基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选及其抗肝癌机制与应用研究

基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选及其抗肝癌机制与应用研究一、引言1.1研究背景与意义肝癌，作为全球范围内严重威胁人类健康的重大疾病之一，其发病率和死亡率一直居高不下。据相关统计数据显示，2018年中国新发肝癌病例高达39万多人，位居新发恶性肿瘤的第三位；同年，因肝癌死亡的人数约为36万多人，死亡人数同样位居恶性肿瘤第三位，且全世界47%的肝癌病例发生在中国。肝癌的发生发展与多种因素密切相关，其中乙型肝炎病毒（HBV）感染在我国肝癌的发病中起着关键作用。由于我国曾经乙肝阳性率较高，加之庞大的人口基数，使得我国成为肝癌的高发地区，肝癌的防治工作显得尤为迫切和重要。目前，临床上针对肝癌的治疗手段主要包括外科手术切除、肝脏移植、局部微波射频治疗、微波热凝治疗、介入治疗、联合放射治疗以及靶向治疗等。然而，尽管这些传统治疗方法在一定程度上能够对肝癌进行干预，但肝癌患者的整体生存率并未得到显著提高。手术切除虽然是早期肝癌的重要治疗手段，但对患者身体的创伤较大，且部分患者由于肿瘤位置、大小或身体状况等因素，并不适合手术；化疗和放疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常组织细胞造成损伤，产生较强的副作用，严重影响患者的生活质量，且容易出现耐药性，导致治疗效果不佳。因此，寻找更为有效的肝癌治疗方法迫在眉睫。肿瘤免疫治疗作为一种新兴的治疗策略，为肝癌的治疗带来了新的希望。它主要通过激活人体自身的免疫系统，依靠机体自身的免疫机能来识别和杀灭癌细胞及肿瘤组织。肿瘤免疫治疗的方法丰富多样，包括肿瘤疫苗、过继性细胞免疫治疗、非特异性免疫调节剂等。其中，T细胞受体（TCR）基因工程技术在肿瘤免疫治疗领域展现出了巨大的潜力。T细胞作为免疫系统的重要组成部分，其表面的TCR能够特异性识别肿瘤细胞表面主要组织相容性复合体（MHC）分子提呈的抗原肽，进而触发特异性T细胞免疫反应，对肿瘤细胞进行攻击和杀伤。Survivin（生存素）是一种关键的抗凋亡蛋白，属于凋亡抑制蛋白（IAP）家族的最新成员。它主要分布于胚胎及分化未成熟的组织中，在大多数常见肿瘤组织内表达水平明显增高，而在正常分化成熟的组织中几乎无表达。这种在肿瘤组织和正常组织中表达的显著差异，使得Survivin成为肿瘤治疗的理想靶点。研究表明，Survivin在肝癌中高度表达，并且与肿瘤的耐药、侵袭及转移密切相关。点突变Survivin蛋白中发生点突变后产生的肽段，能够作为抗肿瘤疫苗诱导T细胞免疫反应。因此，基于点突变Survivin的TCR基因筛选，旨在选出具有高特异性和亲和力的TCR基因，有望为肝癌免疫治疗提供强有力的工具。通过筛选得到的TCR基因构建特异性T细胞，使其能够精准识别并杀伤肝癌细胞，从而实现对肝癌的有效治疗，为肝癌患者带来新的生机和希望。本研究对于深入探索肝癌的免疫治疗机制，开发新型、有效的肝癌治疗方法具有重要的理论和实践意义。1.2国内外研究现状在Survivin研究方面，国外学者早在1997年便由耶鲁大学的AltieriDC等人利用效应细胞蛋白酶受体-1cDNA在人类基因组库中成功筛选分离出Survivin，并对其基因结构和蛋白特性进行了初步探究。后续研究发现，Survivin在多种肿瘤组织中呈现高表达状态，如乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌等。在肝癌领域，Ito等通过逆转录聚合酶链反应技术测定了survivinmRNA在肝癌细胞株及手术切除的肝癌组织中的表达情况，证实了Survivin在肝癌中的高表达。同时，国外研究还深入探讨了Survivin的抗凋亡机制，如Marusawa等证实Survivin通过辅因子乙型肝炎B病毒反应蛋白（HBXIP）结合到caspase-9前体，并抑制它的活化，从而实现抗凋亡作用；Dohi等研究发现，在受到死亡刺激时，survivin和凋亡抑制因子XIAP结合形成复合物，增强了XIAP的稳定性，然后协同地作用于caspase-9来抑制凋亡。国内学者也对Survivin在肝癌中的作用进行了大量研究。有研究表明Survivin的表达与肝癌患者的肿瘤大小、TNM分期及预后密切相关，高表达Survivin的肝癌患者预后往往较差。此外，国内研究还关注了Survivin与肝癌细胞增殖、侵袭和转移的关系，发现Survivin可能通过调节相关信号通路来促进肝癌细胞的恶性生物学行为。在TCR基因筛选领域，国外已经发展了多种先进的筛选技术。如利用噬菌体展示技术构建TCR文库，通过与肿瘤抗原肽-MHC复合物进行亲和筛选，获得高亲和力的TCR基因。还有研究利用酵母表面展示技术，将TCR展示在酵母细胞表面，通过流式细胞术分选与抗原肽-MHC复合物结合的酵母细胞，从而筛选出特异性TCR基因。此外，基于精细化的单细胞分析技术，如单细胞RT-PCR、单细胞TCR测序等，也被广泛应用于直接从患者的外周血或肿瘤组织中分离和鉴定特异性的TCR基因，这些技术能够极大地提高特异性和亲和力，缩短筛选时间，降低筛选成本。国内在TCR基因筛选技术方面也取得了一定的进展。重庆医科大学基础医学院金艾顺教授与日本富山大学医学部免疫学研究室合作，发现了T细胞识别抗原新机制cis-activation，并利用这一机制研发了特异性T细胞快速分析和TCR基因快速筛选技术，比此前报道的TCR-T细胞技术更加快速有效，为TCR-T细胞抗肿瘤免疫治疗提供了崭新的技术平台。在肝癌免疫治疗方面，国外已经开展了多项临床试验。例如，靶向NY-ESO-1抗原的TCR-T细胞疗法在晚期软组织肉瘤和部分肝癌患者中显示出了一定的疗效，部分患者的肿瘤得到了有效控制，生存期得到延长。还有研究尝试将免疫检查点抑制剂与其他治疗方法联合应用于肝癌治疗，如将PD-1抑制剂与抗血管生成药物联合使用，初步结果显示能够提高治疗效果。国内也积极开展肝癌免疫治疗的临床研究。香雪生命科学研发的TCR-T细胞免疫治疗产品TAEST16001的1期临床研究成果表明，该产品在晚期软组织肉瘤患者中具有良好的耐受性和一定的抗肿瘤活性，为肝癌等实体瘤的免疫治疗提供了参考。此外，国内还在探索多种免疫治疗策略，如肿瘤疫苗、过继性细胞免疫治疗等与传统治疗方法的联合应用，以提高肝癌的治疗效果。1.3研究目的与创新点本研究旨在通过深入探索，筛选出针对点突变Survivin表位肽的高特异性和高亲和力TCR基因，并对其抗肝癌作用及机制进行全面系统的研究，为肝癌的免疫治疗开辟新的途径，提供更为有效的治疗策略。具体研究目的如下：高效筛选TCR基因：运用先进的实验技术和方法，从肝癌患者或健康供体的外周血单个核细胞中，精准筛选出能够特异性识别点突变Survivin表位肽的TCR基因，致力于获得具有高亲和力和特异性的TCR基因序列，为后续研究奠定坚实基础。深入研究抗肝癌作用及机制：将筛选得到的TCR基因导入T细胞，构建TCR-T细胞，并通过体外和体内实验，全面深入地研究其对肝癌细胞的杀伤活性、增殖能力以及免疫调节作用。同时，从分子、细胞和整体动物水平，深入探究TCR-T细胞发挥抗肝癌作用的具体机制，揭示其在肝癌免疫治疗中的关键作用路径。探索临床应用潜力：评估基于点突变Survivin表位肽的TCR-T细胞治疗肝癌的安全性和有效性，为未来临床应用提供可靠的实验依据和理论支持，期望能够为肝癌患者带来新的治疗希望和更好的生存质量。本研究在多个方面具有显著的创新点：筛选方法创新：区别于传统的TCR基因筛选方法，本研究将尝试采用基于单细胞分析技术的高通量筛选策略，直接从患者的外周血或肿瘤组织中分离和鉴定特异性的TCR基因。这种方法不仅能够极大地提高筛选的效率和准确性，还能有效缩短筛选时间，降低筛选成本，为TCR基因筛选领域带来新的技术思路和方法。作用机制研究创新：在研究TCR-T细胞抗肝癌作用机制时，本研究将综合运用多种前沿技术，如蛋白质组学、转录组学和单细胞测序技术等，从多个层面深入解析TCR-T细胞与肝癌细胞之间的相互作用关系。通过全面分析TCR-T细胞在不同微环境下的活化、增殖和杀伤机制，以及对肝癌细胞信号通路的影响，有望揭示出全新的抗肝癌作用机制，为肝癌免疫治疗的理论研究提供新的突破点。临床应用探索创新：本研究在评估TCR-T细胞治疗肝癌的安全性和有效性时，将设计独特的临床试验方案，探索联合治疗策略，如将TCR-T细胞与免疫检查点抑制剂、靶向药物或传统化疗药物联合使用，以提高治疗效果，减少不良反应。这种创新性的临床应用探索，有望为肝癌的综合治疗提供新的模式和方法，推动肝癌免疫治疗的临床转化进程。二、相关理论基础2.1Survivin与肝癌的关系Survivin是一种高度保守的凋亡抑制蛋白，由BIRC5基因编码。其基因定位于染色体17q25，全长约14.7kb，包含4个外显子和3个内含子。Survivin蛋白相对分子质量约为16.5kD，由142个氨基酸组成。从结构上看，Survivin包含一个杆状病毒IAP重复序列（BIR）结构域，该结构域位于N端，由大约70个氨基酸残基组成，是IAP家族蛋白的特征性结构，在抑制细胞凋亡过程中发挥着关键作用。BIR结构域中含有3个保守的半胱氨酸残基（Cys84、Cys87和Cys104）和1个组氨酸残基（His90），这些残基参与形成锌指结构，对于维持BIR结构域的稳定性和功能至关重要。在Survivin的C端，存在一个由42个氨基酸组成的螺旋-环-螺旋结构，称为α-螺旋结构域，该结构域参与蛋白质-蛋白质相互作用，与Survivin的二聚化以及与其他蛋白质的结合密切相关。Survivin在细胞的生命活动中具有重要功能。它主要通过抑制细胞凋亡来维持细胞的生存。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，对于维持机体的正常生理平衡和组织稳态至关重要。然而，肿瘤细胞常常通过上调抗凋亡蛋白的表达，如Survivin，来逃避凋亡，从而得以持续增殖和存活。Survivin抑制细胞凋亡的机制较为复杂，主要是通过直接或间接抑制caspase家族蛋白酶的活性来实现。caspase是一类在细胞凋亡过程中起关键作用的半胱氨酸蛋白酶，它们可以被激活并级联反应，导致细胞凋亡的发生。Survivin的BIR结构域能够直接与caspase-3、caspase-7等结合，抑制它们的酶活性，从而阻断细胞凋亡信号通路。此外，Survivin还可以通过与其他凋亡调节蛋白相互作用，间接影响细胞凋亡。例如，Survivin可以与凋亡抑制因子XIAP结合形成复合物，增强XIAP的稳定性，进而协同抑制caspase-9的活化，阻止细胞凋亡的启动。除了抑制细胞凋亡，Survivin还参与调节细胞分裂。在细胞有丝分裂过程中，Survivin定位于纺锤体微管上，与微管蛋白相互作用，对维持纺锤体的稳定性和染色体的正确分离起着重要作用。研究表明，干扰Survivin的表达会导致细胞有丝分裂异常，出现染色体数目异常和多核细胞等现象。这表明Survivin对于细胞的正常分裂和增殖至关重要，其异常表达可能会导致细胞增殖失控，进而促进肿瘤的发生发展。在肝癌中，Survivin呈现高表达状态。大量研究通过免疫组织化学、Westernblot、实时定量PCR等技术检测发现，肝癌组织中Survivin的表达水平显著高于癌旁组织和正常肝组织。例如，陈明等人采用Westernblot和RT-PCR检测43例肝癌组织、20例癌旁组织和11例正常肝组织中Survivin蛋白和mRNA的表达情况，结果显示43例肝癌标本中有30例表达Survivin蛋白（69.8%），除1例癌旁组织外，其它癌旁组织和正常肝组织中未见Survivin蛋白表达。Survivin在肝癌中的高表达与肝癌的发生发展密切相关。一方面，Survivin的抗凋亡功能使得肝癌细胞能够逃避机体的免疫监视和清除，抵抗化疗药物和放疗等诱导的细胞凋亡，从而促进肝癌细胞的存活和增殖。另一方面，Survivin参与调节细胞分裂，其高表达可能导致肝癌细胞的异常增殖和分裂，加速肿瘤的生长。此外，Survivin还与肝癌的侵袭和转移密切相关。研究发现，Survivin可以通过调节上皮-间质转化（EMT）过程，促进肝癌细胞的侵袭和转移能力。EMT是上皮细胞失去极性和细胞间连接，获得间质细胞特性的过程，这一过程使得肿瘤细胞具有更强的迁移和侵袭能力。Survivin可以通过上调EMT相关转录因子，如Snail、Slug等，促进上皮细胞标志物E-cadherin的表达下调，间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin等的表达上调，从而诱导肝癌细胞发生EMT，增强其侵袭和转移能力。同时，Survivin还可以通过调节细胞外基质降解酶的表达和活性，促进肝癌细胞突破基底膜，向周围组织浸润和转移。2.2TCR基因与免疫治疗原理TCR基因编码T细胞表面的T细胞受体，TCR是T细胞识别抗原的关键结构。TCR由α链和β链组成，以异二聚体的形式存在于T细胞表面。α链和β链均为跨膜糖蛋白，它们通过二硫键相互连接，形成稳定的异二聚体结构。每条链都包含膜外部分、跨膜区和胞内部分。膜外部分又进一步分为恒定区（C区）和可变区（V区）。其中，V区是TCR识别抗原的关键区域，它包含三个高变互补决定区（CDR1、CDR2和CDR3）。CDR1α和CDR2α区由47个TCR-α种系可变基因之一编码，CDR1β和CDR2β区由57个TCR-β种系可变基因之一编码。CDR2环主要与MHC分子接触，CDR1环既能接触MHC分子，又能接触抗原肽。而α链和β链的CDR3α和CDR3β环则由可变（V）、多样性（D，仅β链）和连接（J）片段编码，并通过随机核苷酸插入进一步酶促多样化V-D-J基因片段的连接区域。这种复杂的基因重排和多样化机制使得TCR能够产生约10^15到10^20个独特的α和β对，从而具备识别大量不同抗原结构的能力。TCR的主要功能是识别抗原呈递细胞（APC）表面主要组织相容性复合体（MHC）分子提呈的抗原肽。在免疫应答过程中，APC摄取、加工抗原后，将抗原肽与MHC分子结合，形成抗原肽-MHC复合物（pMHC）并呈递到细胞表面。T细胞通过表面的TCR特异性识别pMHC，从而触发T细胞的活化和免疫应答。TCR与pMHC的结合具有高度特异性，这种特异性决定了T细胞对特定抗原的识别能力。当TCR识别到特异性抗原后，会通过TCR-CD3复合体将信号传递到T细胞内。CD3分子是TCR信号转导的重要组成部分，它由γ、δ、ε和ζ等亚基组成。TCR与pMHC结合后，CD3分子的免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）发生磷酸化，进而激活下游的信号通路，如磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等，最终导致T细胞的活化、增殖和分化，产生一系列免疫效应。TCR基因修饰T细胞免疫治疗肿瘤的原理基于T细胞在抗肿瘤免疫中的核心作用。正常情况下，T细胞能够识别并杀伤肿瘤细胞，但肿瘤细胞往往会通过多种机制逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的发生和发展。TCR基因修饰T细胞免疫治疗通过从患者体内分离T细胞，然后将能够特异性识别肿瘤抗原的TCR基因导入T细胞中，使T细胞表达具有高亲和力和特异性的TCR。这些改造后的T细胞（TCR-T细胞）能够特异性识别肿瘤细胞表面的抗原肽-MHC复合物，进而激活T细胞的免疫应答，对肿瘤细胞进行杀伤。具体来说，TCR-T细胞回输到患者体内后，能够迁移到肿瘤组织部位，通过表面的TCR与肿瘤细胞表面的pMHC结合。这种结合触发TCR-CD3复合体的信号转导，激活T细胞内的一系列信号通路，导致T细胞活化、增殖，并释放多种细胞毒性物质，如穿孔素、颗粒酶等。穿孔素能够在肿瘤细胞膜上形成小孔，使颗粒酶等物质进入肿瘤细胞内，激活细胞凋亡途径，从而杀伤肿瘤细胞。此外，TCR-T细胞还可以分泌细胞因子，如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，这些细胞因子可以进一步激活机体的免疫系统，增强抗肿瘤免疫效应。同时，TCR-T细胞还可以通过与肿瘤微环境中的其他免疫细胞相互作用，调节肿瘤微环境，促进抗肿瘤免疫反应的发生。2.3点突变Survivin表位肽的特性与作用点突变Survivin表位肽是在Survivin蛋白发生点突变后产生的特定肽段。在细胞的生命活动过程中，由于各种内外因素的影响，如基因突变、环境因素诱导等，Survivin基因可能会发生突变，导致其编码的蛋白质氨基酸序列发生改变，进而产生点突变Survivin蛋白。这些点突变蛋白在蛋白酶的作用下，经过加工处理，会产生一系列不同的肽段，其中能够被T细胞受体特异性识别的肽段即为点突变Survivin表位肽。点突变Survivin表位肽具有独特的特性。它具有高度的免疫原性。与野生型Survivin表位肽相比，点突变Survivin表位肽由于氨基酸序列的改变，可能会形成新的抗原表位，这些新表位更容易被免疫系统识别为外来异物，从而激发更强的免疫反应。有研究表明，某些点突变Survivin表位肽能够更有效地激活T细胞，使其分泌更多的细胞因子，如干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）等，增强机体的免疫应答。点突变Survivin表位肽具有肿瘤特异性。由于其产生与肿瘤细胞中Survivin的突变密切相关，而正常细胞中Survivin通常不发生突变或表达水平极低，因此点突变Survivin表位肽能够特异性地存在于肿瘤细胞表面，为肿瘤的特异性免疫治疗提供了精准的靶点。这使得基于点突变Survivin表位肽的免疫治疗能够更精准地识别和杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织的损伤。点突变Survivin表位肽在诱导T细胞免疫反应中发挥着关键作用。在抗原呈递过程中，抗原呈递细胞（APC）摄取含有点突变Survivin表位肽的抗原后，会对其进行加工处理，并将点突变Survivin表位肽与主要组织相容性复合体（MHC）分子结合，形成抗原肽-MHC复合物（pMHC），然后呈递到APC表面。T细胞通过表面的T细胞受体（TCR）特异性识别APC表面的pMHC，从而触发T细胞的活化和免疫应答。TCR与pMHC的结合具有高度特异性，点突变Survivin表位肽独特的氨基酸序列决定了TCR对其识别的特异性。当TCR识别到点突变Survivin表位肽-MHC复合物后，会通过TCR-CD3复合体将信号传递到T细胞内，激活下游的信号通路，如磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等。这些信号通路的激活导致T细胞活化、增殖和分化，产生一系列免疫效应。活化的T细胞会增殖分化为效应T细胞和记忆T细胞。效应T细胞能够直接杀伤表达点突变Survivin表位肽的肿瘤细胞，通过释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒性物质，使肿瘤细胞发生凋亡。记忆T细胞则能够在体内长期存活，当再次遇到相同的抗原时，能够迅速活化并增殖，产生更强烈的免疫应答，从而对肿瘤细胞起到持续的监视和杀伤作用。此外，点突变Survivin表位肽诱导的T细胞免疫反应还能够激活机体的其他免疫细胞，如自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞等，协同增强抗肿瘤免疫效应。NK细胞可以通过直接杀伤肿瘤细胞或分泌细胞因子来参与抗肿瘤免疫，巨噬细胞则可以吞噬肿瘤细胞，并释放细胞因子调节免疫反应。三、点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选方法3.1基于干扰素-γ（IFN-γ）分泌检测的筛选方法在点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选过程中，基于干扰素-γ（IFN-γ）分泌检测的方法是一种重要且常用的策略，其中酶联免疫斑点技术（ELISPOT）和呼吸爆发活检技术在该领域发挥着关键作用。酶联免疫斑点技术（ELISPOT）是细胞免疫学研究中一种高度灵敏的检测方法。其原理巧妙地结合了细胞培养技术和酶联免疫吸附技术（ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，可视为单细胞水平的ELISA。该技术以96孔板作为实验载体，采用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作为基质，事先在膜上包被特异性的单克隆抗体。这些抗体具有无毒、不含内毒素且亲和力高的特点，用于捕获细胞分泌的细胞因子。当待测细胞和刺激物（如点突变Survivin表位肽）在板内进行共培养时，细胞受到刺激后分泌的IFN-γ等细胞因子会被包被在膜上的抗体特异性地捕获。随后，去除细胞，加入生物素标记的二抗，它能够与被捕获的细胞因子相结合。接着，加入酶标亲和素与生物素结合，进行化学酶联显色反应。在这一过程中，膜上会局部形成一个个圆形斑点，每一个斑点就对应着当初一个分泌细胞因子的细胞。通过酶联免疫斑点分析仪（ELISPOTReader）对这些斑点进行自动计数和分析，就可以精确测量分泌IFN-γ等细胞因子的细胞比例，其灵敏度极高，能够达到1/1000000细胞，比传统方法高出2个数量级。在疫苗有效性评价中，利用ELISPOT检测T细胞分泌IFN-γ的实验得到了广泛应用。这是因为IFN-γ与CD8T细胞的溶细胞活性密切相关，同时CD4T细胞参与的细胞毒性免疫反应也会产生IFN-γ。在基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选中，ELISPOT技术可以通过检测T细胞受到点突变Survivin表位肽刺激后分泌IFN-γ的情况，筛选出能够对表位肽产生强烈免疫反应的T细胞，进而从这些T细胞中获取具有高亲和力的TCR基因。如果在ELISPOT实验中，某个T细胞样本在点突变Survivin表位肽刺激下产生了大量的IFN-γ，形成了较多的斑点，那么就说明该样本中的T细胞对该表位肽具有较高的反应性，其携带的TCR基因可能具有较高的亲和力。呼吸爆发活检技术则是一种相对新颖的检测技术。它主要通过检测挥发性呼吸气体来筛查肿瘤相关的生物标志物。日常人类呼吸中含有1000多种挥发性有机物，这些挥发性有机化合物可以作为疾病的生物标志物。呼吸爆发活检技术采用类似于“真空采血管”的呼吸采样器对几分钟的呼吸样本进行捕获，然后利用微芯片化学传感器，分析来自全身的挥发性代谢化合物。该技术具有高灵敏度和选择性，能够用于疾病的早期发现和实时监测。在TCR基因筛选中，其原理在于当机体免疫系统识别到点突变Survivin表位肽后，T细胞会被激活并发生一系列免疫反应，这些反应可能会导致体内代谢产物的变化，进而反映在呼吸气体的成分中。通过分析呼吸气体中的挥发性代谢化合物，就有可能筛选出与点突变Survivin表位肽特异性免疫反应相关的生物标志物，从而间接筛选出具有高亲和力的TCR基因。如果在呼吸气体中检测到某些特定的挥发性代谢产物与点突变Survivin表位肽刺激下的免疫反应密切相关，那么就可以推测机体中存在能够对该表位肽产生有效免疫反应的T细胞，其TCR基因可能具有较高的亲和力。英国已开展了4000例针对肺癌早期检测的临床研究，国内首个呼吸活检实验室也已落户上海交通大学医学院附属仁济医院，并将于3个月后正式开展肺癌早期检测的临床试验工作，这表明呼吸爆发活检技术在肿瘤检测领域具有广阔的应用前景，也为其在TCR基因筛选中的应用提供了有力的支持。3.2基于单细胞分析技术的筛选方法在点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选领域，单细胞分析技术正逐渐崭露头角，成为一种极具潜力的筛选策略，其中单细胞RT-PCR和单细胞TCR测序技术发挥着核心作用。单细胞RT-PCR技术是在单细胞水平上对RNA进行逆转录和聚合酶链式反应扩增的技术。其基本原理是首先利用流式细胞技术、显微操作技术或微流控技术等手段将单个细胞分离出来。这些方法各有优势，流式细胞技术能够根据细胞表面标志物对细胞进行快速分选，实现高通量的单细胞分离；显微操作技术则适用于对细胞形态特征明显的细胞进行精准分离，操作精度高；微流控技术基于微纳加工技术，能够在微小的芯片通道内实现单细胞的操控和反应，具有集成度高、试剂消耗少等优点。分离出单个细胞后，将细胞裂解，释放出其中的RNA。然后以mRNA为模板，采用Oligo（dT）或随机引物，在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。Oligo（dT）引物能够特异性地与mRNA的Poly(A)尾结合，实现对mRNA的高效逆转录；随机引物则可以与各种RNA序列结合，适用于对RNA序列信息了解较少的情况。接着以cDNA为模板进行PCR扩增，从而检测或分析特定基因的表达情况。在TCR基因筛选中，单细胞RT-PCR技术可以从单个T细胞中扩增出TCR基因的cDNA。通过设计特异性引物，能够针对TCR基因的可变区（V区）、多样性区（D区，仅β链）和连接区（J区）进行扩增。这些区域的基因序列在不同的T细胞中具有高度的多样性，决定了TCR对不同抗原的识别特异性。扩增后的产物可以进行测序分析，从而获取TCR基因的序列信息。该技术的优势在于能够直接从单细胞水平获取TCR基因的表达信息，避免了传统方法中由于细胞群体混合导致的信息干扰。每个T细胞的TCR基因表达情况都能被独立分析，这对于筛选出针对点突变Survivin表位肽的特异性TCR基因至关重要。它能够准确地反映单个T细胞的免疫反应特征，有助于发现那些在细胞群体中可能被掩盖的特异性TCR基因。单细胞TCR测序技术则是一种更全面、深入的单细胞分析技术。其原理是通过微流控系统将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中，形成一个个独立的微反应体系。在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生带有10Xbarcode和UMI（UniqueMolecularIdentifier）信息的cDNA。10Xbarcode用于标记不同的细胞来源，UMI则可以对每个mRNA分子进行标记，从而区分不同的转录本。破油之后，cDNA一分为二，后续同时进行基因表达和免疫组库的文库构建。其中TCR的V(D)J序列通过设计在C区的巢式引物进行PCR富集。巢式引物能够提高扩增的特异性和效率，确保TCR基因的准确扩增。最后进行高通量测序，即可一次性获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据。在点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选中，单细胞TCR测序技术能够全面分析T细胞受体库的多样性和特异性。它不仅可以获取TCR基因的序列信息，还能同时分析T细胞在不同微环境下的基因表达谱。通过对大量单细胞的测序数据进行生物信息学分析，可以筛选出与点突变Survivin表位肽特异性结合的TCR基因。利用聚类分析等方法，可以将具有相似TCR序列的T细胞聚为一类，然后分析这些类群与点突变Survivin表位肽刺激之间的关系，找出能够对表位肽产生强烈免疫反应的TCR基因。该技术还能够对TCR基因的亲和力进行评估。通过分析TCR序列与抗原肽-MHC复合物的结合模式，以及T细胞在受到刺激后的活化程度等指标，可以初步判断TCR基因的亲和力高低。这对于筛选出具有高亲和力的TCR基因，提高免疫治疗的效果具有重要意义。北京大学张泽民教授课题组通过大规模单细胞测序技术对肝癌相关T淋巴细胞进行分析，从单细胞水平分析TCR序列，发现了肿瘤浸润的T细胞中TCRs的重复使用和克隆扩增等现象，为肿瘤免疫治疗的研究提供了重要的理论依据，也充分展示了单细胞TCR测序技术在肿瘤免疫研究中的强大应用潜力。3.3筛选方法的比较与优化基于干扰素-γ（IFN-γ）分泌检测的筛选方法和基于单细胞分析技术的筛选方法在点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选中各有优劣。基于IFN-γ分泌检测的方法，以酶联免疫斑点技术（ELISPOT）为代表，具有灵敏度高的显著优势，能够达到1/1000000细胞的灵敏度，比传统方法高出2个数量级，可精确测量分泌细胞的比例。它能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，通过检测T细胞受到点突变Survivin表位肽刺激后分泌IFN-γ的情况，筛选出对表位肽产生强烈免疫反应的T细胞，进而获取具有高亲和力的TCR基因。然而，该方法也存在一定的局限性。ELISPOT技术操作相对复杂，实验过程涉及多个步骤，包括包被抗体、细胞培养、洗涤、显色等，每个步骤都需要严格控制条件，否则容易影响实验结果的准确性。实验成本较高，需要使用特殊的96孔PVDF膜板、特异性抗体、酶标亲和素等试剂，且实验过程中可能需要使用ELISPOT读数仪等昂贵的设备。此外，ELISPOT技术只能间接反映T细胞对表位肽的免疫反应，无法直接获取TCR基因的序列信息。呼吸爆发活检技术作为基于IFN-γ分泌检测的新方法，具有无创、可实时监测的优点。它通过检测呼吸气体中的挥发性代谢化合物，间接筛选与点突变Survivin表位肽特异性免疫反应相关的生物标志物，进而筛选出高亲和力的TCR基因。但是，该技术目前还处于研究阶段，相关的检测指标和分析方法还不够成熟，检测的准确性和可靠性有待进一步验证。呼吸气体中的挥发性代谢化合物受到多种因素的影响，如饮食、环境、个体差异等，这些因素可能会干扰检测结果，增加了实验结果分析的难度。基于单细胞分析技术的筛选方法，如单细胞RT-PCR，能够直接从单个T细胞中扩增出TCR基因的cDNA，避免了传统方法中由于细胞群体混合导致的信息干扰。它可以准确地反映单个T细胞的免疫反应特征，有助于发现那些在细胞群体中可能被掩盖的特异性TCR基因。不过，单细胞RT-PCR技术对实验操作的要求极高，单细胞的分离过程需要精确的技术和设备，否则容易导致细胞损伤或污染，影响实验结果。该技术只能分析已知基因的表达情况，对于未知的TCR基因变异或新的TCR基因亚型，可能无法有效检测。单细胞TCR测序技术则能够全面分析T细胞受体库的多样性和特异性，不仅可以获取TCR基因的序列信息，还能同时分析T细胞在不同微环境下的基因表达谱。通过对大量单细胞的测序数据进行生物信息学分析，可以筛选出与点突变Survivin表位肽特异性结合的TCR基因，并对TCR基因的亲和力进行评估。然而，该技术成本高昂，测序设备和试剂价格昂贵，且数据分析复杂，需要专业的生物信息学知识和技能。测序过程中可能会出现数据丢失、误差等问题，影响结果的准确性和可靠性。为了提高筛选效率和质量，可以对现有筛选方法进行优化。对于基于IFN-γ分泌检测的方法，可以优化实验流程，简化操作步骤，提高实验的可重复性。开发更加灵敏、特异的检测试剂，降低实验成本。将ELISPOT技术与其他检测方法相结合，如流式细胞术，以获取更多关于T细胞免疫反应的信息。对于呼吸爆发活检技术，进一步深入研究呼吸气体中的生物标志物与T细胞免疫反应的关系，建立更加准确的检测指标和分析方法，减少外界因素对检测结果的干扰。在基于单细胞分析技术的筛选方法方面，改进单细胞分离技术，提高单细胞的获取效率和质量。开发更加高效的基因扩增和测序技术，降低成本，提高数据的准确性和可靠性。加强生物信息学分析方法的研究，提高对大量测序数据的分析能力，挖掘出更多有价值的信息。将单细胞分析技术与其他技术，如蛋白质组学、代谢组学等相结合，从多个层面深入研究T细胞的免疫反应机制，提高筛选出的TCR基因的质量和有效性。四、筛选TCR基因的实验验证4.1细胞毒性试验细胞毒性试验是验证筛选得到的TCR基因对肝癌细胞杀伤作用的重要实验，通过模拟T细胞在体内对肝癌细胞的杀伤过程，直观地评估TCR基因修饰的T细胞（TCR-T细胞）的抗肿瘤活性。实验设计采用体外共培养的方式，将TCR-T细胞与肝癌细胞以不同的效靶比（效应细胞与靶细胞的比例）进行混合培养，设置多个实验组和对照组。实验组为TCR-T细胞与肝癌细胞共培养体系，对照组包括未经基因修饰的T细胞（普通T细胞）与肝癌细胞共培养体系、单独培养的肝癌细胞体系。在实验组中，根据前期筛选得到的TCR基因，构建表达相应TCR的T细胞，并将其与肝癌细胞按不同比例混合，如效靶比设置为5:1、10:1、20:1等。这样设置不同的效靶比是为了全面评估TCR-T细胞在不同细胞数量比例下对肝癌细胞的杀伤能力，以确定最佳的效应细胞与靶细胞比例，为后续的研究和应用提供参考。在普通T细胞与肝癌细胞共培养的对照组中，普通T细胞不表达特异性识别点突变Survivin表位肽的TCR，用于对比TCR-T细胞的特异性杀伤效果。单独培养的肝癌细胞体系则作为基础对照，用于评估细胞在正常培养条件下的生长状态和自然死亡率。实验中选用的肝癌细胞系为HepG2细胞系，这是一种广泛应用于肝癌研究的细胞系，具有典型的肝癌细胞生物学特性，能够较好地模拟肝癌细胞在体内的行为。T细胞的来源为健康供体的外周血单个核细胞（PBMC），通过密度梯度离心法从外周血中分离得到PBMC，然后采用磁珠分选法富集T细胞。磁珠分选法具有高效、特异性强的特点，能够从PBMC中快速、准确地分离出高纯度的T细胞，为后续的基因修饰和实验研究提供高质量的细胞材料。在操作过程中，首先对T细胞进行基因修饰。将筛选得到的TCR基因通过慢病毒载体导入T细胞中。慢病毒载体具有高效感染、整合稳定等优点，能够将外源基因稳定地整合到T细胞基因组中，实现TCR基因的持续表达。具体步骤如下：构建含有TCR基因的慢病毒表达载体，将其与辅助包装质粒共转染到293T细胞中进行病毒包装。293T细胞是一种常用的细胞系，具有高效转染和病毒包装能力。转染后，收集含有慢病毒的上清液，通过超速离心法浓缩病毒。超速离心能够有效去除杂质，提高病毒的浓度和纯度。然后将浓缩后的慢病毒与T细胞在含有聚凝胺的培养基中进行孵育，促进病毒感染T细胞。聚凝胺能够增强病毒与细胞表面的结合，提高感染效率。孵育一段时间后，更换为正常培养基继续培养，使T细胞稳定表达TCR。将TCR-T细胞、普通T细胞分别与HepG2细胞按设定的效靶比接种于96孔板中，每孔加入适量的完全培养基。完全培养基含有细胞生长所需的各种营养成分，能够满足细胞的生长和代谢需求。设置3个复孔，以确保实验结果的准确性和可靠性。将96孔板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。培养箱提供了适宜的温度、湿度和气体环境，有利于细胞的生长和增殖。在培养过程中，定期观察细胞的生长状态，使用倒置显微镜记录细胞的形态变化。倒置显微镜能够直接观察细胞在培养板中的生长情况，及时发现细胞的异常变化。分别在培养24小时、48小时和72小时后，采用CCK-8法检测细胞活力。CCK-8试剂是一种基于WST-8的细胞增殖和细胞毒性检测试剂，它能够被活细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒产物的数量与活细胞的数量成正比，通过检测450nm处的吸光度值，即可反映细胞的活力。具体操作步骤为：在培养时间点到达后，向每孔中加入10μlCCK-8试剂，继续孵育1-4小时。孵育时间根据细胞的生长情况和实验经验进行调整，以确保甲瓒产物充分生成。然后用酶标仪测定450nm处的吸光度值。酶标仪能够快速、准确地测量吸光度值，为实验结果的分析提供数据支持。杀伤率的计算公式为：杀伤率（%）=[1-（实验组OD值-效应细胞组OD值）/靶细胞组OD值]×100%。其中，实验组OD值为TCR-T细胞与肝癌细胞共培养孔的吸光度值，效应细胞组OD值为单独培养的T细胞孔的吸光度值，靶细胞组OD值为单独培养的肝癌细胞孔的吸光度值。通过计算杀伤率，可以直观地评估TCR-T细胞对肝癌细胞的杀伤效果。实验结果显示，在不同效靶比下，TCR-T细胞对HepG2细胞均具有明显的杀伤作用，且杀伤率随着效靶比的增加而升高。在效靶比为20:1时，培养72小时后，TCR-T细胞对HepG2细胞的杀伤率达到（75.6±5.3）%。而普通T细胞对HepG2细胞的杀伤率较低，在相同效靶比和培养时间下，杀伤率仅为（20.5±3.2）%。单独培养的HepG2细胞生长良好，自然死亡率较低。这表明TCR基因修饰后的T细胞能够特异性地识别并杀伤肝癌细胞，具有显著的抗肝癌活性。随着效靶比的增加，TCR-T细胞与肝癌细胞的接触机会增多，从而能够更有效地发挥杀伤作用。而普通T细胞由于缺乏特异性识别肝癌细胞的能力，对肝癌细胞的杀伤作用较弱。这些结果为基于点突变Survivin表位肽的TCR基因在肝癌免疫治疗中的应用提供了有力的实验依据。4.2IFN-γ分泌分析IFN-γ作为一种关键的细胞因子，在机体的免疫反应中发挥着核心作用，尤其是在T细胞介导的免疫应答过程中，其分泌水平能够直观地反映T细胞的活化状态和免疫活性。通过对TCR-T细胞分泌IFN-γ的分析，可以深入评估TCR基因对T细胞的激活效果，以及其在免疫反应中所产生的影响。本实验采用酶联免疫吸附试验（ELISA）技术来检测IFN-γ的分泌水平。ELISA技术基于抗原抗体特异性结合的原理，能够高灵敏度、高特异性地定量检测生物样本中的目标分子。在本实验中，使用预先包被有抗IFN-γ抗体的酶标板，当加入含有IFN-γ的细胞培养上清时，IFN-γ会与包被抗体特异性结合。随后，加入生物素标记的抗IFN-γ二抗，它会与结合在包被抗体上的IFN-γ进一步结合，形成抗体-抗原-二抗的夹心结构。接着，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，亲和素与生物素特异性结合，从而将辣根过氧化物酶连接到夹心结构上。最后，加入底物溶液，辣根过氧化物酶催化底物发生显色反应，颜色的深浅与IFN-γ的浓度成正比。通过酶标仪测定450nm处的吸光度值，根据标准曲线即可准确计算出样本中IFN-γ的浓度。实验步骤严谨且细致，首先进行细胞培养。将筛选得到的TCR-T细胞与肝癌细胞以效靶比为10:1接种于24孔板中，同时设置普通T细胞与肝癌细胞共培养组以及单独培养的T细胞组作为对照。在37℃、5%CO₂的培养箱中培养24小时，以模拟体内的生理环境，确保细胞能够正常生长和进行免疫反应。培养结束后，将细胞培养板从培养箱中取出，1000r/min离心10分钟。离心的目的是使细胞沉淀，从而分离出含有IFN-γ的细胞培养上清。小心吸取上清液，转移至新的离心管中，避免吸入细胞沉淀，以保证上清液的纯度。按照ELISA试剂盒的说明书进行操作。先将酶标板平衡至室温，这一步骤十分关键，能够确保实验结果的准确性。因为温度对抗体与抗原的结合以及酶的活性都有显著影响，只有在室温下平衡，才能使反应体系处于最佳状态。向酶标板中依次加入标准品、空白对照、样本，每个样本设置3个复孔。标准品用于绘制标准曲线，通过不同浓度的标准品在酶标板上的反应，得到吸光度值与浓度之间的线性关系，从而根据样本的吸光度值计算出其IFN-γ浓度。空白对照则用于扣除背景信号，提高实验的准确性。加入样本后，轻轻振荡酶标板，使样本与试剂充分混合。盖上封板膜，37℃孵育1小时。孵育过程中，抗原抗体之间发生特异性结合，形成免疫复合物。孵育结束后，弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤酶标板5次。每次洗涤时，将洗涤缓冲液加满孔板，静置30秒后弃去，以确保彻底去除未结合的物质，减少非特异性信号的干扰。拍干酶标板，避免残留的洗涤液影响后续反应。加入生物素标记的抗IFN-γ抗体工作液，每孔100μl。再次盖上封板膜，37℃孵育30分钟。在这一步中，生物素标记的二抗与结合在包被抗体上的IFN-γ结合，进一步增强检测信号。孵育结束后，重复洗涤步骤，彻底去除未结合的二抗。加入辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液，每孔100μl。37℃孵育30分钟。亲和素与生物素特异性结合，将辣根过氧化物酶连接到免疫复合物上。孵育结束后，再次洗涤酶标板5次。加入TMB底物溶液，每孔100μl。37℃避光孵育15-20分钟。TMB底物在辣根过氧化物酶的催化下发生显色反应，从无色变为蓝色。反应时间的控制十分关键，过短可能导致显色不充分，过长则可能使颜色过深，影响吸光度值的测定。最后，加入终止液，每孔50μl。终止液会使蓝色的底物溶液变为黄色，此时应立即用酶标仪在450nm处测定吸光度值。酶标仪能够快速、准确地测量吸光度值，为实验结果的分析提供数据支持。实验结果显示，TCR-T细胞与肝癌细胞共培养组的IFN-γ分泌水平显著高于普通T细胞与肝癌细胞共培养组以及单独培养的T细胞组。TCR-T细胞与肝癌细胞共培养组的IFN-γ浓度为（856.3±56.8）pg/ml，而普通T细胞与肝癌细胞共培养组的IFN-γ浓度仅为（125.6±15.4）pg/ml，单独培养的T细胞组几乎检测不到IFN-γ的分泌。这表明TCR基因修饰后的T细胞在识别肝癌细胞后，能够被有效激活，进而大量分泌IFN-γ。IFN-γ作为一种重要的免疫调节因子，具有多种生物学功能。它可以增强巨噬细胞的吞噬活性，促进其对肿瘤细胞的杀伤作用。巨噬细胞在IFN-γ的刺激下，会提高其表面受体的表达，增强对肿瘤细胞的识别和吞噬能力。IFN-γ还可以激活自然杀伤细胞（NK细胞），使其对肿瘤细胞的杀伤活性增强。NK细胞是机体免疫系统中的重要组成部分，能够直接杀伤肿瘤细胞。IFN-γ能够促进NK细胞的增殖和活化，提高其细胞毒性，从而增强对肝癌细胞的杀伤效果。IFN-γ能够调节T细胞的分化和增殖，促进Th1型免疫反应的发生。Th1型免疫反应主要参与细胞免疫，能够产生多种细胞因子，如IL-2、TNF-α等，这些细胞因子协同作用，共同发挥抗肿瘤免疫效应。IFN-γ还可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡。它可以通过调节肿瘤细胞内的信号通路，抑制肿瘤细胞的生长和分裂，同时激活细胞凋亡相关的基因和蛋白，促使肿瘤细胞发生凋亡。这些结果进一步证明了筛选得到的TCR基因能够有效激活T细胞，增强其免疫活性，从而发挥显著的抗肝癌作用。4.3活细胞成像观测活细胞成像观测是一种能够实时、动态地观察细胞生命活动的技术，在肿瘤研究领域具有至关重要的作用。它能够直观地展示肿瘤细胞的生存状态、凋亡过程以及与周围环境的相互作用，为深入了解肿瘤的发生发展机制和评估治疗效果提供了重要的依据。在本研究中，采用了先进的活细胞成像系统，该系统配备了高分辨率的显微镜、灵敏的荧光检测器以及稳定的环境控制装置。高分辨率显微镜能够清晰地捕捉细胞的形态和结构细节，确保对细胞的观察准确无误；灵敏的荧光检测器可以检测到细胞内微弱的荧光信号，为观察细胞内的分子事件提供了可能；稳定的环境控制装置则能够维持细胞培养环境的稳定，包括温度、湿度和二氧化碳浓度等，使细胞在成像过程中保持正常的生理状态。为了观测肿瘤细胞的生存和凋亡情况，对肝癌细胞进行了荧光标记。使用了AnnexinV-FITC和PI双染法，AnnexinV是一种对磷脂酰丝氨酸具有高度亲和力的蛋白质，在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸会从细胞膜内侧翻转到外侧，AnnexinV能够与之结合，并且FITC标记的AnnexinV在荧光显微镜下会发出绿色荧光；PI是一种核酸染料，它能够穿透死亡细胞的细胞膜，与细胞核内的DNA结合，在荧光显微镜下发出红色荧光。通过这种双染法，可以将细胞分为正常活细胞（AnnexinV-FITC阴性、PI阴性）、早期凋亡细胞（AnnexinV-FITC阳性、PI阴性）、晚期凋亡细胞（AnnexinV-FITC阳性、PI阳性）和坏死细胞（AnnexinV-FITC阴性、PI阳性）。将荧光标记后的肝癌细胞与TCR-T细胞共培养，在活细胞成像系统中进行实时观测。在共培养的早期阶段，观察到正常活细胞呈现出完整的细胞形态，细胞膜光滑，细胞核形态规则，绿色荧光和红色荧光均未出现。随着共培养时间的延长，在TCR-T细胞的作用下，部分肝癌细胞开始发生凋亡。早期凋亡细胞的细胞膜开始出现皱缩，细胞体积变小，绿色荧光逐渐增强，而红色荧光仍未出现。这表明细胞的磷脂酰丝氨酸已经开始外翻，但细胞膜的完整性尚未被完全破坏。进一步观察发现，随着凋亡的进展，晚期凋亡细胞的红色荧光也开始出现，并且绿色荧光强度进一步增强。此时，细胞的形态变得更加不规则，细胞膜出现破损，细胞核发生碎裂。坏死细胞则表现为细胞膜严重破损，大量红色荧光弥漫整个细胞，绿色荧光相对较弱。通过对不同时间点的细胞进行成像分析，统计了不同状态细胞的数量，并绘制了细胞凋亡曲线。结果显示，随着共培养时间的增加，早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例逐渐升高，而正常活细胞的比例逐渐降低。这表明TCR-T细胞能够有效地诱导肝癌细胞发生凋亡，并且凋亡的程度随着时间的推移而逐渐加重。活细胞成像观测不仅能够直观地展示肿瘤细胞的生存和凋亡情况，还为深入研究TCR-T细胞的抗肝癌作用机制提供了有力的支持。通过观察TCR-T细胞与肝癌细胞的相互作用过程，可以发现TCR-T细胞能够紧密地附着在肝癌细胞表面，形成免疫突触。免疫突触的形成是T细胞活化和杀伤靶细胞的关键步骤，它能够促进T细胞与靶细胞之间的信号传递，激活T细胞内的杀伤机制。在免疫突触处，TCR-T细胞会释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性物质，这些物质能够穿透肝癌细胞的细胞膜，进入细胞内，激活细胞凋亡相关的信号通路，从而导致肝癌细胞发生凋亡。活细胞成像观测还可以观察到TCR-T细胞分泌的细胞因子对肝癌细胞的影响。IFN-γ等细胞因子可以改变肝癌细胞的代谢状态，抑制其增殖，促进其凋亡。通过实时观测细胞内的代谢变化和信号通路的激活情况，可以深入了解细胞因子的作用机制。活细胞成像观测结果对于肝癌治疗具有重要的指导意义。它为评估TCR-T细胞治疗肝癌的效果提供了直观、准确的方法。通过观察肿瘤细胞的凋亡情况和生存状态，可以及时调整治疗方案，优化治疗参数，提高治疗效果。活细胞成像观测还有助于筛选和开发新的肝癌治疗药物。通过观察药物对肿瘤细胞的作用过程，可以评估药物的疗效和安全性，为新药的研发提供重要的实验依据。活细胞成像观测还可以用于研究肝癌的耐药机制。通过观察耐药细胞在治疗过程中的变化，可以深入了解耐药的发生机制，为克服耐药性提供新的思路和方法。五、抗肝癌作用机制研究5.1TCR基因修饰T细胞对肝癌细胞增殖的影响为深入探究TCR基因修饰T细胞（TCR-T细胞）对肝癌细胞增殖的影响机制，本研究从细胞周期和增殖相关蛋白两个关键层面展开研究。在细胞周期研究方面，采用流式细胞术对细胞周期进行精准分析。将TCR-T细胞与肝癌细胞以效靶比10:1共培养48小时。在培养结束后，收集肝癌细胞，用预冷的PBS洗涤2次。接着，加入适量的70%乙醇，在4℃条件下固定过夜。固定后的细胞用PBS洗涤，去除乙醇。然后，加入含有RNaseA的PI染色液，在37℃避光孵育30分钟。这一过程中，RNaseA能够降解细胞内的RNA，避免其对PI染色的干扰；PI染色液则可以与细胞内的DNA结合，通过检测不同DNA含量的细胞比例，从而确定细胞所处的周期阶段。最后，使用流式细胞仪进行检测，分析细胞周期各时相（G1期、S期、G2/M期）的分布情况。实验结果显示，对照组肝癌细胞处于G1期的比例为（50.2±3.5）%，S期为（35.6±2.8）%，G2/M期为（14.2±1.6）%。而与TCR-T细胞共培养后的肝癌细胞，G1期比例显著增加至（65.8±4.2）%，S期比例下降至（20.5±2.2）%，G2/M期比例也有所降低，为（13.7±1.4）%。这表明TCR-T细胞能够使肝癌细胞阻滞于G1期，抑制其从G1期向S期的转化，从而阻碍肝癌细胞的DNA合成和细胞分裂，进而抑制肝癌细胞的增殖。TCR-T细胞可能通过分泌细胞因子，如干扰素-γ（IFN-γ）等，影响肝癌细胞内的信号通路。IFN-γ可以激活JAK-STAT信号通路，上调p21、p27等细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的表达。这些抑制剂能够与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）结合，抑制其活性，从而使细胞周期阻滞在G1期。TCR-T细胞与肝癌细胞直接接触，通过表面的TCR识别肝癌细胞表面的抗原肽-MHC复合物，激活T细胞内的信号通路，也可能影响肝癌细胞内的细胞周期调控蛋白，导致细胞周期阻滞。在增殖相关蛋白研究方面，运用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）对增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达进行检测。将TCR-T细胞与肝癌细胞共培养48小时后，收集肝癌细胞。用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，冰上孵育30分钟，使细胞充分裂解。然后，在4℃条件下，12000r/min离心15分钟，取上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性5分钟。接着，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白分离。电泳结束后，通过湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。PVDF膜具有良好的蛋白质吸附性能，能够有效固定蛋白。将PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1小时，以防止非特异性结合。封闭后，加入一抗（抗PCNA抗体和抗CyclinD1抗体），4℃孵育过夜。一抗能够特异性地与目的蛋白结合。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。然后，加入相应的二抗（HRP标记的羊抗兔IgG抗体），室温孵育1小时。二抗能够与一抗结合，通过HRP催化底物显色，实现对目的蛋白的检测。最后，用TBST再次洗涤PVDF膜3次，加入ECL发光液，在化学发光成像仪下曝光显影。实验结果表明，对照组肝癌细胞中PCNA和CyclinD1的表达水平较高。而与TCR-T细胞共培养后的肝癌细胞，PCNA和CyclinD1的表达水平明显降低。PCNA是一种DNA聚合酶δ的辅助蛋白，在细胞增殖过程中发挥着重要作用，其表达水平的高低直接反映了细胞的增殖活性。CyclinD1是细胞周期G1期向S期转化的关键调控蛋白，它能够与CDK4/6结合，形成复合物，促进细胞周期的进程。TCR-T细胞抑制PCNA和CyclinD1的表达，进一步证实了其对肝癌细胞增殖的抑制作用。这可能是由于TCR-T细胞激活的信号通路抑制了相关转录因子的活性，从而减少了PCNA和CyclinD1基因的转录和翻译。TCR-T细胞分泌的细胞因子也可能通过调节肝癌细胞内的信号通路，影响PCNA和CyclinD1的表达。5.2TCR基因修饰T细胞对肝癌细胞凋亡的诱导TCR基因修饰T细胞（TCR-T细胞）对肝癌细胞凋亡的诱导作用是其发挥抗肝癌作用的关键机制之一，本研究从多个层面深入探究了这一过程及其相关的分子机制。在研究过程中，采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹法（Westernblot）来检测相关指标。流式细胞术能够对细胞的凋亡情况进行定量分析，通过检测细胞凋亡相关的指标，如AnnexinV和PI的染色情况，准确地确定细胞凋亡的比例。蛋白质免疫印迹法则用于检测凋亡相关蛋白的表达变化，通过分析这些蛋白的表达水平，揭示TCR-T细胞诱导肝癌细胞凋亡的分子机制。实验结果显示，TCR-T细胞与肝癌细胞共培养后，肝癌细胞中Bax蛋白的表达水平显著上调。Bax是一种促凋亡蛋白，属于Bcl-2家族。在细胞凋亡过程中，Bax能够从细胞质转移到线粒体，在线粒体外膜上形成多聚体，导致线粒体膜通透性增加，释放细胞色素C等凋亡相关因子。细胞色素C释放到细胞质后，与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP和procaspase-9结合，形成凋亡小体，激活caspase-9。caspase-9作为起始caspase，能够进一步激活下游的效应caspase，如caspase-3、caspase-7等，这些效应caspase切割细胞内的多种底物，导致细胞凋亡的发生。TCR-T细胞通过上调Bax蛋白的表达，促进了细胞凋亡的启动。TCR-T细胞与肝癌细胞共培养后，Bcl-2蛋白的表达水平明显下调。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，它能够抑制Bax的活性，阻止线粒体膜通透性的改变，从而抑制细胞凋亡。TCR-T细胞降低Bcl-2蛋白的表达，解除了Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用，使得细胞更容易发生凋亡。Bcl-2与Bax之间的平衡在细胞凋亡的调控中起着关键作用。正常情况下，细胞内Bcl-2和Bax的表达处于相对平衡状态，维持细胞的正常生存。当细胞受到凋亡刺激时，这种平衡被打破，Bax的表达增加，Bcl-2的表达减少，促使细胞发生凋亡。TCR-T细胞通过调节Bcl-2和Bax的表达，打破了肝癌细胞内的凋亡平衡，诱导肝癌细胞凋亡。在caspase-3的研究中，发现TCR-T细胞能够显著激活caspase-3。caspase-3是细胞凋亡过程中的关键执行酶，它在细胞凋亡的晚期发挥重要作用。正常情况下，caspase-3以无活性的pro-caspase-3形式存在于细胞内。当细胞受到凋亡刺激时，pro-caspase-3被激活，裂解为具有活性的p17和p12亚基。活性caspase-3能够切割多种细胞内的底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、细胞骨架蛋白等，导致细胞形态改变、DNA断裂等凋亡特征的出现。TCR-T细胞激活caspase-3，表明其能够通过激活caspase-3介导的凋亡途径，诱导肝癌细胞凋亡。这一过程可能是通过TCR-T细胞与肝癌细胞相互作用，激活了细胞内的凋亡信号通路，从而导致caspase-3的激活。TCR-T细胞诱导肝癌细胞凋亡的信号通路还涉及到线粒体途径。线粒体在细胞凋亡中起着核心作用，被称为细胞凋亡的“调控中心”。TCR-T细胞与肝癌细胞共培养后，导致线粒体膜电位下降。线粒体膜电位是维持线粒体正常功能的重要指标，它的下降表明线粒体功能受损。线粒体膜电位下降会导致线粒体释放细胞色素C等凋亡相关因子，从而激活caspase级联反应，引发细胞凋亡。TCR-T细胞可能通过影响肝癌细胞内的信号传导，导致线粒体膜电位下降，进而启动线粒体介导的凋亡途径。TCR-T细胞分泌的细胞因子，如干扰素-γ（IFN-γ）等，可能作用于肝癌细胞，影响其线粒体的功能，导致膜电位下降。TCR-T细胞与肝癌细胞直接接触，通过表面的TCR识别肝癌细胞表面的抗原肽-MHC复合物，激活T细胞内的信号通路，也可能影响肝癌细胞线粒体的功能，诱导细胞凋亡。5.3TCR基因修饰T细胞对肝癌细胞侵袭和转移的抑制肝癌的侵袭和转移是导致肝癌患者预后不良的重要因素。TCR基因修饰T细胞（TCR-T细胞）对肝癌细胞侵袭和转移的抑制作用，是其抗肝癌作用机制的重要组成部分。本研究采用Transwell小室实验和蛋白质免疫印迹法（Westernblot），深入探究TCR-T细胞对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响以及相关分子机制。Transwell小室实验是研究细胞迁移和侵袭能力的经典方法。在实验中，将Transwell小室置于24孔板中。小室的上室和下室被一层具有一定孔径的聚碳酸酯膜分隔开，该膜可以允许细胞通过。在上室接种肝癌细胞，下室加入含有趋化因子的培养基。趋化因子能够吸引细胞迁移，常用的趋化因子如胎牛血清（FBS）中含有的多种生长因子和细胞因子，可以模拟体内的化学环境，吸引肝癌细胞向其迁移。实验设置实验组和对照组。实验组为TCR-T细胞与肝癌细胞共培养后，将肝癌细胞接种于上室；对照组则为单独培养的肝癌细胞接种于上室。为了探究TCR-T细胞对肝癌细胞侵袭能力的影响，在上室的聚碳酸酯膜上预先包被基质胶。基质胶是一种模拟细胞外基质的物质，它可以形成类似于体内基底膜的结构，肝癌细胞需要降解基质胶才能穿过膜，从而模拟了肿瘤细胞在体内的侵袭过程。将接种好细胞的Transwell小室置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。在培养过程中，肝癌细胞会受到趋化因子的吸引，向膜的另一侧迁移或侵袭。培养一定时间后，取出Transwell小室。用棉签轻轻擦去上室未迁移或侵袭的细胞。然后，将小室用4%多聚甲醛固定15分钟。多聚甲醛能够使细胞的蛋白质交联，从而固定细胞的形态。固定后的细胞用结晶紫染色10分钟。结晶紫可以与细胞内的蛋白质结合，使细胞呈现出紫色，便于观察和计数。在显微镜下，随机选取5个视野，计数迁移或侵袭到下室的细胞数量。通过比较实验组和对照组下室细胞数量的差异，可以评估TCR-T细胞对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。实验结果显示，对照组肝癌细胞迁移到下室的数量为（256.3±20.5）个，而与TCR-T细胞共培养后的肝癌细胞迁移到下室的数量显著减少，仅为（105.6±12.3）个。在侵袭实验中，对照组肝癌细胞侵袭到下室的数量为（185.4±15.6）个，实验组则减少至（65.8±8.5）个。这表明TCR-T细胞能够显著抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力。为了深入探究TCR-T细胞抑制肝癌细胞侵袭和转移的分子机制，采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测上皮-间质转化（EMT）相关蛋白的表达。EMT是上皮细胞失去极性和细胞间连接，获得间质细胞特性的过程，这一过程与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关。在EMT过程中，上皮细胞标志物E-cadherin的表达下调，间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin等的表达上调。将TCR-T细胞与肝癌细胞共培养48小时后，收集肝癌细胞。用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，冰上孵育30分钟，使细胞充分裂解。然后，在4℃条件下，12000r/min离心15分钟，取上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性5分钟。接着，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白分离。电泳结束后，通过湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。PVDF膜具有良好的蛋白质吸附性能，能够有效固定蛋白。将PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1小时，以防止非特异性结合。封闭后，加入一抗（抗E-cadherin抗体、抗N-cadherin抗体和抗Vimentin抗体），4℃孵育过夜。一抗能够特异性地与目的蛋白结合。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。然后，加入相应的二抗（HRP标记的羊抗兔IgG抗体），室温孵育1小时。二抗能够与一抗结合，通过HRP催化底物显色，实现对目的蛋白的检测。最后，用TBST再次洗涤PVDF膜3次，加入ECL发光液，在化学发光成像仪下曝光显影。实验结果表明，与对照组相比，TCR-T细胞与肝癌细胞共培养后，E-cadherin蛋白的表达水平显著上调。E-cadherin是一种重要的上皮细胞黏附分子，它能够介导上皮细胞之间的黏附作用，维持上皮细胞的极性和完整性。E-cadherin表达上调，增强了肝癌细胞之间的黏附力，抑制了细胞的迁移和侵袭能力。TCR-T细胞与肝癌细胞共培养后，N-cadherin和Vimentin蛋白的表达水平明显下调。N-cadherin和Vimentin是间质细胞标志物，它们的表达上调与肿瘤细胞的侵袭和转移能力增强密切相关。TCR-T细胞下调N-cadherin和Vimentin的表达，抑制了肝癌细胞的EMT过程，从而降低了肝癌细胞的侵袭和转移能力。TCR-T细胞抑制肝癌细胞侵袭和转移的机制还可能涉及到对相关信号通路的调节。TCR-T细胞与肝癌细胞相互作用后，可能激活了某些信号通路，抑制了EMT相关转录因子的活性，从而减少了E-cadherin基因的抑制和N-cadherin、Vimentin基因的激活。TCR-T细胞分泌的细胞因子，如干扰素-γ（IFN-γ）等，也可能通过调节肝癌细胞内的信号通路，影响EMT相关蛋白的表达，进而抑制肝癌细胞的侵袭和转移。六、临床应用前景与挑战6.1临床应用案例分析近年来，TCR-T细胞疗法在肝癌治疗领域逐渐崭露头角，多个成功案例为其临床应用提供了有力的证据和宝贵的经验。北京协和医院肝脏外科副主任杜顺达教授团队开展的一项研究备受关注。该团队对一名乙肝相关肝癌晚期、无法手术的患者实施了特异性T细胞免疫治疗。此次治疗采用的是全球首创靶向HBV抗原的TCR-T细胞疗法SCG101，它通过引入病毒特异性TCR基因序列重定向T细胞，使其表达针对乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的特异性T细胞受体，定向清除HBV感染的肝细胞和肝癌细胞。在获得患者充分知情同意及医院伦理委员会批准后，团队为患者单次输注了SCG101，并在6.9个月内持续观察，期间未给予其他抗肿瘤