J].ObstetricsandGynecology:JournaloftheAmericanCollegeofObstetriciansandGynecologists,2018,131(6):1085-1094.LiaoYH,LiCI,LinCC,etal.TraditionalChinesemedicineasadjunctivetherapyimprovesthelong-termsurvivaloflungcancerpatients[J].JournalofCancerResearch&ClinicalOncology,2017.LiuYX,BaiJX,LiT,etal.ATCMformulacomprisingSophoraeFlosandLoniceraeJaponicaeFlosalterscompositionsofimmunecellsandmoleculesoftheSTAT3pathwayinmelanomamicroenvironment[J].PharmacologicalResearch,2019.Chen,MeihongYe,KeZhang,etal.ParisSaponinIIinhibitscolorectalcarcinogenesisbyregulatingmitochondrialfissionandNF-kappaBpathway[J].Pharmacologicalresearch:TheofficialjournalofTheItalianPharmacologicalSociety,2019,139.姜蕊,闫莉,邹明轩,等.朝鲜淫羊藿内生真菌Ilyonectriacyclaminicola代谢产物与药材化学成分的对比研究[J/OL].中药材,2025,(04)：916-921[2025-04-27].王建红,肖雪,姚远.宫颈癌多组学研究进展[J].四川大学学报(医学版)[2025-04-21].王义翠,彭慧霞,夏子岚,等.淫羊藿苷药理作用及应用研究进展[J].中华中医药学刊,2023,41(6)：182-186.吴迪,米甜,王贺东,等.淫羊藿素的药理作用及分子机制研究进展[J].医学研究与教育,2023,40(6)：1-11.陈亮,郝梦超,安超娜,等.淫羊藿多糖提取工艺及其药理活性研究进展[J].江苏调味副食品,2023,(01)：5-8+11.李晓兵,丁云录,李驰坤,等.淫羊藿多糖的提取分离及体内抗氧化活性研究[J].长春中医药大学学报,2020,36(5)：5.ZhangSQ.Ultra-highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometryforthequantificationoficaritininmousebone[J].Journalofchromatography.B,Analyticaltechnologiesinthebiomedicalandlifesciences,2014,978-979C:24-28.ZhangSQ,ZhangSZ.Oralabsorption,distribution,metabolism,andexcretionoficaritininratsbyQ‐TOFandUHPLC–MS/MS[J].DrugTesting&Analysis,2017.HuongNT,SonN.Icaritin:Aphytomoleculewithenormouspharmacologicalvalues.[J].Phytochemistry,2023.吴迪,米甜,王贺东,等.淫羊藿素的药理作用及分子机制研究进展[J].医学研究与教育,2023,40(6)：1-11.GaoL,ZhangSQ.AntiosteoporosisEffects,Pharmacokinetics,andDrugDeliverySystemsofIcaritin:AdvancesandProspects[J].2022.高丽芳,张双庆.淫羊藿素抗炎作用的研究进展[J].国外医药：抗生素分册,2023,44(1)：26-32.张妤.淫羊藿素通过抑制脂肪酸合成酶活性诱导肿瘤细胞凋亡和生长抑制[D].中国人民解放军海军军医大学,2009.孙礼堂,刘明川,曹健,等.基于多指标定量指纹图谱和化学计量学的淫羊藿质量标准提高研究[J].化学试剂,2023,45(11)：117-125.李泮霖,苏薇薇.网络药理学在中药研究中的最新应用进展[J].中草药,2016,47(16)：5.Zhang,Chen,LX,etal.Plantnaturalcompounds:targetingpathwaysofautophagyasanti-cancertherapeuticagents[J].CELLPROLIFERAT,2012,2012,45(5)(-):466-476.AminARMR,KucukO,KhuriFR,etal.PerspectivesforCancerPreventionWithNaturalCompounds[J].JournalofClinicalOncology,2009,27(16):2712-2725.MonksNR,LiB,GunjanS,etal.NaturalProductsGenomics:Anovelapproachforthediscoveryofanti-cancertherapeutics.[J].JournalofPharmacological&ToxicologicalMethods,2011,64(3):217-225.周富荣.《中华人民共和国药典》2000年版一部评价[J].中国中药杂志,2000,25(7)；441-444.赵文龙,王惠珍,马毅,等.4种基原的淫羊藿适宜生境分布研究[J].中国中医药信息杂志,2019,26(02)：6-10.王彩虹.中药多成分药代动力学的新方法和策略研究[D].北京协和医学院,2017.MaH,HeX,YangY,etal.ThegenusEpimedium:Anethnopharmacologicalandphytochemicalreview[J].JournalofEthnopharmacology,2011,134(3):519-541.ShindelAW,XinZC,LinG,etal.ErectogenicandNeurotrophicEffectsofIcariin,aPurifiedExtractofHornyGoatWeed(Epimediumspp.)InVitroandInVivo[J].JournalofSexualMedicine,2010,7(4pt1):1518-1528.Qure