2026届高三二轮复习课件 生物 大单元8 生物技术与工程 层级2 二轮核心 精研专攻

层级二二轮核心•精研专攻【单元网络构建】醋酸菌巴氏消毒法湿热灭菌法碳源、氮源、水、无机盐等稀释涂布平板法植物细胞的全能性细胞增殖细胞膜的流动性动物细胞核的全能性获能桑葚胚期、囊胚期将内细胞团均等分割DNA连接酶基因表达载体的构建基因突破点1微生物培养与发酵【高考命题预测】本部分试题情境大多来自生产生活实践,一般题目难度不大,可能的命题方向有:①果酒、果醋、泡菜、酸奶、腐乳等传统发酵产物的制作原理及制作过程,可能结合中国古代农副业等传统制作方法。②发酵工程通常通过流程图的形式考查啤酒、酱油、醋、柠檬酸等的工业化生产、乙醇燃料制备等,多考查流程中各环节的原理以及影响发酵的因素等内容。③微生物培养主要以微生物的筛选为主要考查方向,主要内容有微生物的实验室培养技术,分解淀粉、纤维素或石油的细菌的分离,耐盐、耐高温、耐酸碱等特殊环境条件的细菌的分离,以及细菌的纯化及计数等。题目的情境来源多样,部分来自大学教材,部分来自当前科学热点的相关论文。聚焦1传统发酵技术与发酵工程【练真题

明方向】1.(2025·云南卷)黄酒是我国古老的发酵酒之一,传统酿制中,先用蒸煮过的小麦或麸皮为原料,对之前发酵留存的少量酒曲(曲种)进行扩大制曲;再将酒曲和蒸煮后的糯米、大米混合处理一段时间后,添加足量酒母(含酵母菌)完成发酵,压榨成品。下列说法错误的是(

)A.小麦、麸皮等原料为酒曲中微生物的生长繁殖提供了碳源和氮源等营养物质B.为避免制曲过程被杂菌污染影响黄酒品质,扩大制曲前需对留存的酒曲灭菌C.糯米、大米蒸煮后立即与酒曲混合会导致酶空间结构改变而降低其催化效率D.将酒曲混合糯米、大米处理一段时间,是为了获得酒母发酵时的底物葡萄糖B解析

小麦、麸皮等原料含有蛋白质、糖类等多种营养成分,蛋白质可以为微生物提供氮源,糖类等可以为微生物提供碳源,所以小麦、麸皮等能为酒曲中微生物的生长繁殖提供碳源和氮源等营养物质,A项正确。扩大制曲前对留存的酒曲不能灭菌,因为酒曲本身含有发酵所需的菌种,若灭菌会杀死这些菌种,导致无法进行正常的发酵过程,B项错误。糯米、大米蒸煮后温度较高,立即与酒曲混合,高温会使酶的空间结构改变,导致酶活性降低,从而降低其催化效率,C项正确。酒曲中含有淀粉酶等酶类,将酒曲混合糯米、大米处理一段时间,淀粉酶可将糯米、大米中的淀粉分解为葡萄糖,从而为后续酒母(含酵母菌)发酵提供底物葡萄糖,D项正确。2.(2025·山东卷改编)酿造某大曲白酒的过程中,微生物的主要来源有大曲和窖泥。大曲主要提供白酒酿造过程中糖化所需的微生物,制曲过程需经堆积培养,培养时温度可达60℃左右;将大曲和酿酒原料混合,初步发酵后放入窖池;窖池发酵是白酒酿造过程中微生物发酵的最后阶段。下列说法错误的是(

)A.堆积培养过程中的高温有利于筛选酿酒酵母B.大曲中存在能分泌淀粉酶的微生物C.窖池发酵过程中,酵母菌以无氧呼吸为主D.窖池密封不严使酒变酸是因为乙酸含量增加A解析

堆积培养可使白酒酿造过程中糖化所需微生物增多,但不能筛选出耐高温的酿酒酵母,大曲主要提供白酒酿造过程中糖化所需的微生物,是能合成淀粉酶的微生物,所以堆积培养过程中的高温有利于筛选产淀粉酶的微生物,A项错误,B项正确。窖池发酵过程是在缺氧的环境中进行,酵母菌以无氧呼吸为主,C项正确。窖池密封不严使酒变酸是因为乙酸含量增加,D项正确。3.(2024·山东卷)在发酵过程中,多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体,菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时,可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是(

)A.相同菌体密度下,菌球体越大柠檬酸产生速率越慢B.发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量C.发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长D.发酵结束后,将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品D解析

相同菌体密度下,菌球体越大,其中的菌体得到的氧越少,柠檬酸的产生速率越慢,A项正确。发酵中期添加一定量的硫酸铵,可使菌体内铵离子浓度升高,进而解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制,有利于提高柠檬酸的产量,B项正确。发酵过程中pH下降使不耐酸的细菌(适合中性或弱碱性)难以生存,可抑制大部分细菌的生长,C项正确。柠檬酸属于代谢物,不能用过滤法获取,D项错误。【归纳拓展】1.发酵过程中控制杂菌的措施(1)通过发酵条件控制杂菌:①无氧发酵时的无氧环境可以抑制好氧细菌;②乳酸菌发酵、酒精发酵形成的酸性环境抑制杂菌繁殖。(2)利用盐控制杂菌:如腐乳的制作。(3)利用酒精控制杂菌:如果酒、腐乳的制作。2.发酵工程与传统发酵技术的区别与传统发酵技术相比,大规模工业发酵能够通过选育菌种、控制发酵过程和分离、提纯产品等过程批量生产发酵产品。其操作流程如下:【练模拟

拓角度】4.(2025·广西北海模拟)广西传统酸笋制作依赖自然发酵。某工厂尝试将竹笋高温灭菌后,接种纯培养的植物乳杆菌(异养厌氧型乳酸菌),但发酵产物酸味远弱于自然发酵,且风味远不如传统发酵。下列叙述正确的是(

)A.高温灭菌破坏了竹笋中的纤维素,导致乳酸菌无法获取碳源B.自然发酵酸味较强,是因为醋酸菌是发酵液中的优势菌种,产醋酸C.接种植物乳杆菌的主要目的是产生乳酸为酵母菌提供原料D.相较于传统酸笋发酵,纯种发酵液中乳酸菌的数量更多D解析

纤维素经高温灭菌后结构未改变,且乳酸菌无法直接分解纤维素,A项错误。自然发酵酸味较强,是因为乳酸菌是发酵液中的优势菌种,产乳酸,传统发酵风味较好,主要是因为乳酸菌、酵母菌、曲霉等多种微生物共同作用,产生丰富的代谢物,形成有机酸、醇、酯等复合型风味,B项错误。接种植物乳杆菌的主要目的是产生乳酸,酵母菌发酵的主要原料是葡萄糖,C项错误。相较于传统发酵,纯种发酵液中乳酸菌的数量更多,因为乳酸菌纯度更高,D项正确。5.(2025·湖南二模)我国每年产生的农业秸秆数量巨大,秸秆直接焚烧会造成大气污染、土壤损伤,绿色处理秸秆能有效减少农业废弃物,促进可持续发展。下图为发酵工程中利用水稻、玉米等农业秸秆生产柠檬酸的简要流程图。下列相关叙述正确的是(

)A.生产柠檬酸的黑曲霉是异养厌氧型,其优良菌种只能从自然界中筛选出来B.发酵罐内发酵是工厂化生产柠檬酸的中心环节,还可利用黑曲霉发酵生产酱油C.发酵结束后,对罐内发酵液可采取适当的过滤、沉淀措施获得柠檬酸D.黑曲霉还可以在工业生产中用来生产淀粉酶这种利用价值更高的单细胞蛋白答案

B

解析

由图中“振荡培养”可知,在发酵过程中需要氧气参与,黑曲霉是好氧菌。优良菌种不仅可以从自然界中筛选,还可以通过诱变育种、基因工程等现代生物技术进行培育,A项错误。发酵罐内发酵是工厂化生产柠檬酸的中心环节,且黑曲霉可用于酱油生产,B项正确。发酵结束后,发酵液中除了柠檬酸外还含有黑曲霉菌体及其他杂质。仅采取过滤、沉淀措施无法获得纯净的柠檬酸,还需要进行进一步的分离和提纯等操作,C项错误。单细胞蛋白指的是微生物菌体,不是淀粉酶,D项错误。聚焦2微生物的选择培养、鉴定和计数【练真题

明方向】6.(2025·黑吉辽蒙卷)科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素(C22H23ClN2O8)能力强的菌株,旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是(

)A.以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基B.逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株C.配制选择培养基时,需确保pH满足实验要求D.用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面D解析

要筛选降解金霉素能力强的菌株,以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基,只有能利用金霉素的菌株才能在选择培养基上生长,A项正确。逐步提高培养基中金霉素的浓度,可对菌株进行选择,有助于获得高耐受的菌株,B项正确。微生物的生长需要适宜的pH,配制选择培养基时,需确保pH满足实验要求,C项正确。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面,接种环用于平板划线法,D项错误。7.(2025·四川卷)微塑料由塑料废弃物风化形成,难以降解,会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌,将总菌量相同的X、Y、X+Y(X∶Y=1∶1)分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中,培养一段时间后测定微塑料的残留率(残留率=剩余量/添加量×100%),结果如下图。下列叙述正确的是(

)A.用平板划线法能测定X菌组中的活菌数B.Y菌组微塑料残留率较高,故菌浓度也高C.混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种D.能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料C解析

平板划线法主要用于微生物的分离和纯化,不能用于测定活菌数,测定活菌数常用稀释涂布平板法,A项错误。Y菌组微塑料残留率较高,说明Y菌对微塑料的降解能力相对较弱,而不是菌浓度高,微塑料残留率与菌对微塑料的降解能力有关,而非直接与菌浓度相关,B项错误。由图可知,X+Y混合菌种组的微塑料残留率低于X菌组和Y菌组,说明混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种,C项正确。该培养基中含有蛋白胨,能在该培养基中生长繁殖的微生物可能利用蛋白胨作为碳源和氮源等,但不一定都能降解微塑料,D项错误。8.(2025·山东卷)深海淤泥中含有某种能降解纤维素的细菌。探究不同压强下,该细菌在以纤维素或淀粉为唯一碳源的培养基上的生长情况。其他条件相同且适宜,实验处理及结果如表所示。下列说法正确的是(

)组别压强纤维素淀粉菌落①常压-+-②常压+--③高压-+-④高压+-+注:

“+”表示有;“-”表示无。A.可用平板划线法对该菌计数B.制备培养基的过程中,应先倒平板再进行高压蒸汽灭菌C.由②④组可知,在以纤维素为唯一碳源的培养基上,该菌可在常压下生长D.由③④组可知,高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长D解析

平板划线法用于分离单菌落,不能准确计数,计数常用稀释涂布平板法,A项错误。制备培养基应先高压蒸汽灭菌,再倒平板,避免杂菌污染,B项错误。②组在常压下、以纤维素为唯一碳源时无菌落,说明常压下该菌无法生长,C项错误。③组在高压下、以淀粉为唯一碳源时无菌落,④组在高压下、以纤维素为唯一碳源时有菌落,表明高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长,D项正确。【归纳拓展】1.选择培养基四种常见的制备方法(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)(2)改变培养基的营养成分

(3)利用培养基“特定化学成分”分离

(4)通过某些“特殊环境”分离

2.辨析两种微生物计数方法

比较项目间接计数法(稀释涂布平板法)直接计数法(显微计数法)原理当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量公式每克样品中的菌数=C/V×M。C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数每毫升原液所含细菌数:每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数比较项目间接计数法(稀释涂布平板法)直接计数法(显微计数法)缺点当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落不能区分活菌和死菌结果比实际值偏小比实际值偏大【练模拟

拓角度】9.(2025·福建漳州模拟)从马盲肠中分离出能够降解纤维素的厌氧细菌并对其进行鉴定,实验流程和结果如下图。下列叙述正确的是(

)注:刚果红可与纤维素形成红色复合物,当纤维素被分解后,复合物就无法形成,会出现透明圈。A.可以用接种环把菌液接种到培养基上B.①~③应在无氧条件下倒置培养C.菌落甲降解纤维素的能力低于菌落乙D.菌株乙更适合用于研发反刍动物的饲料添加剂B解析

根据图示信息可知,接种方法为稀释涂布平板法,用的接种工具为涂布器,接种环是平板划线法中的接种工具,A项错误。该培养基培养的是厌氧细菌,因此①~③应在无氧条件下倒置培养,B项正确。菌落甲的透明圈与菌落直径比值大于乙,因此分泌的纤维素分解酶的降解能力高于乙,C项错误。根据C项分析可知,菌落甲降解纤维素的能力更强,因此菌株甲更适合研发为反刍动物的饲料添加剂,D项错误。10.(2025·安徽芜湖二模)T2噬菌体能专一侵染大肠杆菌,进入宿主细胞的噬菌体不会被杀病毒剂灭活,在裂解宿主细胞后能继续感染并裂解周围的大肠杆菌。在培养基平板上,一个被感染的细菌最终会形成一个噬菌斑。利用这一原理可以检测受污染水样中大肠杆菌的数量,具体操作步骤如图所示。下列叙述错误的是(

)A.T2噬菌体需利用大肠杆菌的核糖体合成子代病毒的蛋白质B.噬菌体感染并裂解细菌的特性有利于减少污水中细菌的数量C.若平均噬菌斑数为48个,则待检测水样中目标菌的浓度为960个/mLD.保温时间过长或稀释倍数不足均可造成噬菌斑的统计值较目标菌实际值偏低答案

C

解析

噬菌体是病毒,没有细胞结构,只能利用大肠杆菌的核糖体合成子代病毒的蛋白质,A项正确。由题意可知,噬菌体感染并裂解细菌的特性,有利于减少污水中细菌的数量,B项正确。培养皿中接种的待测水样体积为0.1

mL,若平均噬菌斑数为48个,则待检测水样中目标菌的浓度为480个/mL,C项错误。若保温时间过长,部分被感染的细菌可能已裂解并释放出子代噬菌体,加入杀病毒剂后会灭活这些游离噬菌体,导致部分初始感染细菌无法形成独立的菌斑,从而使统计值低于实际目标菌数量。稀释倍数不足会使接种到平板上的混合液浓度过高,导致多个噬菌斑重叠或融合,也会造成噬菌斑的统计值较目标菌实际值偏低,D项正确。突破点2细胞工程和胚胎工程【高考命题预测】细胞工程和胚胎工程的题目情境的呈现形式多样,简单情境大部分以教材中出现的相关技术为背景,题目以文字描述为主。复杂情境大多以不同技术的综合应用为情境,呈现形式除文字信息外,也常通过流程图、表格、概念图等形式呈现。一般以选择题的形式呈现,考查某一技术过程所需的条件、原理或产生的结果。一般情境来自教材或与教材情境类似,难度不大;复杂情境涉及多种技术的综合应用,需全面掌握相关的生物学知识,才能准确梳理题目所涉及流程的原理、控制条件、影响因素以及最终达成的目标,并能用所学的相关知识分析解决问题。聚焦1植物细胞工程【练真题

明方向】1.(2025·黑吉辽蒙卷)利用植物组织培养技术获得红豆杉试管苗,有助于解决紫杉醇药源短缺问题。下列叙述正确的是(

)A.细胞分裂素和生长素的比例会影响愈伤组织的形成B.培养基先分装到锥形瓶,封口后用干热灭菌法灭菌C.芽原基细胞由于基因选择性表达,不能用作外植体D.紫杉醇不能通过细胞产物的工厂化生产来获取,植物组织培养优势明显A解析

植物组织培养中,细胞分裂素和生长素的比例会影响植物细胞的发育方向,包括脱分化形成愈伤组织的过程,A项正确。培养基分装封口后常用高压蒸汽灭菌法灭菌,干热灭菌法适用于耐高温和需要保持干燥的物品,B项错误。芽原基细胞具有全能性,可作为外植体,C项错误。紫杉醇可通过培养红豆杉细胞进行细胞产物的工厂化生产来获取,D项错误。2.(2025·四川卷)研究人员用花椰菜(BB,2n=18)根与黑芥(CC,2n=16)叶片分别制备原生质体,经PEG诱导融合形成杂种细胞,进一步培养获得再生植株,其中的植株N经鉴定有33条染色体。下列叙述正确的是(

)A.两个原生质体融合形成的细胞即为杂种细胞B.再生植株N的形成证明杂种细胞仍具有全能性C.花椰菜和黑芥的原生质体能融合,证明两种植物间不存在生殖隔离D.植株N的B组和C组染色体不能正常联会配对,无法产生可育配子B解析

两个原生质体融合形成的细胞不一定是杂种细胞,有可能是两个花椰菜原生质体融合或两个黑芥原生质体融合等,A项错误。细胞的全能性是指细胞经分裂和分化后,仍具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞的潜能和特性,杂种细胞经过培养形成再生植株N,这证明了杂种细胞仍具有全能性,B项正确。花椰菜和黑芥是不同物种,它们之间存在生殖隔离。原生质体能融合并不能证明不存在生殖隔离,因为生殖隔离是指不同物种之间一般是不能相互交配的,即使交配成功,也不能产生可育的后代,C项错误。植株N是花椰菜(BB,2n=18)根和黑芥(CC,2n=16)叶片的原生质体经PEG诱导融合形成杂种细胞后培养获得的再生植株,染色体组成是BBCC,存在同源染色体,在减数分裂时能正常联会配对,能产生可育配子,D项错误。【练模拟

拓角度】3.(2025·黑龙江哈尔滨二模)菊花“紫凤牡丹”可药食两用,其细胞内黄酮类次生代谢物具有抗癌功效。为探索该品种的有效脱毒手段,研究人员进行了茎尖组织培养实验,结果如下表,有关叙述错误的是(

)紫凤牡丹在不同处理方式下的脱毒对比不同处理方式接种数/个成活数/个成活率/%病毒脱除数/个病毒脱除率/%甲:一次茎尖脱毒处理15426.67125.00乙:利巴韦林+4℃处理15533.33140.00丙:一次茎尖脱毒处理+ABA15533.33360.00A.可利用植物细胞培养技术以获得大量黄酮类物质B.获得脱毒苗的过程中需加入生长素和细胞分裂素C.据表分析可知,采用丙处理方式时脱毒效果最好D.经三种处理方式获得的脱毒苗均具有抗病毒特性答案

D

解析

菊花“紫凤牡丹”细胞内黄酮类次生代谢物具有抗癌功效,为了提高产量可利用植物细胞培养技术以获得大量黄酮类物质,A项正确。获得脱毒苗的过程中需加入生长素和细胞分裂素,这两种激素的比值会影响植物组织培养的方向,B项正确。据表数据分析可知,采用丙处理方式时脱毒效果最好,同时成活率也较高,C项正确。经三种处理方式获得的脱毒苗均具有带毒少的特征,但并不具有抗病毒特性,D项错误。4.(2025·陕西咸阳三模)下图是利用甲、乙两种植物的各自优势,通过植物细胞工程技术培育高产、耐盐的杂种植株的实验流程图。下列相关叙述错误的是(

)A.科研人员用蜗牛消化道提取液进行a处理来制备原生质体,说明该提取液中含有胰蛋白酶B.b是诱导融合后的杂种细胞,其细胞内的染色体数目比任何一方亲本细胞中染色体数目多C.具有耐盐性状的c需要先移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中,待其长壮后再移栽入土D.在高盐环境中进行d选择获得的目的植株,其形态特征、生理特性等表型与双亲存在差异答案

A

解析

利用蜗牛消化酶制备植物原生质体时,主要利用其所含纤维素酶和果胶酶来降解细胞壁,并非利用胰蛋白酶,A项错误。b是诱导融合后的杂种细胞,其细胞内的染色体数目应该是两种亲本细胞染色体数目的总和,因此比任何一方亲本细胞中染色体数目多,B项正确。具有耐盐性状的c需要先移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中,待其长壮后再移栽入土,这是为了确保植株在移植过程中能够适应环境并健康成长,C项正确。在高盐环境中进行d选择获得的目的植株,其形态特征、生理特性等表型与双亲存在差异,这是因为杂种植株结合了两种亲本的特性,并且在高盐环境中进行了选择,D项正确。聚焦2动物细胞工程和胚胎工程【练真题

明方向】5.(2025·湖北卷)利用犬肾细胞MDCK扩增流感病毒,生产流感疫苗,具有标准化、产量高等优点。但MDCK细胞贴壁生长的特性不利于生产规模的扩大,严重制约疫苗的生产效率。研究人员通过筛选,成功获得一种无成瘤性的(多代培养不会癌变)、可悬浮培养的MDCK细胞——XF06。下列叙述错误的是(

)A.XF06悬浮培养可提高细胞密度,进而提升生产效率B.细胞贴壁生长特性的改变是由于流感病毒感染所导致C.可采用离心技术从感染病毒的细胞裂解液中分离出流感病毒D.采用无成瘤性细胞生产疫苗,是为了避免疫苗中有致瘤DNA的污染B解析

悬浮培养允许细胞在生物反应器中自由生长,无需贴附表面,可显著提高XF06的密度,从而提高疫苗生产效率,A项正确。根据题干信息可知,XF06的悬浮培养特性是通过筛选获得的遗传改变,而非流感病毒感染所致,B项错误。在疫苗生产中,感染病毒的细胞需裂解释放病毒,离心技术(如差速离心或密度梯度离心)是标准方法,用于分离和纯化流感病毒颗粒,去除细胞碎片等杂质,C项正确。成瘤性细胞可能含有致癌基因或病毒DNA,若污染疫苗,存在潜在安全风险,XF06无成瘤性(多代培养不癌变),可减少疫苗中致瘤DNA污染的可能性,D项正确。6.(2025·黑吉辽蒙卷改编)下图是制备抗白细胞介素-6(IL-6)单克隆抗体的示意图。下列叙述正确的是(

)A.步骤①给小鼠注射IL-6后,应从脾中分离筛选T淋巴细胞B.步骤②在脾组织中加入胃蛋白酶,制成单细胞悬液C.步骤③加入灭活病毒或PEG诱导细胞融合,体现了细胞膜的流动性D.步骤④经过克隆化培养和抗体检测筛选出了杂交瘤细胞C解析

步骤①给小鼠注射IL-6后,应从脾中分离筛选B淋巴细胞,A项错误。步骤②在脾组织中加入胰蛋白酶或胶原蛋白酶,制成单细胞悬液,B项错误。步骤③加入灭活病毒或PEG诱导细胞融合,体现了细胞膜的流动性,C项正确。步骤④用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞,步骤⑤经过克隆化培养和抗体检测筛选出了能产生特定抗体的杂交瘤细胞,D项错误。7.(2025·陕晋宁青卷)科研人员通过对绵羊受精卵进行基因编辑和胚胎移植等操作,获得了羊毛长度显著长于对照组的优良品系。下列叙述错误的是(

)A.为获取足够的卵子,需对供体绵羊注射促性腺激素进行超数排卵处理B.为确保受体绵羊与供体绵羊生理状态一致,需进行同期发情处理C.受精卵发育至桑葚胚阶段,细胞数量和胚胎总体积均增加D.对照组绵羊的选择需考虑年龄、性别等无关变量的影响C解析

胚胎移植过程中通过对优良供体母畜注射促性腺激素,使其超数排卵,从而获取足够的卵子,A项正确。为确保早期胚胎移植后供体和受体处于相同的生理状态,需要对供体和受体进行同期发情处理,B项正确。受精卵发育至桑葚胚阶段,细胞数量增加,但胚胎总体积并不增加,C项错误。对照实验中无关变量应保持相同且适宜,所以对照组绵羊的选择应考虑年龄、性别等的影响,D项正确。【练模拟

拓角度】8.(2025·陕西咸阳模拟)源自犬肾细胞的细胞系,具有上皮细胞特征,因其易于在实验室条件下培养,已成为流感疫苗开发中的关键工具。在传统的细胞培养技术中,通常采用含有血清成分的培养基来促进细胞贴壁生长,待细胞达到一定密度后,通过消化处理将它们分离,以便进行后续的传代操作。下列叙述正确的是(

)A.血清中的营养物质可以促进动物细胞的生长B.胰蛋白酶主要用于消化血清中的蛋白质成分C.悬浮培养的细胞完全不受细胞密度和有害代谢物的影响D.10%CO2在细胞培养中主要用于维持培养液的pH稳定A解析

血清含有细胞生长所需的多种营养物质,还包括促生长因子、激素等调节物质,能够促进动物细胞的生长,A项正确。胰蛋白酶主要用于消化细胞间的蛋白质,使细胞分散,B项错误。悬浮培养的细胞仍会受到细胞密度、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素的影响,C项错误。5%CO2在细胞培养中主要用于维持培养液的pH稳定,D项错误。9.(2025·安徽淮北模拟)非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种具有包膜的双链DNA病毒,病毒蛋白p30位于病毒的包膜上,在病毒进入宿主细胞时期具有重要作用。科研人员设计如下流程制备ASFV单克隆抗体。下列叙述错误的是(

)A.该流程利用了动物细胞融合和动物细胞培养技术B.该单克隆抗体直接应用于人体可能会引起过敏反应C.①是从免疫小鼠脾中提取的多种B淋巴细胞D.②和③所进行的两次筛选过程都不需要用到ASFVD解析

制备单克隆抗体需要将已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,制成杂交瘤细胞,然后进行细胞培养使之产生单克隆抗体,该过程中需要用到动物细胞融合和动物细胞培养技术,A项正确。由图可知,该单克隆抗体是利用小鼠制备的,直接应用于人体,因其属于异源蛋白可能会引起过敏反应甚至危及生命,B项正确。由图可知,在获得①之前向小鼠体内注射ASFV(作为抗原),引发小鼠特异性免疫,获得已免疫的B淋巴细胞,由于在此过程中,小鼠还可能接受其他抗原物质刺激,因此从其脾中提取的B淋巴细胞有多种,C项正确。②代表利用选择培养基进行的第一次筛选,该过程不需要用到ASFV;③代表第二次筛选,即克隆化培养和抗体检测,其中抗体检测需要用到ASFV与克隆化培养的杂交瘤细胞产生的抗体进行抗原—抗体杂交,D项错误。突破点3基因表达载体的构建及基因工程的技术应用【高考命题预测】在高考命题中,该突破点主要考查在特定情境下,通过设计合适的引物、利用特定限制酶剪切,进行基因编辑或基因拼接,达到改变特定基因、实现基因重组、获得融合蛋白等目的,操作过程复杂,所涉及内容为当前最前沿的技术成果等。多以最新基因工程研究成果为载体,通过模式图的形式呈现,部分辅以电泳图进行结果检测,设问部分的主要形式有引物的设计或选择、限制酶的选择、基因结构分析、预期基因编辑后的功能等。聚焦1限制酶的选取与基因表达载体的构建【练真题

明方向】1.(2025·江苏卷改编)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为,下列相关叙述正确的是(

)A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变B.用两种限制酶分别酶切A基因后,形成的末端类型相同C.用两种限制酶分别酶切a基因后,产生的片段大小一致D.产前诊断时,该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定答案

D

解析

基因A突变为致病基因a是由碱基对T—A被G—C替换造成的,A项错误。用Hind

Ⅲ限制酶酶切A基因后会形成黏性末端,用AluⅠ限制酶酶切A基因后,形成的是平末端,B项错误。用AluⅠ限制酶切割a基因有3个酶切位点,而Hind

Ⅲ酶切位点只有2个,所以两种限制酶分别酶切a基因产生的片段大小不同,C项错误。用Hind

Ⅲ限制酶对基因a进行酶切,产生的片段与对基因A的酶切结果不同,通过电泳显示可以进行鉴定诊断,D项正确。2.(2025·安徽卷)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(

)A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌答案

C

解析

氯化钙处理大肠杆菌可使其处于感受态,提高转化效率,更多质粒(含目的基因或不含)导入,会增加蓝色(未插入目的基因,β-半乳糖苷酶基因完整)和白色(插入目的基因,β-半乳糖苷酶基因被破坏)菌落数,A项正确。仅含卡那霉素时,导入普通质粒和含目的基因质粒的大肠杆菌均会形成白色菌落,无法判定菌株是否含目的基因,B项正确。白色菌落仅说明β-半乳糖苷酶基因被破坏(可能插入目的基因),但目的基因不一定表达,不能直接判定为表达目标蛋白的菌株,C项错误。质粒K酶切后自身环化,导入大肠杆菌后β-半乳糖苷酶基因完整,可分解X-gal产生蓝色菌落,会使蓝色菌落偏多,D项正确。3.(2025·陕晋宁青卷)马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。(1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、

、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的

步骤中起作用。

(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的

(填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列,结合上表分析,上游引物应添加的碱基序列是5'-

-3',切割载体时应选用的两种限制酶是

。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。

(4种)脱氧核苷酸

延伸5'端

AGATCTBamHⅠ与EcoRⅠ

(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到

上,抗性基因

可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经

形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。

染色体DNA2再分化解析

(1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用,将单个脱氧核苷酸加到引物的3'端进行子链的延伸。(2)为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的5'端添加相应的限制酶识别序列。根据S基因的转录方向可知,使用双酶切法保证目的基因插入方向正确,载体中含有BamHⅠ、EcoRⅠ和XbaⅠ三个酶切位点,而S基因上含有XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ的酶切位点,首先要保证S基因结构的完整性,不能在S基因两端添加XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ的限制酶识别序列,由表格信息可选择能与载体中限制酶切出相同黏性末端的限制酶,BglⅡ和BamHⅠ切割产生的黏性末端相同,结合S基因的转录方向可知S基因的左端为上游启动子一端,应在S基因上游添加BglⅡ的识别序列,即5'-AGATCT-3',下游直接添加EcoRⅠ的识别序列。因此,切割载体应选用的两种限制酶为BamHⅠ和EcoRⅠ。(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中的T-DNA会转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上。据图可知,载体的T-DNA片段中抗性基因2含有启动子和终止子,可正常表达,若T-DNA成功整合到被侵染细胞的染色体DNA上,则该细胞就可具有抗性基因2对应的抗性,因此,抗性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。4.(2025·河北卷)为治理水体中对生物有毒害的镉污染,研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体,转入单细胞衣藻,实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁,以吸附水体中的镉离子。回答下列问题。(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中,随着PCR反应进行,分子数量逐渐减少的是

和

。模板与引物在PCR反应的

阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,其原因为

。

引物脱氧核苷酸复性PCR反应中DNA变性需高温,耐高温的DNA聚合酶能在高温下催化子链合成(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时,为避免错误连接,需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列,其中GP1两端应添加

(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时,可催化载体和目的基因之间形成

键。

图1SmaⅠ和EcoRⅠ

磷酸二酯(3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为

,初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后,若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量

,则表明融合蛋白能结合镉离子。

发黄色荧光且荧光定位于细胞壁高(4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6d后,检测细胞密度,结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是____________________________

。

240μmol/L镉离子浓度下,转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是

。

注:镉离子对渗透压的影响忽略不计。

图2转基因衣藻可通过细胞壁上的融合蛋白吸附培养液中的镉离子,减轻了镉离子对细胞的毒害培养液中的镉离子浓度过高,超出融合蛋白的吸附能力,细胞内镉离子积累过多产生强毒害(5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理,与施加化学药物法相比,能体现出其环境治理优势的两个特性是

和

。(填标号)

①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递①③解析

(1)PCR反应中,脱氧核苷酸(原料,随循环进行被消耗)和引物(与模板结合后被延伸,消耗减少)的分子数量逐渐降低。模板与引物在PCR反应的复性阶段结合(温度降低,引物与模板互补配对)。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,因为PCR反应要经高温变性(使DNA解旋),普通酶会失活,耐高温的DNA聚合酶才能在高温环境下催化子链合成。(2)观察载体上的酶切位点,结合基因连接顺序(SP7→CADR→GP1→YFP),根据限制酶识别序列及切割位点可知,载体中前两个酶切位点经NheⅠ和XbaⅠ酶切后形成的黏性末端一致,如果第一个基因CADR添加这两个限制酶的识别序列,与切割后的载体连接时会形成倒位连接,因此CADR两端添加NheⅠ(或XbaⅠ)和SmaⅠ两种限制酶的识别序列,先与载体连接。第二个基因GP1两端添加SmaⅠ和EcoRⅠ两种限制酶的识别序列,连接到已重组了CADR基因的载体上。最后YFP基因两端添加EcoRⅠ和EcoRⅤ两种限制酶的识别序列,连接到已重组了CADR和GP1两个基因的载体上,从而完成基因表达载体的构建。DNA连接酶催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键。(3)融合蛋白含黄色荧光蛋白YFP,若表达成功,转基因衣藻在荧光显微镜下会发出黄色荧光且荧光定位于细胞壁(GP1使融合蛋白定位于细胞壁)。若融合蛋白能结合镉离子,转基因衣藻细胞壁的镉离子含量会高于野生型(野生型无CADR高效吸附作用)。(4)转基因衣藻的生长优于野生型,原因是细胞壁上的融合蛋白能吸附培养液中的镉离子,减轻了镉离子对细胞的毒害(转基因衣藻通过细胞壁上的CADR减少镉进入细胞)。240

μmol/L镉离子浓度下,转基因衣藻和野生型衣藻的生长均受到抑制,是因为镉离子浓度过高,超出融合蛋白的吸附能力,细胞内镉离子积累过多产生强毒害。(5)与化学药物法相比,转基因衣藻的优势:①可自我繁殖,无需持续投放,能长期发挥作用;③吸收富营养化物质:治理镉污染的同时,改善水体富营养化(如吸收N、P)。衣藻生长受镉离子浓度影响,非优势,②不符合题意;镉沿食物链传递,有风险,非优势,④不符合题意,故填①和③。【归纳拓展】1.限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点,如图乙)。(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)2.基因表达载体的构建过程

【练模拟

拓角度】5.(2025·安徽合肥三模)低温是早春和晚秋作物生长的重要环境胁迫因子,可导致植物的叶出现脱水萎蔫。科研人员以一种农杆菌Ti质粒为载体,将由低温诱导启动子RD29A控制的拟南芥耐寒基因AtCOR15a导入番茄基因组,以期改良番茄的耐寒性,为培育耐寒性番茄新品种奠定基础。回答下列问题。(1)低温诱导启动子RD29A的作用是

。请在图中标明重组后拟南芥耐寒基因AtCOR15a和低温诱导启动子RD29A的位置。

低温条件下,被RNA聚合酶识别和结合,驱动AtCOR15a基因的转录

(2)将含有基因AtCOR15a的重组Ti质粒转入农杆菌,再用农杆菌侵染番茄无菌苗子叶,使用抗生素

筛选出具有该抗生素抗性的幼苗后,还需提取抗性幼苗的染色体DNA进行PCR鉴定,目的是

。

(3)通过对番茄幼苗的总RNA进行测定,获得基因AtCOR15a相对表达量最高的3个株系A1、A33、A37。为进一步从个体水平对这些株系幼苗的耐寒性进行评估,简要写出实验设计思路:

。

卡那霉素

检测番茄的染色体DNA上是否插入了AtCOR15a基因

以野生型番茄和A1、A33和A37株系番茄为材料,低温处理相同时间后,观察低温条件下番茄叶的脱水萎蔫程度,比较各材料间耐寒性的差异解析

(1)启动子的作用是提供RNA聚合酶识别和结合的位点,驱动基因转录出mRNA,所以低温诱导启动子RD29A的作用是低温条件下,被RNA聚合酶识别和结合,驱动AtCOR15a基因的转录。因为Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上,所以重组后拟南芥耐寒基因AtCOR15a和低温诱导启动子RD29A应位于T-DNA内。(2)由图可知,T-DNA中含卡那霉素抗性基因,所以使用抗生素卡那霉素筛选出具有该抗生素抗性的幼苗,提取抗性幼苗的染色体DNA进行PCR鉴定,目的是检测番茄的染色体DNA上是否插入了AtCOR15a基因。(3)本实验的目的是为进一步从个体水平对获得基因AtCOR15a相对表达量最高的3个株系A1、A33、A37的耐寒性进行评估,自变量为番茄幼苗的种类,因变量为番茄叶的脱水萎蔫程度,实验设计思路为以野生型番茄和A1、A33和A37株系番茄为材料,低温处理相同时间后,观察低温条件下番茄叶的脱水萎蔫程度,比较各材料间耐寒性的差异。聚焦2基因工程技术的应用【练真题

明方向】6.(2024·新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。(1)限制酶切割的化学键是

。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是______________________________________________

。

磷酸二酯键不破坏N基因,使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子,能保证N基因正常表达(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和

。

C—G、A—T、U—A【情境链接】CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑,其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定的碱基序列互补,从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合,并在特定位点切割DNA。CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物,与传统的基因工程相比,其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。[命题设计](1)从功能上来看,CRISPR/Cas9系统相当于基因工程中的限制性内切核酸酶,该系统广泛存在于细菌中,其在细菌中的作用是

。

(2)CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而“脱靶”的现象,sgRNA的识别序列越短,基因编辑的脱靶率就越高。请分析原因。

。

切割外源DNA,使之失效,起到保护自身的目的(或抵抗外源DNA的入侵,保护自身或清除入侵病毒DNA)sgRNA的识别序列短,特异性差,容易与其他DNA片段结合造成编辑出错

【练模拟

拓角度】7.(2025·四川内江三模)2-苯乙醇(2-PE)具有令人愉悦的玫瑰香气,常作为添加剂而广泛地应用于食品、化妆品和医药领域。酿酒酵母生产2-PE过程中,支路基因ARO8的表达会损耗中间代谢物而导致2-PE产量不高。科研人员欲使用CRISPR/Cas9基因编辑技术(CRISPR/Cas9系统编码的sgRNA可引导Cas9蛋白切割目的基因)对尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母进行编辑处理,以降低由ARO8基因导致的中间产物损耗来提高2-PE产量。生产过程如图1。图1注:BclⅠ识别序列为5'-TGATCA-3',SmiⅠ识别序列为5'-TTTAAA-3',EcoRⅠ识别序列为5'-GAATTC-3';URA3基因表达产物可指导合成尿嘧啶,但当培养基中含有5-氟乳清酸(5-FOA)时,尿嘧啶可将5-FOA转化为有毒的5-氟尿嘧啶而抑制细胞生长。回答下列问题。(1)构建基因表达载体。人工合成sgRNA对应的DNA片段时,应根据

基因的部分已知碱基序列等设计。据图分析可知,为保证sgRNA对应的DNA片段正确插入质粒1中,在进行PCR扩增时需在该DNA片段上下游分别添加

限制酶的识别序列,再用

连接。基因表达载体除了图示组成外,还需要有

。

(2)基因表达载体的扩增。在含有

的培养基上筛选培养导入重组质粒的大肠杆菌,提取质粒。

ARO8BclⅠ、SmiⅠ

DNA连接酶

复制原点氨苄青霉素(3)导入受体细胞。用质粒2转化尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母,在

的平板上筛选成功导入质粒的酿酒酵母。Cas9蛋白在sgRNA引导下切割ARO8基因实现对ARO8基因的敲除。实现敲除后,为避免质粒残留带来后续影响,研究人员将获得的单菌落多次传代,随后稀释涂布在含有

的平板上,筛选并获得不再含有质粒2的菌落。

缺乏尿嘧啶5-氟乳清酸(5-FOA)(4)表达水平检测。为验证ARO8基因的缺失对2-PE合成的影响,研究人员对2-PE发酵产量进行了检测,结果如图2。实验结果说明

。

图2ARO8基因的缺失能提高2-PE产量(或ARO8的表达会导致2-PE产量较低)解析

(1)图1中显示,CRISPR/Cas9系统编码的sgRNA可通过碱基互补配对与ARO8基因进行结合,引导Cas9蛋白切割ARO8基因,所以,人工合成sgRNA对应的DNA片段时,应根据ARO8基因的部分已知碱基序列等设计。图中质粒1中,启动子与终止子之间依次有BclⅠ、SmiⅠ、EcoRⅠ的酶切位点,而EcoRⅠ会破坏氨苄青霉素抗性基因,所以,在进行PCR扩增时需在sgRNA对应的DNA片段上下游分别添加BclⅠ、SmiⅠ限制酶的识别序列,再用DNA连接酶进行连接。基因表达载体的组成包括目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。图1中的质粒2即基因表达载体,其中显示了启动子、终止子、Cas9基因、sgRNA对应的DNA片段(目的基因)、URA3基因和氨苄青霉素抗性基因(标记基因,它们的表达产物便于目的基因的检测与受体细胞的筛选)。所以基因表达载体除了图示组成外,还需要有复制原点。(2)因为基因表达载体含氨苄青霉素抗性基因,所以进行基因表达载体的扩增时,可以在含有氨苄青霉素的培养基上筛选培养导入重组质粒的大肠杆菌,提取质粒。(3)同理,用质粒2转化尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母,在不含尿嘧啶的平板上筛选成功导入质粒的酿酒酵母。基因表达载体上的URA3基因的表达产物可指导合成尿嘧啶,但当培养基中含有5-氟乳清酸(5-FOA)时,尿嘧啶可将5-FOA转化为有毒的5-氟尿嘧啶而抑制细胞生长。Cas9蛋白在sgRNA引导下切割ARO8基因实现对ARO8基因的敲除。实现敲除后,为避免质粒残留带来后续影响,研究人员将获得的单菌落多次传代,随后稀释涂布在含有5-氟乳清酸(5-FOA)的平板上,筛选并获得不再含有质粒2的菌落。(4)为验证ARO8基因的缺失对2-PE合成的影响,研究人员对2-PE发酵产量进行了检测,图2显示,在24

h的发酵时间中,ARO8基因缺失的突变株生产的2-PE浓度比原型株更高,说明ARO8基因的缺失能提高2-PE产量(或ARO8的表达会导致2-PE产量较低)。聚焦3PCR引物的选择与设计1.引物及其作用(1)PCR需要引物的原因:PCR必须加入引物,这是由DNA聚合酶的特点决定的。与体内DNA复制一样,DNA聚合酶不能直接催化两个游离的脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键,只能把脱氧核苷酸添加到一段脱氧核苷酸链的3'端。在PCR中,直接加入一对单链DNA作为引物,这样可以避免像体内DNA复制那样,复制完毕后因切除RNA引物而造成子链DNA长度变短的情况。所以引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸;体外是DNA,体内是RNA。引物的作用是把脱氧核苷酸添加到一段脱氧核苷酸链的3'端。(2)引物的特点①PCR的引物必须是成对的(两种)。如果只加一种引物,经过n轮循环,只能产生n条新的单链DNA,无法实现双链DNA的指数形式扩增。②一对引物分别特异性结合在模板链上的目的基因两侧,引物与模板的结合位点决定了特异性扩增产物的起点和终点。(3)结果:DNA聚合酶能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列。经过多轮扩增后,非目标片段可以忽略不计。因此PCR的产物主要是目的基因,即实现了特异性扩增。[问题设计](1)PCR需要两种引物,但是引物序列不同是由于

。

(2)如图为X蛋白的部分基因序列,所示序列为引物结合的部分,据图分析:扩增X蛋白基因所需的引物序列是

;

。

DNA是反向平行的双链,DNA聚合酶只能从引物3'端延伸DNA链,用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增

5'-ATGCCGTAAGTCCTAC-3'

5'-TGATCTACGGCTTACA-3'(3)对人干扰素基因进行PCR扩增时需要一对引物,应从下图中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取

(填字母)作为引物。

B、C(4)为了对重金属污染的土壤进行生物修复,研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白基因(HMA3)与外源高效启动子连接,导入杨树基因组中(如图)。注:①②③④表示引物。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因,同时避免内源HMA3基因的干扰,在进行PCR扩增时,应选择的引物组合是

。

①+②(或①+④)2.引物的设计(1)设计PCR所用引物时,需注意引物不能与模板的其他区域结合,从而保证扩增的特异性,还要避免引物内部或者两条引物之间互补配对。(2)引物的大小:复性时,为何两条模板链能与引物结合而不是模板链之间结合呢?这是因为,引物一般只有20~30个核苷酸,复性温度就是根据引物序列专门设定的,而且引物的浓度远大于模板的浓度,所以当温度下降到复性温度时,引物会更快地特异性结合在模板上。引物太短造成特异性差,会出现杂链;引物太长会增加合成成本,另外过长的引物会使复性温度提高,甚至会超过Taq

DNA聚合酶的最适温度,从而影响扩增效率。(3)PCR的复性温度受引物中G、C碱基含量的影响。温度过高,不利于引物与模板结合;温度