DB37-T 4415-2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术

ICS67.050CCSX0437Detectionofβ-lactoglobulingeneknockoutcowandβ-lactoglobulinincow'smilkIDB37/T4415—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业大学、山东奥克斯畜牧种业有限公司、蒙天乳业有限公司、山东省畜牧总站。本文件主要起草人：黄金明、戴蕴平、魏晓超、丁芳荣、王秀革、鞠志花、姜强、胡智胜、张亚冉、高亚平、刘文浩、王金鹏、杨春红、李彦芹、宋明智、高运东、侯明海。DB37/T4415—20211β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术本文件确立了β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法，以及牛奶中β-乳球蛋白（BLG）的定性免疫印迹（Western-Blot）和定量酶联免疫吸附（ELISA）检测方法。本文件适用于β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中β-乳球蛋白的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T27642—2011牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法NY/T1663—2008乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法NY/T1672—2008绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程NY/T2695—2015牛遗传缺陷基因检测技术规程SN/T2497.16—2010进出口危险化学品安全试验方法第16部分：Western-Blot实验农业部2031号公告-14-2013转基因动物及其产品成分检测普通牛(Bostaurus)内标准基因定性PCR方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1牛β-乳球蛋白基因Bostaurusβ-lactoglobulinBLGBLG基因（NCBIReferencesequence:NC_037338.1简称PAEP，来源于普通牛（Bostaurus编码β-乳球蛋白的基因。注：基因全长4900bp，由7个外显子和3.2β-乳球蛋白基因敲除奶牛β-lactoglobulinknockoutcow利用基因编辑技术敲除β-乳球蛋白基因的奶牛。4聚合酶链式反应（PCR）法-基因定性检测4.1原理通过设计特异引物，扩增出包含牛BLG基因全长的DNA片段，对扩增产物进行测序分析。依据BLG基因编码序列是否发生突变，并提前引入终止密码子，造成蛋白质编码异常，判断是否敲除BLG基因。DB37/T4415—202124.2试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.2.1水：GB/T6682，三级。4.2.250×TAE缓冲液：称取Tris-base242.2g，加入冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL，用水定容至1000mL。使用时，用水稀释为1×TAE。4.2.31%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖充分溶解于1×TAE，定容至100mL。4.2.4BLG基因引物：——上游引物：5′-GCCTCTCGCATCTGACACTT-3′；——下游引物：5′-AGTTTCAAAGAGCCGTAGATGTGTG-3′；——预测野生型扩增片段大小为6728bp。4.2.5内标准基因引物：参照农业部2031号公告-14-2013。4.2.6引物溶液：引物用水稀释到10μmol/L。4.3仪器设备4.3.1PCR扩增仪：温度范围4℃~99℃,温度梯度范围20℃,模块单元96×0.2mL。4.3.2离心机：最高转速12000r/min，最大容量24×2mL。4.3.3电子天平：量程0.001g～100g，感量0.001g。4.3.4凝胶成像分析系统。4.3.5稳压稳流电泳仪：输出电压0V～600V，输出电流0mA～100mA。4.3.6高压灭菌锅：使用温度范围45℃~135℃,最高使用压力0.255Mpa。4.3.7微波炉。4.4样品4.4.1采集静脉血样3mL～5mL，医用抗凝管或ACD抗凝，-20℃以下保存。4.4.2采集组织（耳组织等）0.1g～0.3g，浸入75%的酒精，-20℃以下保存。4.4.3采集带毛囊的牛毛20～30根，浸入75%的酒精或置于毛囊卡，-20℃以下保存。4.4.4采集0.2mL～0.5mL鲜精或1～2支细管冷冻精液，备用。4.5试验步骤4.5.1DNA提取基因组DNA提取按照GB/T27642—2011附录B规定执行。4.5.2DNA浓度和纯度检测DNA浓度和纯度检测按照NY/T1672—2008中7.3的规定执行。4.5.3PCR扩增4.5.3.1样品PCR扩增4.5.3.1.1内标准基因PCR扩增反应体系及反应程序按照农业部2031号公告-14-2013。4.5.3.1.2基因特异性序列PCR扩增DB37/T4415—202134.5.3.1.2.1PCR扩增体系。TaqDNA聚合酶0.5μL；2×PCRbuffer25μL；dNTPMixture(2.5mM)4.5.3.2对照PCR扩增以野生型奶牛基因组DNA（序列信息见附录A）作为阴性对照；以含有16bp缺失的BLG基因敲除奶牛基因组DNA（序列信息见附录B）作为阳性对照；以水作为空白对照。除DNA模板外，对照PCR扩增条件与4.5.3.1.2相同。4.5.4PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测按照NY/T2695—2015中6.4.2的规定执行。4.5.5测序分析将检测合格的PCR产物进行全长测序分析。4.6结果判定与表述4.6.1对照检测结果分析在内标基因、阳性对照和阴性对照PCR扩增中，内标基因和BLG基因特异性序列均扩增出与预期大小一致的产物，空白对照无预期扩增片段，则表明PCR反应体系正常；否则，需重新扩增。4.6.2样品检测结果判定和表述PCR扩增的β-乳球蛋白基因片段参考序列（野生型）见附录A。对测序结果和参考序列进行比对，判定样品是否发生基因敲除。4.6.2.1如果样品序列与参考序列一致，未造成蛋白质编码异常，表述为“BLG基因未敲除奶牛”。4.6.2.2如果样品序列与参考序列比对，出现突变，且提前引入了终止密码子，造成蛋白质编码异常，表述为“BLG基因敲除奶牛”。5免疫印迹（Western-Blot）法-蛋白定性检测5.1原理对预处理的牛奶样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，使用牛β-乳球蛋白特异性第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体进行检测，根据条带位置和着色深度判定样品中是否含有β-乳球蛋白。5.2试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.2.1水：GB/T6682，三级。5.2.2牛β-乳球蛋白标准品储液（10mg/mL）：称取0.1g牛β-乳球蛋白，溶解于10mL双蒸水中，分装，-20℃以下保存。5.2.310%SDS：将10g的SDS粉末溶于80mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL。5.2.430%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60mL的蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL。DB37/T4415—202145.2.51.5MTris-HCl(pH8.8)：将181.65gTris溶于800mL蒸馏水中，加浓盐酸调pH至8.8，定5.2.61MTris-HCl(pH=6.8)：将121.1gTris溶于800mL蒸馏水中，加浓盐酸调pH至6.8，定容5.2.710%过硫酸铵：将10g过硫酸铵粉末溶于80mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至100mL。5.2.815%SDS分离胶（5mL1.1mL蒸馏水，2.5mL30%丙烯酰胺溶液，1.3mL1.5MTris-HCl(pH8.8)，0.05mL10%SDS，0.05mL10%过硫酸铵，0.002mLTEMED。5.2.95%SDS浓缩胶（2mL1.4mL蒸馏水，0.33mL30%丙烯酰胺溶液，0.25mL1.0MTris-HCl(pH6.8)，0.02mL10%SDS，0.02mL10%过硫酸铵，0.002mLTEMED。5.2.1010×转膜液（500mL15.1gTris，75g甘氨酸溶于蒸馏水中至终体积为500mL。5.2.1110×TBS（1L）：88g氯化钠，12.1gTris溶于蒸馏水中至终体积为1L，浓盐酸调整pH至7.6。5.2.121×TBST（1L100mL10×TBS缓冲液，899mL双蒸水，1mL吐温20。5.2.13BCA蛋白浓度测定试剂盒。5.2.14ECL化学发光显色液。5.3仪器设备5.3.1离心机：最高转速12000r/min，最大容量24×2mL。5.3.2电子天平：量程0.001g～100g，感量0.001g。5.3.3高压灭菌锅：使用温度范围45℃~135℃,最高使用压力0.255Mpa。5.3.4金属水浴锅：控温范围-10℃~100℃。5.3.5稳压稳流电泳仪：输出电压0V～600V，输出电流0mA～100mA。5.3.6半干转膜仪。5.3.7化学发光成像系统。5.4样品5.4.1液态样品取液态样品50mL，离心12000g，5min，去除脂肪层，取上清液，待测或-80℃以下保存。5.4.2固态样品称取固态样品5g，加适量水溶解，定容至50mL，制成液态样品，随后按照5.4.1操作。5.5试验步骤5.5.1样品蛋白浓度测定使用BCA试剂盒测定样品中的蛋白浓度。5.5.2样品制备分别取总蛋白含量为30μg的待检样品、阴性对照样品（不含β-乳球蛋白的牛奶以及1μgβ-乳球蛋白标准品，加入5×SDS加样缓冲液，100℃水浴10min。5.5.3十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）采用NY/T1663—2008中的方法进行SDS凝胶电泳。DB37/T4415—202155.5.4转膜按照SN/T2497.16—2010中转膜方法执行。5.5.5封闭将PVDF膜置于封闭液中，室温水平摇动2h或4℃过夜。5.5.6第一抗体结合在自封袋中加入适当比例稀释的兔抗牛β-乳球蛋白一抗抗体，放入PVDF膜，排净气泡后封口，室温水平摇动2h。5.5.7洗膜用TBST溶液洗膜，10min/次，3～5次。5.5.8第二抗体结合在自封袋中加入适当比例稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗抗体，放入PVDF膜，排净气泡后封口，室温水平摇动1h。5.5.9洗膜用TBST溶液洗膜，10min/次，3～5次。5.5.10显影将ECL显色液试剂A、B液等体积混合，加入到膜表面，1min～2min，置于化学发光成像系统中拍照保存结果。5.6结果判定与表述5.6.1对照检测结果分析β-乳球蛋白标准品检测到预期大小（18kD）的条带，空白和阴性对照无特异性条带，则表明Western-Blot检测方法正常；否则，需重新检测。5.6.2样品检测结果判定与表述将样品进行SDS分离，使用牛β-乳球蛋白特异性抗体进行Western-Blot鉴定，若在18kD分子量处出现和β-乳球蛋白标准品泳道中大小一致的条带，判定该样品含β-乳球蛋白，表述为“β-乳球蛋白阳性”；若在18kD分子量处无条带，判定为不含β-乳球蛋白的样品，表述为“β-乳球蛋白阴性”。6酶联免疫吸附（ELISA）法-蛋白定量检测6.1原理在微孔板上预包被牛β-乳球蛋白抗体，样品中的β-乳球蛋白与生物素标记的β-乳球蛋白竞争性地和微孔中的抗体结合，然后加入亲和素-辣根过氧化物酶偶联物，加入显色底物，终止液终止反应，在酶标仪上读取450nm波长下的吸光度值，吸光度值与β-乳球蛋白的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以稀释倍数即可得出样品中β-乳球蛋白的含量。DB37/T4415—202166.2试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。6.2.1水：GB/T6682，三级。6.2.2预包被96微孔板：已包被人乳铁蛋白多克隆抗体的96孔板（8孔×12条）。6.2.3100×生物素偶联物：生物素标记的牛β-乳球蛋白偶联物，使用前用稀释缓冲液稀释100倍。6.2.4100×亲和素-辣根过氧化物酶偶联物：使用前用稀释缓冲液稀释100倍。6.2.51×PBS缓冲液：将1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，8g氯化钠和0.2g氯化钾溶于800mL蒸馏水中，浓盐酸调整pH至7.4，加水定容至1L。6.2.6稀释缓冲液：含有1%BSA的PBS缓冲液：将1gBSA溶于100mLPBS缓冲液中。6.2.7洗涤缓冲液：含有0.05%吐温20的PBS缓冲液：将50μL吐温20溶于100mLPBS缓冲液中，震荡混匀。6.2.8四甲基联苯胺（TMB）显色底物。6.2.92M硫酸反应终止液：10mL98%浓硫酸加入60mL蒸馏水中，定容至100mL。6.2.10β-乳球蛋白标准品溶液：用样品稀释缓冲液按照10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL浓度梯度制备β-乳球蛋白标准品溶液，样品稀释缓冲液作为空白对照（0μg/mL）。6.3仪器设备6.3.1离心机：最高转速12000r/min，最大容量24×2mL。6.3.2电子天平：量程0.001g～100g，感量0.001g。6.3.3高压灭菌锅：使用温度范围45℃~135℃,最高使用压力0.255Mpa。6.3.4恒温箱：温控范围为室温+5℃~80℃。6.3.5酶标仪：配备450nm滤光片。6.4样品按照5.4.1和5.4.2对样品进行脱脂处理，用稀释缓冲液将样品稀释1000倍（预测样品中β-乳球蛋白含量优化稀释比例）。6.5试验步骤6.5.1准备实验所需试剂，并平衡至室温（20℃~25℃)。6.5.2取合适数量（按照每个样品和标准品溶液做两个平行实验）的微孔板放入板架上，每孔加入506.5.3每孔加入50μL生物素偶联物，密封，37℃孵育30min。6.5.4吸净孔中液体，每孔加入洗涤缓冲液200μL，浸泡2min，吸净孔中液体，重复2次，最后用吸水纸拍干。6.5.5每孔加入100μL亲和素-辣根过氧化物酶偶联物，密封，37℃孵育30min。6.5.6按照6.5.4步骤洗板5次。6.5.7每孔加入90μLTMB显色底物，避光，37℃孵育20min。6.5.8每孔加入50μL终止液，溶液颜色由蓝色变为黄色。酶标仪450nm波长下读取吸光度值。6.6结果计算6.6.1计算样品溶液和标准品溶液的平均吸光度值。6.6.2以标准品的浓度为X-轴，对应的平均吸光度值为Y-轴，绘制标准曲线。DB37/T4415—202176.6.3标准曲线上样品吸光度值对应的β-乳球蛋白浓度，乘以样品稀释倍数，即为所测样品中β-乳球蛋白含量。若检测的β-乳球蛋白浓度高于标准品最高浓度，对样品进行合适倍数稀释后再检测。计算公式如下：式中：X——样品中β-乳球蛋白含量，单位为μg/mL；C——样品吸光度值对应的β-乳球蛋白浓度，单位为μg/mL；N——样品稀释倍数，本文件中使用的稀释倍数为1000。6.7检出灵敏度本文件ELISA方法的检出灵敏度为0.13μg/mL。7检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403和GB/T19495.2规定执行。8废弃物的处理按照GB/T19495.2规定执行。DB37/T4415—20218（资料性）PCR扩增的野生型牛β-乳球蛋白基因序列gcctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactgcaggggtgcccctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCCATGAAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGCCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTGGGGAGCTGGGCCTCAGAGACCAAGGGAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGTCCCTCCCCAGGTGGCGGGGACTTGGTACTCCTTGGCCATGGCGGCCAGCGACATCTCCCTGCTGGACGCCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGCCCACCCCTGAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAAAAAAAGCATGGAACCCCCACTCCCCAGGGATATGGACCCCCCGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCCTGGAGGTCCACCCAAGGCTGCTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACATCATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATTCGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATGAACAAGATGTCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCAGTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAACCCCAGGACTGCCTTTTGGGGTGCCTGTGGTCAAGGCTCTCCCCAACCTTTTCTCCCTGG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