单分子免疫检测技术在疾病诊疗中的应用与研究进展2025

单分子免疫检测技术在疾病诊疗中的应用与研究进展2025物限制在极小的体积内(nl以下),实现信号的绝对计数。这种方法能够高灵敏度地检测低丰度生物标志物，其检测下限可达fg/ml级，即1×10-16mol/L,比传统免疫分析技术的精度提高了1000倍[1]。因此，该技术被认为是未来免疫学发展的重要方向[2,3],为精准医学的发展提供技术保障[4]。段实现单个抗原分子的信号检测。目前主流在具体实施层面，单分子免疫检测技术的原理主要包括4个部分，即免疫式免疫反应结构，通过磁珠或多孔板作为载体，实现“抗体-抗原-抗体”时使用结合靶蛋白另一表位的标记抗体，形成双抗体夹心的免疫复合物；在反应过程中，根据标记物质的种类，可使用酶荧光成像的荧光材料或其他能够实现信号放大的分子或材料；通过液滴、和“1”进行标记，标记所有检测单元[5];在计数过程中，通过计算“0”和“1”信号单元的比例或数量，测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)和普通化学发光法(chemiluminescentimmunoassay,CLIA),它们通常依赖光学和电化学检测手段，其原理是通过捕获信号测免疫反应后试剂溶液的整体浓度信号。与子免疫检测技术采用高灵敏度检测元件，避极低浓度的生物分子浓度(表1)。对于精准医学诊断中的血液蛋白质定量检测，单分子免疫分析是不可或缺的重要手段[7]。该技术能够在物浓度通常处于10-16~10-12mol/L。而大多数临床实验室采用的传统免疫测定技术难以满足超低浓度标志物的检测需求[8]。为了实现类：原位检测和随机分配检测[9]。原位检测是指在预设的固定区域传感器、超高分辨率近场扫描显微镜和等离子纳米孔等方法[10,11,12]。然而，由于这些仪器依赖于高精密度光学系统实现单分子水平检测，制造成本高昂。且由于信号易受干扰，对操作流程和环境要求较高，原位检测尚难以广泛应用于临床[13]。测区域内，以提高局部浓度和检测灵敏度[14]。这些检测区域的体积通常控制在纳升级以下。基于微阵列芯片[15]和微液滴[16]的滴进行单分子分析。随机分配检测模式更易于实现自动化和商业化应用。单分子阵列技术(singlemoleculearray,Simoa)是目前最具代表性的基于微阵列的单分子随机分配方式，该技术使应孔中，从而使得一定概率下，每个反应孔中将其单独包含在Simoa阵列中，被称为“数字ELISA”。Simoa技术被视为单分子免疫检测的“金标准”,对于特定靶标的检测灵敏度可达到然而，由于分析仪需要光学元件和流体处理境要求较高，在临床诊疗中有一定局限性，无法满足床旁检测 (point-of-caretesting,POCT)的需求。同时，高昂的设备价格(25万~40万美金)和较高的单次测试成本(10~20美金)也限制了该技术的更低，能够应用于POCT,但芯片制作工艺尚不成熟，需要进一步发展。验医学实验室中有多种实施途径，包括直接单分子成像[19]、单分子扫描[20]和数字化信号放大[21]等(表2)。每种途径都有其独特的优势和局限性[22]。检测手段，特别在需要高精度和高灵敏度分析的应用中表现突出。然而，其较高的设备及耗材成本、操作流程复杂和功研制单分子免疫自动化分析仪。检测流程主要包括2个类型：(1)原位抗体，进行进一步混合和孵育；第三步，利用蛋白的浓度。(2)基于随机分配的单分子酶催化信号放大：仪器将样本加使用荧光底物复溶，快速分散至微孔阵列芯目前，国产单分子免疫自动化分析仪采用了更易于临床使用的产品设计，每个样本检测时间为5~6min,可以实现低至100fg/ml的检测下限，临床应用。该仪器检测通量能够达到90测试/h,极大地提高了检测效率，领域，并在疾病的早期诊断和预防中展示了其在神经退行性疾病领域起步较早，多项研究证明病(Alzheimerdisease,AD)的早期诊断和预后评估，其靶标包括微管蛋白相关单位蛋白(tubulinassociatedunitprotein,Tau)[23]、β淀粉样蛋白(amyloidbeta,Aβ)[24]、神经丝轻链蛋白 脑源性神经标志物在血液中浓度较低，增加了检测脑脊液样本[27]。然而，脑脊液样本需通过腰椎穿刺术获取，采样难度大且对患者存在一定损伤风险，并可能导致检测的前提下确保检测的准确性[28]。这也为单分子免疫检测技术Tao等[29]利用单分子免疫检测技术发现了18种血清蛋白在不同AD阶段表现异常，开发了8个血清标志物，为血液检测在AD早期临床化Tau蛋白(p-tau217)的单克隆抗体，评估血浆p-tau217的水平与AD患者脑萎缩和认知障碍之间的相关性，揭示了p-tau217在AD疾病除神经退行性疾病外，单分子免疫检测技术还广泛应用于其他神经科学疾病的研究和诊断，包括帕金森病[31]、多发性硬化症[32]、视神经脊髓炎[33]以及神经罕见病等。有研究证明NfL在评估运动神经元受损疾病的严重程度中具有潜在作用[34]。高敏心肌肌钙蛋白(high-sensitivitycardiactroponin,hs-cTn)作为志物尤为重要，其检测下限和变化值对于早期诊断至关重要。Wang等[35]开发了一种无须洗涤的方法，能在10min内使用一步数字Jing等[36]利用这一技术对临床血浆样本进行了验证，显示出cTnT3.单分子免疫检测技术在免疫炎症标志物检验中的作用：干燥综合征 (Sjogren'ssyndrome,SS)是一种自身免疫性疾病，而I型干扰素 (interferon,IFN)是其免疫调节蛋白。在SS患者中，IFN-a和IFN-β这些基因过表达可以增强免疫细胞的活性，导致对自身组织的攻击增Huijser等[38]使用单分子免疫检测技术对IFN-a2亚型进行精准定量，发现原发性SS患者的IFN-a2血浆水平远高于正常人，且相比于液中检测极微量的白细胞介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β)和肿瘤坏死因子a(tumornecrosisfactpigmentedglia,ALSP)的致病机制及米诺环素的治疗效果[39]。型冠状病毒核衣壳蛋白，作为核酸检测的补充手段进行早期感染判断[40,41]。同样由于单分子免疫检测技术拥有低浓度水平检测的灵敏度，研究表明在人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)感染后第14天即可在感染细胞上清液中检测到HIVp24,而使用ELISA方法则需到第21天[42]。这种提高的灵敏度和缩短量可低至1fg,用于HIV治疗过程中病情发展的监测[43]。肺结核的潜伏期感染证据。Ben等[44]利用单分子免疫检测技术检测IFN单分子免疫检测技术检测肿瘤标志物，如前列腺特异抗原 的敏感性。Jiang等[46]利用单分子免疫检测技术对比不同ALP分型所致的健康状况差异。在提高灵敏度的前提下，通过检测患者中的微小变化，Simoa技术能够提前发现肿瘤复发[47]。Keegancancer,NSCLC)患者在免疫治疗前和治疗期间的血浆细胞因子白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)水平。Simoa技术可以在单细胞水平上检测蛋白质，这在提高临床检测效率和大规模新型生物标志物突触囊泡蛋白2A(synapticvesicleglycoprotein2A,病抑制因子(leukaemiainhibitoryfactor,LIF)水平有助于判断胰管腺癌的治疗效果。单分子免疫检测技术还应用于外泌体、循环肿瘤DNA列技术(Simoa)开发了两种外泌体免疫分析方法，分别用于区分普