DB1302∕T 397－2014 动物产品中动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法

B40

DB1302

唐山市地方标准

DB1302/T397—2014

动物产品中动物源性成分检测方法

实时荧光PCR法

2014-11-25发布2014-12-25实施

唐山市质量技术监督局发布

DB1302/T397—2014

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由唐山市质量技术监督局提出。

本标准由唐山市农牧局归口。

本标准起草单位：唐山市畜牧水产品质量监测中心。

本标准起草人：张建民、张鑫、李爱军、蒙君丽、张雅会、庞学良、周鑫、肖琎、张鹤鹏、赵福国。

DB1302/T397—2014

动物产品中动物源性成分检测方法实时荧光PCR法

1范围

本标准规定了动物产品中动物（猪、牛、羊、兔、马、驴、鸡、鸭、鹅、狗、猫、鼠、貉）源性成

分检测实时荧光PCR法。

本标准适用于动物产品中动物（猪、牛、羊、兔、马、驴、鸡、鸭、鹅、狗、猫、鼠、貉）源性成

分定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义、缩略语

下列术语和定义、缩略语适用于本文件。

3.1术语和定义

3.1.1Ct值

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

3.1.2TaqMan探针

寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭剂连接在探针的3’末端。

3.1.3猪源性成分

猪种属特异性DNA片段。

3.1.4牛源性成分

牛种属特异性DNA片段。

3.1.5羊源性成分

羊种属特异性DNA片段。

3.1.6兔源性成分

兔种属特异性DNA片段。

3.1.7马源性成分

马种属特异性DNA片段。

3.1.8驴源性成分

驴种属特异性DNA片段。

3.1.9鸡源性成分

鸡种属特异性DNA片段。

3.1.10鸭源性成分

鸭种属特异性DNA片段。

3.1.11鹅源性成分

鹅种属特异性DNA片段。

1

DB1302/T397—2014

3.1.12狗源性成分

狗种属特异性DNA片段。

3.1.13猫源性成分

猫种属特异性DNA片段。

3.1.14鼠源性成分

鼠种属特异性DNA片段。

3.1.15貉源性成分

貉种属特异性DNA片段。

3.2缩略语

DNA：脱氧核糖核甘酸

PCR：聚合酶链式反应

4原理

利用TaqMan探针实时荧光PCR技术，根据不同物种的特异性基因序列对不同动物源性成分进行鉴定。

利用裂解液裂解细胞释放DNA，再结合DNA制备膜技术提取DNA。以提取的DNA为模板，通过特异性引物和

荧光物质探针进行动物源性成分实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱

判定，实现对动物产品中动物源性成分的定性分析。

5材料与试剂

5.1设备和材料

5.1.1实时荧光PCR检测系统

5.1.2高速台式冷冻离心机（最高转速12000r/min以上）

5.1.3剪刀、镊子（经180℃±2℃，2h高温灭菌）

5.1.4微量可调移液器及配套吸头（10μL、200μL、1000μL）

5.1.5实时荧光PCR反应管

5.1.6离心管（1.5mL、2.0mL）

5.1.7紫外灯

5.1.8水浴锅

5.1.9恒温干燥箱

5.1.10超纯水机

5.1.11分析天平：感量为0.00001g

5.2试剂

除特别说明以外试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容

器分装。

5.2.1无水乙醇（C2H6O）：优级纯

5.2.2基因组DNA提取试剂盒

本试剂盒分试剂PartⅠ和PartⅡ两部分。详见表1，表2。

2

DB1302/T397—2014

表1PartⅠ组成

蛋白酶K（ProteinaseK，20mg/mL）1mL

核糖核酸酶A（RNaseA，10mg/mL）0.5mL

注：-20℃保存

表2PartⅡ组成

缓冲液GL（BufferGL）12mL

缓冲液GB（BufferGB）12mL

缓冲液WA（BufferWA）28mL

缓冲液WB（BufferWB）24mL

洗脱缓冲液（ElutionBuffer）14mL

离心柱（SpinColumns）50支

收集管（ColletionTubes）50支

注：缓冲液GL若出现沉淀，于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。缓冲液WB在首次使用前，添加56mL的无水乙醇，

混合均匀。试剂盒室温（15℃-25℃）保存。

5.2.3动物源性成分试剂盒

猪、牛、羊、兔、马、驴、鸡、鸭、鹅、狗、猫、鼠、貉源性成分实时荧光PCR试剂盒，-20℃保存。

6材料与试剂

6.1样品模板DNA的制备

取2mg～25mg动物产品，至于2mL离心管中，用剪刀尽可能剪成碎块，加入180μL的缓冲液GL、20μL

的蛋白酶K和10μL核糖核酸酶A，于56℃水浴至组织完全裂解，水浴过程中将样品取出振荡2～3次。向裂

解液中加入200μL缓冲液GB和200μL无水乙醇，充分吸打混匀。将离心柱安置于收集管上，将上述制备

溶液移至离心柱中，12000r/min离心2min，弃去滤液。将500μL缓冲液WA加入至离心柱中，12000r/min

离心1min，弃去滤液。沿离心柱管壁四周加入700μL的缓冲液WB，12000r/min离心1min，弃去滤液。再

沿离心柱管壁四周加入700μL的缓冲液WB，12000r/min离心1min，弃去滤液。将离心柱安置于收集管，

12000r/min离心2min。将离心柱安置于1.5mL离心管中上，在离心柱膜中央处加入100μL65℃的洗脱缓

冲液，室温静置5min，12000r/min离心2min洗脱DNA。以上操作均在样品配置区进行。

6.2动物源性成分检测

6.2.1扩增试剂准备

动物源性成分检测试剂盒取出，4℃下融化。实时荧光PCR反应体系见表3。向每个实时荧光PCR反应

管中各分装18μL反应混合液，以上操作均在扩增区进行。进行样品检测时，应同时进行空白对照、阴性

对照和阳性对照试验。

表3实时荧光PCR反应体系(20μL体系)

试剂组成体积（μL）

2×预混液10.0

引物混合液4.0

探针混合液2.0

样品DNA2.0

ddH2O2.0

3

DB1302/T397—2014

注:阳性对照用相应的组织DNA作为模板,阴性对照用不含相应成分的样品作为模板,空白对照用等体积ddH2O作为模

板。

6.2.2加样

在各设定的PCR反应管中分别加入制备好的2μL样品DNA溶液,盖紧盖子,离心10s。以上操作均在PCR

反应配置区进行。

6.2.3实时荧光PCR检测

将6.2.2中离心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样品摆放顺序。循环条

件设置：50℃保持2min；以1.6℃/s速度上升到95℃保持10min；保持在95℃下15s，以1.6℃/s速度下降

到60℃保持45s，循环40次，在60℃收集荧光。检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。以上操作

均在扩增产物分析区进行。

7结果判定

7.1结果分析条件设定

直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整。

7.2结果判定与表述

7.2.1结果判定

空白对照：无扩增曲线出现，或Ct值＞40。

阴性对照：无扩增曲线出现，或Ct值＞40。

阳性对照：有典型的扩增曲线出现，Ct值≤35。

7.2.2结果表述

a）样品：有典型的扩增曲线出现，Ct值≤35，结果陈述为“检出猪源性成分”、“检出牛源性成

分”、“检出羊源性成分”、“检出兔源性成分”、“检出马源性成分”、“检出驴源性成分”、“检

出鸡源性成分”、“检出鸭源性成分”、“检出鹅源性成分”、“检出狗源性成分”、“检出猫源性成

分”、“检出鼠源性成分”、“检出貉源性成分”。

b）样品：无扩增曲线出现，或Ct值＞40，结果陈述为“未检出猪源性成分”、“未检出牛源性成

分”、“未检出羊源性成分”、“未检出兔源性成分”、“未检出马源性成分”、“未检出驴源性成分”、

“未检出鸡源性成分”、“未检出鸭源性成分”、“未检出鹅源性成分”、“未检出狗源性成分”、“未

检出猫源性成分”、“未检出鼠源性成分”、“未检