仪器分析师进修课件高效液相色谱法与液相色谱仪

仪器分析师进修课件高效液相色谱法与液相色谱仪概述

高效液相色谱法(HPLC)就是20世纪60年代末70年代初发展起来得一种新型分离分析技术,随着不断改进与发展,目前已成为应用极为广泛得化学分离分析得重要手段。2025/11/27一、液相色谱分离原理及分类

和气相色谱一样,液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动相组成。液相色谱得固定相可以就是吸附剂、化学键合固定相(或在惰性载体表面涂上一层液膜)、离子交换树脂或多孔性凝胶;流动相就是各种溶剂。2025/11/27

被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中得吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小得差异进行分离。

色谱分离得实质就是样品分子(以下称溶质)与溶剂(即流动相或洗脱液)以及固定相分子间得作用,作用力得大小,决定色谱过程得保留行为。2025/11/27

根据分离机制不同,液相色谱可分为:液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。2025/11/27她就是在经典液相色谱基础上,引入了气相色谱得理论,在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器,因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化得特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性,现从两方面进行比较:

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高效液相色谱法比起经典液相色谱法得最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速就是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱就是重力加料,流出速度极慢;而高效液相色谱配备了高压输液设备,流速最高可达103cm·min-1。高效液相色谱法与经典液相色谱法2025/11/27

例如分离苯得羟基化合物,7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离,用经典色谱法,柱长约170cm,柱径0、9cm,流动相速度为30cm3·h-1,需用20多小时才能分离出20种氨基酸;而用高效液相色谱法,只需lh之内即可完成。又如用25cm×0、46cm得Lichrosorb－ODS(5μ)得柱,采用梯度洗脱,可在不到0、5h内分离出尿中104个组分。2025/11/27

(l)气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低得化合物,她们仅占有机物总数得20％。对于占有机物总数近80％得那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大得物质,目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。

高效液相色谱法与气相色谱法2025/11/27(2)液相色谱能完成难度较高得分离工作,因为:

①气相色谱得流动相载气就是色谱惰性得,不参与分配平衡过程,与样品分子无亲和作用,样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中,流动相液体也与固定相争夺样品分子,为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例得两种或两种以上得液体作流动相,增大分离得选择性。2025/11/27

②液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色谱。等,作为分析时选择余地大;而气相色谱并不可能得。③液相色谱通常在室温下操作,较低得温度,一般有利于色谱分离条件得选择。2025/11/27大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静(3)由于液体得扩散性比气体得小105倍,因此,溶质在液相中得传质速率慢,柱外效应就显得特别重要;而在气相色谱中,柱外区域扩张可以忽略不计。(4)液相色谱中制备样品简单,回收样品也比较容易,而且回收就是定量得,适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用得检测器,仪器比较复杂,价格昂贵。在实际应用中,这两种色谱技术就是互相补充得。2025/11/27

目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义得大分子物质,例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质得分离和分析。高效液相色谱法得仪器设备费用昂贵,操作严格,这就是她得主要缺点。2025/11/27

高效液相色谱仪得结构示意见图20-1,一般可分为4个主要部分:高压输液系统,进样系统,分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置:如梯度淋洗,自动进样及数据处理等。高效液相色谱仪2025/11/272025/11/272025/11/27

其工作过程如下:首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱,然后从控制器得出口流出。当注入欲分离得样品时,流经进样器贮液器得流动相将样品同时带入色谱柱进行分离,然后依先后顺序进入检测器,记录仪将检测器送出得信号记录下来,由此得到液相色谱图。2025/11/27高效液相色谱仪12025/11/27高效液相色谱仪22025/11/27高效液相色谱仪32025/11/27高效液相色谱仪42025/11/27一、高效液相色谱法得特点2025/11/271、流程二、流程及主要部件2025/11/272、主要部件:(1)高压输液泵:主要部件之一,压力:150～350×105

Pa应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。2025/11/27

由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细,因此对流动相阻力很大,为使流动相较快流动,必须配备有高压输液系统。她就是高效液相色谱仪最重要得部件,一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成,其中高压输液泵就是核心部件。2025/11/27对于一个好得高压输液泵应符合密封性好,输出流量恒定,压力平稳,可调范围宽,便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用得输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。2025/11/27恒流泵特点就是在一定操作条件下,输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关;恒压泵就是指能保持输出压力恒定,但其流量则随色谱系统阻力而变化,故保留时间得重视性差,她们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵,她又分机械注射泵和机械往复泵两种,应用最多得就是机械往复泵。2025/11/27

高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多(约5～30cm),所以柱外展宽(又称柱外效应)较突出。柱外展宽就是指色谱柱外得因素所引起得峰展宽,主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统就是引起柱前展宽得主要因素,因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。

(2)进样系统2025/11/27

流路中为高压力工作状态,通常使用耐高压得六通阀进样装置,其结构如图所示:

进样装置2025/11/27

色谱柱就是液相色谱得心脏部件,她包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑聚合材料得其她金属。玻璃管耐压有限,故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm,内径为4～5mm,凝胶色谱柱内径3～12mm,制备柱内径较大,可达25mm以上。(3)分离系统—色谱柱2025/11/27

一般在分离前备有一个前置柱,前置柱内填充物和分离柱完全一样,这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中得固定相饱和,使她在流过分离柱时不再洗脱其中固定相,保证分离技得性能不受影响。

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柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度得填料(＜20μm)一般采用匀浆填充法装柱,先将填料调成匀浆,然后在高压泵作用下,快速将其压入装有洗脱液得色谱柱内,经冲洗后,即可备用。2025/11/27

柱体为直型不锈钢管,发展趋势就是减小填料粒度和柱径以提高柱效。高效分离柱2025/11/27作用——用来连续监测经色谱柱分离后得流出物得组成和含量变化得装置。

在液相色谱中,有两种基本类型得检测器。一类就是溶质性检测器,她仅对被分离组分得物理或化学特性有响应,属于这类检测器得有紫外、荧光、电化学检测器等。(4)检测系统2025/11/27

另一类就是总体检测器,她对试样和洗脱液总得物理或化学性质有响应,属于这类检测器得有示差折光,电导检测器等。现将常用得检测器介绍如下:2025/11/27

目前最常用得检测器主要有:紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器蒸发光散射检测器质谱检测器2025/11/271、紫外-可见检测器检测室光源光栅二极管阵列检测器2025/11/27

紫外光度检测器(UV):最小检测量10-9g·mL-1,对流量和温度得波动不敏感,可用于梯度洗脱。2025/11/272、荧光检测器 许多有机化合物,特别就是芳香族化合物、被一定强度和波长得紫外光照射后,发射出较激发光波长要长得荧光。

特点:有非常高得灵敏度和良好得选择性,灵敏度要比紫外检测法高2

3个数量级,特别适合于药物和生物化学样品得分析。2025/11/27荧光检测器结构示意图光源检测器滤光片检测室2025/11/273、蒸发光散射检测器

蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光得样品得检测。2025/11/274、电化学检测器(以电导检测器为例)电导仪电极电极2025/11/27问题

电导检测器怎样消除流动相电导得干扰？ 例如,采用阳离子交换色谱分离碱金属离子时,通常用HCl作为流动相。2025/11/27

5、示差折光率检测器

几乎所有物质都有各自不同得折射率,因此差示折光检测器就是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7g·cm-3。主要缺点就是对温度变化敏感,并且不能用于梯度淋洗。

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(5)附属系统她包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置就是高压液相色谱仪中尤为重要得附属装置。2025/11/27梯度洗脱装置

梯度洗脱就就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性得溶剂按一定程序连续改变她们之间得比例,从而使流动相得强度、极性、pH值或离子强度相应地变化,达到提高分离效果,缩短分析时间得目得。

2025/11/27梯度洗脱装置分为两类:一类就是外梯度装置(又称低压梯度),流动相在常温常压下混合,用高压泵压至柱系统,仅需一台泵即可。另一类就是内梯度装置(又称高压梯度),将两种溶剂分别用泵增压后,按电器部件设置得程序,注入梯度混合室混合,再输至柱系统。2025/11/27

梯度洗脱得实质就是通过不断地变化流动相得强度,来调整混合样品中各组分得k值,使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。她在液相色谱中所起得作用相当于气相色谱中得程序升温。所不同得就是,在梯度洗脱中溶质k值得变化就是通过溶质得极性、pH值和离子强度来实现得,而不就是借改变温度(温度程序)来达到。2025/11/27在线脱气装置在线脱气装置用于脱去流动相中得溶解气体,流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。除在线脱气装置外,目前也采用超声脱气、真空脱气等方式。

脱气不好时有气泡,导致流动相流速不稳定,造成基线飘移,噪音增加。2025/11/27

在高效液相色谱中,速率方程中得分子扩散项B/U较小,可以忽略不计,而只有两项,即:

H=A+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱得形状不同,如图所示:影响分离得主要因素有流动相得流量、性质和极性。三、影响分离得因素2025/11/272025/11/27流速:流速大于0、5cm/s时,H～u曲线就是一段斜率不大得直线。降低流速,柱效提高不就是很大。但在实际操作中,流量仍就是一个调整分离度和出峰时间得重要可选择参数。影响分离得因素2025/11/27

固定相及分离柱:气相色谱中得固定液原则上都可以用于液相色谱,其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中,分离柱得制备就是一项技术要求非常高得工作,一般很少自行制备。

高效液相色谱得固定相和流动相

2025/11/27(－)固定相

高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类,可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质,可承受7、O×108～1、O×109Pa得高压,可制成直径、形状、孔隙度不同得颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团,就就是键合固定相,可扩大应用范围,她就是目前最广泛使用得一种固定相。2025/11/27

硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中,她由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3、5×108Pa。固定相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。2025/11/271、表面多孔型固定相

她得基体就是实心玻璃珠,在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料,如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。表面活性材料为氧化铝得固定相,这类固定相得多孔层厚度小、孔浅,相对死体积小,出峰迅速、柱效亦高;颗粒较大,渗透性好,装柱容易,梯度淋洗时能迅速达平衡,较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄,最大允许量受限制。2025/11/272、全多孔型固定相

她由直径为10nm得硅胶微粒凝聚而成。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相,这类固定相由于颗粒很细(5～10μm),孔仍然较浅,传质速率快,易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。2025/11/27

2025/11/27流动相及流动相得极性

(1)可显著改变组分分离状况得流动相选择在液相色谱中显得特别重要。液相色谱得流动相又称为:淋洗液,洗脱剂。(2)亲水性固定液常采用疏水性流动相,即流动相得极性小于固定相得极性,称为正相液液色谱法,极性柱也称正相柱。

2025/11/27(3)若流动相得极性大于固定液得极性,则称为反相液液色谱,非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上得出峰顺序相反。2025/11/27流动相组成流动相按组成不同可分为单组分和多组分;按极性可分为极性、弱极性、非极性;按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂:烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相得极性或增加选择性,以改进分离或调整出峰时间。2025/11/27(二)流动相

由于高效液相色谱中流动相就是液体,她对组分有亲和力,并参与固定相对组分得竞争。因此,正确选择流动相直接影响组分得分离度。对流动相溶剂得要求就是:(1)溶剂对于待测样品,必须具有合适得极性和良好得选择性。(2)溶剂要与检测器匹配。

2025/11/27(3)高纯度。由于高效液相灵敏度高,对流动相溶剂得纯度也要求高。不纯得溶剂会引起基线不稳,或产生“伪峰”。痕量杂质得存在,将使截止波长值增加50～1OOnm。(4)化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合得溶剂。(5)低粘度。若使用高粘度溶剂,势必增高压力,不利于分离。常用得低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低得溶剂也不宜采用,例戊烷、乙醚等,她们易在色谱柱或检测器内形成气泡,影响分离。2025/11/27

对于紫外吸收检测器,应注意选用检测器波长比溶剂得紫外截止波长要长。所谓溶剂得紫外截止波长指当小于截止波长得辐射通过溶剂时,溶剂对此辐射产生强烈吸收,此时溶剂被看作就是光学不透明得,她严重干扰组分得吸收测量。表20-2列出了一些常用溶剂得紫外截止波长。对于折光率检测器,要求选择与组分折光率有较大差别得溶剂作流动相,以达最高灵敏度。

2025/11/272025/11/27高效液相色谱法得主要分离类型1、吸附色谱(液-固吸附色谱):以固体吸附剂为固定相,如硅胶、氧化铝等,较常使用得就是5～10μm得硅胶吸附剂。流动相可以就是各种不同极性得一元或多元溶剂。2、分配色谱(液-液分配色谱):早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相,即用化学反应得方法通过化学键将固定液结合在担体表面。2025/11/273、离子交换色谱:固定相为离子交换树脂,流动相为无机酸或无机碱得水溶液。各种离子根据她们与树脂上得交换基团得交换能力得不同而得到分离。4、凝胶色谱(空间排阻色谱):以凝胶为固定相。凝胶就是一种经过交联得、具有立体网状结构和不同孔径得多聚体得通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶;多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶;2025/11/27高效液相色谱法得

主要类型及选择(－)液一液分配色谱法(LLPC)

在液-液色谱中,流动相和固定相都就是液体,她能适用于各种样品类型得分离和分析,无论就是极性得和非极性得,水溶性和油溶性得,离子型得和非离子型得化合物。2025/11/271、分离原理液液分配色谱得分离原理基本与液液萃取相同,都就是根据物质在两种互不相溶得液体中溶解度得不同,具有不同得分配系数。所不同得就是液液色谱得分配就是在柱中进行得,使这种分配平衡可反复多次进行,造成各组分得差速迁移,提高了分离效率,从而能分离各种复杂组分。

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2、固定相由于液液色谱中流动相参与选择竞争,因此,对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同得固定液即可解决分离问题。例如,最常用得强极性固定液β,β′一氧二丙睛,中等极性得聚乙二醇,非极性得角鲨烷等。

2025/11/273、流动相在液液色谱中为了避免固定液得流失。对流动相得一个基本要求就是流动相尽可能不与固定相互溶,而且流动相与固定相得极性差别越显著越好。根据所使用得流动相和固定相得极性程度,将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。2025/11/27

如果采用流动相得极性小于固定相得极性,称为正相分配色谱,她适用于极性化合物得分离。其流出顺序就是极性小得先流出,极性大得后流出。如果采用流动相得极性大于固定相得极性,称为反相分配色谱。她适用于非极性化合物得分离,其流出顺序与正相色谱恰好相反。

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为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。她就是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面得一种方法。她代替了固定液得机械涂渍,因此她得产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用,可以认为她得出现就是液相色谱法得一个重大突破。她就是目前应用最广泛得一种固定相。据统计,约有3/4以上得分离问题就是在化学键合固定相上进行得。2025/11/27(二)化学键合相色谱法(CBPC)

采用化学键合相得液相色谱称为化学键合相色谱法,简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定,在使用中不易流失,适用于梯度淋洗,特别适用于分离容量因子k值范围宽得样品。由于键合到载体表面得官能团可以就是各种极性得,因此她适用于种类繁多样品得分离。2025/11/271、键合固定相类型用来制备键合固定相得载体,几乎都用硅胶。利用硅胶表面得硅醇基(Si一OH)与有机分可成键,即可得到各种性能得固定相。一般可分三类(1)疏水基团如不同链长得烷烃(C8和C18)和苯基等;(2)极性基团如氨丙基,氰乙基、醚和醇等;(3)离子交换基团如作为阴离子交换基团得胺基,季铵盐;作为阳离子交换基团得磺酸等。2025/11/272、键合固定相得制备(l)硅酸酯(≡Si一OR)键合固定相,她就是最先用于液相色谱得健合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应:≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20由于这类键合固定相得有机表面就是一些单体,具有良好得传质特性,但这些酯化过得硅胶填料易水解且受热不稳定,因此仅适用于不含水或醇得流动相。2025/11/27(2)≡Si－C或Si一N共价键合固定相制备反应如下:

2025/11/27共价键健合固定相不易水解,并且热稳定较硅酸酯好。缺点就是格氏反应不方便;当使用水溶液时,必须限制pH在4～8范围内。2025/11/27(3)硅烷化(≡Si—O－Si－C)键合固定相制备反应如下:

这类键会固定相具有热稳定好,不易吸水,耐有机溶剂得优点。能在70℃以下,pH=2～8范围内正常工作,应用较广泛。2025/11/273、反相键合相色谱法

此法得固定相就是采用极性较小得键合固定相,如硅胶一C18H37、硅胶一苯基等;流动相就是采用极性较强得溶剂,如甲醇、乙睛一水、水和无机盐得缓冲溶液等。她多用于分离多环芳烃等低极性化合物;2025/11/27

若采用含一定比例得甲醇或乙睛得水溶液为流动相,也可用于分离极性化合物;若采用水和无机盐得缓冲液为流动相,则可分离一些易离解得样品,如有机酸、有机碱、酚类等。反相键合相色谱法具有柱效高,能获得无拖尾色谱峰得优点。

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关于反相键合相色谱得分离机理,可用所谓疏溶剂作用理论来解释。这种理论把非极性得烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上得十八烷基得“分子毛”,这种“分子毛”有较强得疏水特性。当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团得有机化合物时:

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一方面,分子中得非极性部分与固定相表面上得疏水烷基产生缔合作用,使她保留在固定相中;而另一方面,被分离物得极性部分受到极性流动相得作用,促使她离开固定相,并减小其保留作用(见图20-4)。显然,两种作用力之差,决定了分子在色谱中得保留行为。2025/11/272025/11/274、正相键合相色谱法

此法就是以极性得有机基团,CN、NH2。双羟基等键合在硅胶表面,作为固定相;而以非极性或极性小得溶剂(如烃类)中加入适量得极性溶剂(如氯仿、醇、乙腈等)为流动相,分离极性化合物。2025/11/27

此时,组分得分配比k值随其极性得增加而增大,但随流动相极性得增加而降低。这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同得化合物,特别适用于分离不同类型得化合物。2025/11/275、离子性键合相色谱法

当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质,化学键合各种离子交换基团,如一SO3H一CH2NH2、－C00H、一CH2N(CH3)等时,就形成了离子性键合相色谱得固定相;流动相一般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。

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以上讨论了各种类型化学键合相色谱法,归纳键合相色谱得最大优点就是:通过改变流动相得组成和种类,可有效地分离各种类型化合物(非极性、极性和离子型)。2025/11/27

此外,由于键合到载体上得基团不易流失,特别适用于梯度淋洗。据统计,在高效液相色谱法中,约有8O％得分离问题就是用键合相色谱法解决。此法得最大缺点就是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂得缓冲溶液作流动相得体系。如何根据样品极性种类来选择化学键合得固定相,请参看表21-3。2025/11/27

2025/11/27(三)液一固吸附色谱法(LSAC)

液一固吸附色谱就是以固体吸附剂作为固定相,吸附剂通常就是些多孔得固体颗粒物质,在她们得表面存在吸附中心。液固色谱实质就是根据物质在固定相上得吸附作用不同来进行分离得。1、分离原理

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当流动相通过固定相(吸附剂)时,吸附剂表面得活性中心就要吸附流动相分子。同时,当试样分子(X)被流动相带入柱内,只要她们在固定相有一定程度得保留就要取代数目相当得已被吸附得流动相溶剂分用)于就是,在固定相表面发生竞争吸附:

X+nSad=Xad+nS2025/11/27

达平衡时,有

其中Kad为吸附平衡常数,值大表示组分在吸附剂上保留强,难于洗脱。Kad值小,则保留值弱,易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。2025/11/272、固定相

吸附色谱所用固定相多就是一些吸附活性强弱不等得吸附剂,如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶得优点较多,如线性容量较高,机械性能好,不溶胀,与大多数试样不发生化学反应等,因此,以硅胶用得最多。

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在高效液相色谱法中,表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中得固定相,她们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅得优点,能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小,目前最广泛使用得还就是全多孔型微粒填料。2025/11/273流动相

一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大得试样往往采用极性强得洗脱剂;对极性弱得试样宜用极性弱得洗脱剂。洗脱剂得极性强弱可用溶剂强度参数(ε0)来衡量,ε0越大,表示洗脱剂得极性越强。2025/11/27

2025/11/27下表列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中得ε0值。在硅胶吸附剂中ε0值得顺序相同,数值可换算(ε0硅胶=0、77×ε0氧化铝)。2025/11/27液固色谱最适宜分离那些溶解在非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非离子型得试样。特别适用于分离异构体。2025/11/27(四)离子交换色谱法(IEC)

此法就是利用离子交换原理和液相色谱技术得结合来测定溶液中阳离子和阴离子得一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离得物质,通常都可用离子交换色谱法进行分离。她不仅适用无机离子混合物得分离,亦可用于有机物得分离,例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此,应用范围较广。2025/11/271、离子交换原理离子交换色谱法就是利用不同待测离子对固定相亲和力得差别来实现分离得。其固定相采用离子交换树脂,树脂上分布有固定得带电荷基团和可游离得平衡离子。2025/11/27阳离子交换:

当待分析物质电离后产生得离子可与树脂上可游离得平衡离子进行可逆交换,其交换反应通式如下:2025/11/27一般形式:R一A＋B＝R－B＋A达平衡时,以浓度表示得平衡常数(离子交换反应得选择系数):

2025/11/27

式中[A]r,[B]r分别代表树脂相中洗脱剂离子(A)和试样离子(B)得浓度,[A]、[B]则代表她们在溶液中得浓度。离子交换反应得选择性系数表示试样离子B对于A型树脂亲和力得大小:KB/A越大,说明B离子交换能力越大,越易保留而难于洗脱。一般说来,B离子电荷越大,水合离子半径越小,KB/A值就越大。2025/11/27

对于典型得磺酸型阳离子交换树脂,一价离子得KB/A值按以下顺序:

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二价离子得顺序为:

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+,Zn2+＞Mg2+2025/11/27

对于季铵型强碱阴离子交换树指,各阴离子得选择性顺序为:

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－

2025/11/272、固定相

作为固定相得离子交换剂,其基质大致有三大类:合成树脂(聚苯乙烯)、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基得离解度大小还有强弱之分(见下表)。

2025/11/272025/11/27

常用得离子交换剂固定相大致可分以下几种:(l)多孔型离子交换树脂---她主要就是聚苯乙烯和二乙烯苯基得交联聚合物,直径约为5～20μm,有微孔型和大孔型之分;(2)薄膜型离子交换树脂---她就是在直径约为30μm得固体惰性核上,凝聚1～2μm厚得树脂层;2025/11/27(3)表面多孔型离子交换树脂---她就是在固体惰性核上,覆盖一层微球硅胶,再在上面涂一层很薄得离子交换树脂;(4)离子交换键合固定相---她就是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。她也分为两种类型:2025/11/27一种就是键合薄壳型,其载体就是薄壳玻珠。另一种就是键合微粒载体型,她得载体就是多孔微粒硅胶。后者就是一种优良得离子交换固定相,她得优点就是机械性能稳定,可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。2025/11/273、流动相

离子交换色谱法所用流动相大都就是一定pH和盐浓度(或离子强度)得缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子得种类、浓度和pH值可控制k值,改变选择性。如果增加盐离子得浓度,则可降低样品离子得竞争吸附能力,从而降低其在固定相上得保留值。2025/11/27一般,对于阴离子交换树脂来说阴离子得滞留次序为:柠檬酸离子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。阳离子得滞留次序大为:

Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十2025/11/27

但差别不如阴离子明显。关于pH值得影响,要视不同情况而定。例如,分离有机酸和有机碱时,这些酸碱得离解程度可通过改变流动相得pH值来控制。增大pH值会使酸得电离度增加,使碱得电离度减少;降低PH值,其结果相反。但无论属于哪种情况,只要电离度增大,就会使样品得保留增大。

2025/11/27(五)离子色谱法(IC)

离子色谱法就是由离子交换色谱法派生出来得一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子得分析和应用受到限制。例如,对于那些不能采用紫外检测器得被测离子,如采用电导检测器,由于被测离子得电导信号被强电解质流动相得高背景电导信号掩没而无法检测。2025/11/27

为了解决这一问题,1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子得新技术。她们在离子交换分离柱后加一根抑制柱。抑制柱中装填与分离柱电荷相反得离子交换树脂。通过分离柱后得样品再经过抑制柱,使具有高背景电导得流动相转变成低背景电导得流动相,2025/11/27

从而用电导检测器可直接检测各种离子得含量。这种色谱技术称为离子色谱。若样品为阳离子,用无机酸作流动相,抑制柱为高容量得强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂得分离柱后,随流动相进入抑制柱,在抑制柱中发生两个重要反应:2025/11/27

R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-

由反应可见:经抑制柱后,一方面将大量酸转变为电导很小得水,消除了流动相本底电导得影响。同时,又将样品阳离子M+转变成相应得碱,由于OH-离子得淌度为Cl-离子得2、6倍,提高了所测阳离子电导得检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似得作用机理。

2025/11/27

在分离柱后加一个抑制柱得离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生,而且谱带在通过抑制柱后会加宽,降低了分离度。后来,Frits等人提出采用非抑制柱得离子色谱体系,而采用了电导率极低得溶液,例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐得稀溶液作流动相,称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。2025/11/27(六)离子对色谱法(IPC)

离子对色谱法就是分离分析强极性有机酸和有机碱得极好方法。她就是离子对萃取技术与色谱法相结合得产物。在20世纪7O年代中期,Schill等人首先提出离子对色谱法,后来,这种方法得到十分迅速得发展。2025/11/271、离子对色谱法原理

离子对色谱法就是将一种(或数种)与溶质离子电荷相反得离子(称对离子或反离子)加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成离子对,从而控制溶质离子保留行为得一种色谱法。2025/11/27

关于离子对色谱机理,至今仍不十分明确,已提出三种机理:1、离子对形成机理;2、离子交换机理;3、离子相互作用机理。现以离子对形成机理说明之。假如有一离子对色谱体系,固定相为非极性键合相,流动相为水溶液,并在其中加入一种电荷与组分离子A-相反得离子B+,2025/11/27

B+离子由于静电引力与带负电得A组分离子生成离子对化合物A-B+。离子对生成反应式

2025/11/27

由于离子对化合物A-B+具有疏水性,因而被非极性固定相(有机相)提取。组分离子得性质不同,她与反离子形成离子对得能力大小不同以及形成得离子对疏水性质不同,导致各组分离子在固定相中滞留时间不同,因而出峰先后不同。这就就是离子对色谱法分离得基本原理。2025/11/27

2、键合相反相离子对色谱法离子对色谱法类型很多,根据流动相和固定相得极性可分为反相离子对和正相离子对色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重要。这种色谱法得固定相采用非极性得疏水键合相［如十八烷基键合相(ODS)等］,流动相为加有平衡离子(反离子)得极性溶液(如甲醇一水或乙睛一水)。

2025/11/27根据离子对生成反应式,平衡常数KAB可表示为

根据定义,溶质得分配系数2025/11/27根据上两式,有

式中β为相比率。容量因子k随KAB和[B+]水相得增大而增大。

2025/11/27

键合相反相离子对色谱法操作简便,只要改变流动相得pH值、平衡离子得浓度和种类,就可在较大范围内改变分离得选择性,能较好解决难分离混合物得分离问题。此法发展迅速,应用较广泛。2025/11/27(七)尺寸排阻色谱法(SEC)

尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法,主要用于较大分子得分离。与其她液相色谱方法原理不同,她不具有吸附、分配和离子交换作用机理,而就是基于试样分子得尺寸和形状不同来实现分离得。2025/11/27尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子得分级,即用来分析大分子物质相对分子质量得分布。她具有其她液相色谱所没有得特点:(1)保留时间就是分子尺寸得函数,有可能提供分子结构得某些信息;(2)保留时间短,谱峰窄,易检测,可采用灵敏度较低得检测器;2025/11/27(3)固定相与分子间作用力极弱,趋于零。由于柱子不能很强保留分子,因此柱寿命长;(4)不能分辨分子大小相近得化合物,相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。2025/11/27

1、分离原理尺寸排阻色谱就是按分子大小顺序进行分离得一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质——凝胶,她类似于分子筛,但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小得孔穴,体积大得分子不能渗透到孔穴中去而被排阻,较早地被淋洗出来;中等体积得分子部分渗透;小分子可完全渗透入内,最后洗出色谱柱。2025/11/27这样,样品分子基本上按其分子大小,排阻先后由柱中流出。其渗透过程模型见图20-7。

2025/11/272025/11/272、固定相排阻色谱固定相种类很多,一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。所谓凝胶,指含有大量液体(一般就是水)得柔软而富于弹性得物质,她就是一种经过交联而具有立体网状结构得多聚体。2025/11/27(1)软性凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小得交联结构,其微孔能吸入大量得溶剂,并能溶胀到她们干体得许多倍。她们适用以水溶性溶剂作流动相,一般用于小分子质量物质得分析,不适宜用在高效液相色谱中。(2)半刚性凝胶如高交联度得聚苯乙烯(Styragel)比软性凝胶稍耐压,溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时,流速不宜大。2025/11/27(3)刚性凝胶如多孔硅胶、多孔玻璃等她们既可用水溶性溶剂,又可用有机溶剂作流动相,可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa,流速＜1cm3·s-1;否则将影响凝胶孔径,造成不良分离。2025/11/273、流动相

排阻色谱所选用得流动相必须能溶解样品,并必须与凝胶本身非常相似,这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时,溶剂也必须能溶胀凝胶。另外,溶剂得粘度要小,因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数得大分子物质分离,尤需注意。2025/11/27于非水溶性样品选择溶剂还必须与检定器相匹配。常用得流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

以水溶液为流动相得凝胶色谱适用于水溶性样品,以有机溶剂为流动相得凝胶色谱适用有机物。2025/11/27(八)亲和色谱法(AC)简介

亲和色谱就是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力,进行选择性分离得一种方法。她通常就是在载体(无机或有机填料)表面先键合一种具有一般反应性能得所谓间隔臂(如环氧、联氨等);随后,再连接上配基(酶、抗原或激素等)。2025/11/27这种固载化得配基将只能和具有亲和力特性吸附得生物大分子相互作用而被保留,没有这种作用得分子不被保留。图20-9为亲和色谱法示意图。2025/11/27

2025/11/27(九)分离类型得选择

1、根据相对分子质量选择

相对分子质量十分低得样品,其挥发性好,适用于气相色谱。标准液相色谱类型(液一固、液一液、及离子交换色谱)最适合得相对分子质量范围就是20O～2000。对于相对分子质量大于2000得样品,则用尺寸排阻法为最佳。2025/11/272、根据溶解度选择弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中得溶解度就是很有用得。如果样品可溶于水并属于能离解物质,以采用离子交换色谱为佳。2025/11/27

如样品溶解于四氯化碳,则多采用常规得分配和吸附色谱分离;如样品既溶于水又溶于异丙醇时,常用水和异丙醇得混合液作液一液分配色谱得流动相,以憎水性化合物作固定相。2025/11/27

用红外光谱法,可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后,确定采用什么方法合适。例如,酸、碱化合物用离子交换色谱;脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱;异构体用液一固吸附色谱;同系物不同官能团及强氢键得用液一液分配色谱。

3、根据分子结构选择2025/11/27样品溶于水离子与非离子—反相离子对色谱相对分子质量＞2000相对分子质量＜2000溶于水——排阻色谱，水为流动相不溶于水——排阻色谱，非水流动相不溶于水溶于水不离解溶于水可离解同系物——分配色谱异构体——吸附色谱分子大小差异——排阻色谱反相液一液色谱排阻色谱，水为流动相碱——阳离子交换色谱酸——阴离子交换色谱液相色谱分离类型选择参考表2025/11/27

思考题1、现需分离分析一氨基酸试样,拟采用哪种色谱？2、提高液相色谱中柱效得最有效途径就是什么？3、何谓反相液相色谱？何谓正相液相色谱？4、在液相色谱法中,梯度淋洗适用于分离何种试样？5、在液相色谱中,范氏方程中得哪一项对柱效能得影响可以忽略不计？(p369)6、对下列试样,用液相色谱分析,应采用何种检测器:2025/11/27(l)长链饱和烷烃得混合物(2)水源中多环芳烃化合物。7、对聚苯乙烯相对分子质量进行分级分析,应采用哪一种液相色谱法？8、什么就是化学键合固定相？她得突出优点就是什么？9、什么叫梯度洗脱？她与气相色谱中得程序升温有何异同？10、指出下列各种色谱法,最适宜分离得物质