正己烷对大鼠体重,卵巢湿重和脏器系数的影响

摘要目的研究正己烷对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及磷脂酰肌醇一3激酶(PI3K)表达的影响。方法清洁级雌性SD大鼠40只,按体重随机分为1个对照组和3个实验组,分别暴露于0,1200ppm、3600ppm、10800ppm正己烷,静式吸入染毒,4h/d,染毒28天。比较染毒前后大鼠体重、卵巢湿重和脏器系数的变化情况,实时荧光定量PCR检测PI3K基因mRNA相对表达量,光镜下观察卵巢组织形态学改变,计数卵巢中各等级卵泡数量并计算构成比。结果体重,卵巢湿重和脏器系数没有显著差异。PI3KmRNA的相对表达随剂量的增加而降低,并且两组之间的差异具有统计学显著(P<0.05)。结论正己烷注射可以抑制PI3K基因的表达,和PI3K信号传导途径可能参与了大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡过程。关键词:正己烷;卵巢颗粒细胞;PI3K。前言正己烷是一种有轻微毒性的有机溶剂，挥发性与脂溶性较高。因为它几乎不溶于水,溶于醚和醇,一直以来被用作工作溶剂。如催化重整在石油加工工业中,原油浸出食品制造,和丙烯溶剂回收的塑料制造[1-2]。正己烷主要存在于以蒸汽的形式的工作环境，大多通过呼吸道进入人体。长期职业暴露于正己烷的工人会引起一系列慢性中毒症状，严重者会失去意识,甚至死亡[3-4]。目前研究主要集中于其神经毒性,出现跟腱反射、膝腱反射减弱或消失、震动觉减弱或消失、位置觉减弱或消失病变等体征[5],除神经系统以外的器官目前研究较少。对职业接触正己烷的女工进行流行病学调查证实该暴露会导致卵巢闭锁卵泡增多和生育能力降低[6]。曹静婷等建立静态吸入染毒模型,观察正己烷对大鼠性腺结构和功能的影响。实验发现,卵巢功能异常和卵母细胞发育异常,卵泡细胞和黄体细胞均表现出细胞凋亡和坏死,证实正己烷可以在一定程度上破坏大鼠性腺和发育生殖细胞[1]。卵泡是女性生殖系统的基本功能单位,由膜细胞、颗粒细胞和卵母细胞组成。GD作为卵巢中一种重要的功能细胞,在卵泡的生长发育过程中发挥着极其重要的作用。原始颗粒细胞分为卵丘细胞和壁层颗粒细胞。卵丘细胞参与细胞增殖和代谢;壁层颗粒细胞,参与细胞分化和信号转导，也可以产生相关激素或调节因子通过细胞间隙促进卵泡的发育[7]。张汝仙等研究发现,GD非正常的增殖、分化会影响卵泡的生理功能形成、激素分泌等一系列正常功能[9]。因此,GD的凋亡损伤可严重扰乱卵巢正常生理功能[9]。目前研究认为,卵泡的闭锁与GD的凋亡有密切的联系[6]。所以,正己烷对颗粒细胞的凋亡的影响及其机制值得进一步研究。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路是调节细胞增殖、分化、凋亡以及衰老的关键信号通路之一[10]。有研究表明,该通路与细胞的凋亡机制之间有密切的关联。AKT作为P13K下游的靶蛋白，是PI3K/AKT信号通路的中心分子,磷酸化后的Akt与肿瘤的发生、发展密切相关。AKT一旦被激活，下游的多种靶蛋白可被其磷酸化,从而促进细胞增殖、分化、凋亡、代谢和其他效应[11-13]。本实验通过建立正己烷静式吸入染毒模型,研究正己烷对卵巢颗粒细胞凋亡过程及PI3K基因表达的影响,探讨正己烷导致卵巢颗粒细胞凋亡的可能机制。为进一步揭示正己烷的生殖毒性及其可能作用机制提供实验依据。2结果2.1正己烷染毒前后体重、脏器湿重和脏器系数的变化情况正己烷染毒后,与对照组比较,低、中、高剂量组体重、卵巢湿重和脏器系数差异均无统计学意义,见表4。表4正己烷染毒组大鼠卵巢的脏器系数(x±s,n=10)组别体重差(g)卵巢湿重(g)卵巢脏器系数(%)对照组89.5240±18.781270.0809±0.016980.0324±0.00748低剂量组84.8780±14.041960.0890±0.019280.0360±0.00626中剂量组86.2290±13.651060.0782±0.014450.0317±0.00625高剂量组79.6480±10.530400.0872±0.016210.0364±0.00693注:与对照比较,*P<0.05

2.2正己烷染毒后卵巢颗粒细胞PI3K基因mRNA表达情况内部参照基因β肌动蛋白的相对定量检测,并通过实时PCR靶基因PI3K显示的CT值。试验结果表明,该放大系统还是不错的。溶出曲线的峰高,尖,无峰,表明扩增产物具有良好的特异性。用正己烷的剂量的增加,PI3KmRNA的表达降低,并且剂量组和对照组之间的差异具有统计学显著(*,P<0.05)。参见图1和表5中。图1PI3K基因mRNA的相对表达量表5正己烷染毒后卵巢颗粒细胞PI3K基因mRNA的相对表达量(x±s)组别PI3K对照组1.00015729±0.021742928低剂量组0.82425936±0.021723560*中剂量组0.80008414±0.024394453*高剂量组0.79987644±0.009743683*注:与对照比较,*P<0.052.3正己烷染毒后卵巢中卵泡变化情况显微镜下观察经HE染色的卵巢组织切片,原始卵泡数中剂量组与对照组比较有统计学差异(P<0.05),次级卵泡数和成熟卵泡数高剂量组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。初级卵泡数、闭锁卵泡以及黄体数各剂量组与对照组比较差异均无统计学意义。见表6。表6各组大鼠卵巢黄体及卵泡比较(n=5,`x±s)组别原始卵泡数初级卵泡数次级卵泡数成熟卵泡数闭锁卵泡数黄体数对照组11.80±6.2110.33±5.309.87±6.166.40±3.565.40±3.8114.27±5.23低剂量组14.93±8.2212.87±7.367.87±2.754.93±2.795.47±2.1716.67±5.73中剂量组20.20±4.47*10.96±7.397.42±2.894.80±2.346.57±3.2315.47±4.27高剂量组11.33±5.219.20±3.826.53±2.23*4.33±1.68*5.87±2.2017.07±9.25注:与对照比较,*P<0.05

3讨论卵泡和颗粒细胞对女性生殖功能的正常形成是不可或缺的。GD决定着卵泡的道路,由其启动卵泡的闭锁,当大多数GD凋亡时,卵泡走上闭锁的道路[14]。正常细胞凋亡在维持机体生理功能和代谢功能方面至关重要,但异常程度的细胞凋亡可能对机体产生一定的有害影响[9]。ZHANG等[15]研究发现,卵巢颗粒细胞凋亡率随着正己烷染毒浓度的增加而升高。SUN等[16]以人体外受精-胚胎移植治疗过程中卵泡液里的卵巢颗粒细胞作为染毒对象,结果表明,随着染毒浓度升高,卵巢颗粒细胞凋亡率升高显著。可见,正己烷可引起GD凋亡。而GD在女性生殖过程中起重要作用,该损伤体现了正己烷的生殖毒性[17].3.1正己烷对大鼠体重,卵巢湿重和脏器系数的影响体重变化是急性毒性试验的一个重要指标。测量LD50时,看是否中毒效果是短暂或长期体重变化观察到。这项研究的结果表明,有一个在两个组(P>0.05)之间的体重没有差异显著。这表明,正己烷的剂量具有该实验剂量对大鼠体重没有显著效果。卵巢的主要功能是产生和分泌成熟的卵子,分泌性激素,促进女性性征的发育和维护,是女性生殖系统的重要器官。在卵巢重量和卵巢脏器系数的变化可以反映卵巢的组合的毒性作用,并且也的卵巢的严重毒性作用的指标。本研究结果显示,各染毒组卵巢湿重和卵巢脏器系数与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。即表明,在本实验剂量下,未观察到正己烷染毒后对卵巢造成严重的损伤。3.2正己烷染毒对PI3K基因mRNA表达的影响凋亡是一个活跃且高度有序的细胞死亡过程,它涉及到一个范围的酶和基因。细胞凋亡异常增加给细胞死亡造成一定的伤害因素[18-19]的主要形式之一。正己烷诱导凋亡在卵巢颗粒细胞的机制还不是很清楚。根据李昱辰等[20]研究显示,2,5-己二酮(正己烷体内代谢的主要活性产物)可使Bax基因表达水平上升。Bcl-2基因表达下调,Bax/Bcl-2比值升高。造成GD凋亡;孙艳[6]研究表明,随着2,5-HD暴露的增加,Caspase-3mRNA和活化的Caspase-3蛋白增多,诱导GD凋亡。在PI3K/AKT信号转导途径中,AKT的表达受多种调节因子的影响，PI3K是其中重要的一种,对其表达起正向调节作用。P-AKT是细胞中的存活因子,能够直接磷酸化BAD,Bcl-2或Bcl-xl与其发生解聚,解聚物与磷酸丝氨酸结合蛋白14-3-3形成复合物,发挥抗凋亡作用;磷酸化的BAD还通过阻断细胞色素C的释放参与细胞抗凋亡过程[21-22]。PI3K通路受抑制后,Caspase-3的表达增加,使其不能发挥抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用[23]。本研究结果显示,各暴露组PI3K基因mRNA表达水平均低于对照组,与对照组比较都有统计学差异(P<0.05)。结果提示,在本实验条件下,正己烷可使PI3K基因的表达水平下降,从而可能会影响AKT的表达,抑制PI3K通路。3.3正己烷染毒对卵巢中卵泡变化情况卵泡是哺乳动物生殖系统的关键功能单位,卵泡发育涉及女性生殖周期的内分泌调节、神经调节等多种生理过程。这项研究表明,原始卵泡和对照组之间的差异具有统计学显著(P<0.05),而高剂量组次级卵泡和成熟卵泡的数量为从对照组(P<0.05)显著不同。有一个在其余没有什么区别。这一结果表明,高剂量的影响卵泡的生长和发育。也可能在切片制作以及显微观察过程中操作不够严谨导致误差出现。总之,暴露于正己烷可引起PI3K基因在卵巢颗粒细胞中的表达的减少,影响该途径的活性。PI3K信号传导途径可能参与在颗粒细胞中诱导细胞凋亡的过程。然而,PI3K信号通