不同产地对独一味环烯醚萜苷化合物含量的影响

不同产地对独一味环烯醚萜苷化合物含量的影响摘要目的：对四种不同产地中栽培的藏药独一味中环烯醚萜苷类成分用高效液相色谱方法进行含量测定，以检测独一味中环烯醚萜苷类化合物的成分在不同产地中含量的变化。方法：结论：关键词：高效液相色谱独一味环烯醚萜苷类1独一味的情况独一味[Lamiophhmisrotata(Benth．)Kudo]为唇形目唇形科植物，药典记载，该物种最早起源于糙苏属[独一味和糙苏属关系的研究进展李茂星]，现已被单独分离出来，是独一味属的物种，该物种仅独一味一种。其茎内木质部不发达，也有人称其为独步通，藏语中称之为“达巴”、“打布巴”。1.1历史起源据《四川中药志》记载，在我国抗战时期，四川省旧瞻化县，当地的居民无意中发现了该药并用来治疗枪伤，因其疗效独特，作用效果显著，因此得名为“独一味”。用来治疗枪伤创伤，跌打损伤所引起的出血效果极好，I960年版《四川中药志》，认为根及根茎为独一味的药用部位，并有“活血化瘀，行气止痛，抗肿消炎，续筋接骨”等的功效，“主治筋骨损伤及跌打损伤出血等症状”。并明确规定了禁忌情况和孕妇产妇等特殊情况下的使用。[四川中药志，M]本品为藏药，但追根溯源，早在几千年前唐朝的《月王药诊》、《四部医典》及清朝的《晶珠本草》等藏族古籍对此药均有记载。1991年出版的由徐治国教授主编的《中药学》一书，“祛风除湿”被作为一种新的功效补充了进去，临床上用来治疗“四肢麻木、风湿疼痛、关节肿胀等红肿热痛”。[2]同时认为其入药部位为独一味植物的全草，增加了取独一味的活血化瘀之功，用于治愈“妇女产后闭经，淤血，肿块等症状。进一步丰富了独一味的研究及临床应用，对之后独一味多种剂型的问世起到了不可或缺的作用。2005年版的《中华人民共和国药典》也相应的增补了“止血”的功效，明确提出用于治疗“外伤出血”。至此，人们对独一味的各方面认识已趋于成熟，有关独一味的各种研究也逐渐深入与完善。1.2生长环境及地理分布独一味在我国西南边陲的西藏省，西南地区内陆的四川省，西北内陆的青海省，西南地区的云南省以及西北地区的甘肃省等地有均有广泛的分布。根据李燕等[3]对甘南州玛曲县八个不同经纬度的乡镇中独一味生长情况的研究，结果表明，海拔3900米~4900米的退化石质高寒草甸是主要生长区，强风化后的裸岩或砾石滩等地分布广泛。1.3独一味植株情况独一味的植株一般高2.5-10厘米，根状茎长而粗，直径1厘米。它通常有四片叶子，呈辐状对称，形状多样，有圆形、菱形、三角形等。叶片的长，宽均为7~12CM，叶片前端，圆或尖，叶片基部，心形或楔形。独一味的花为\o"独一味"轮伞状花序，长3.5-7厘米，序轴紧密地包被着较短的柔毛；苞片呈披线形，披针形。花冠长约1.2厘米，外被微柔毛，微柔毛密被花冠内。花萼呈管状，紫褐色。花期六到七个月，果期八到九个月。[4]1.4性味归经与功能主治关于独一味的性味归经，古代医籍与现代药理学的研究稍有出入，清代的《晶珠本草》中记载为“甘”，苦。”《甘肃中草药手册》中记载其“苦、辛，寒。”[5]但早年的医书古籍没有记载归经，直至徐治国教授主编的《中药学》中明确的记载了其归经:“性寒，味苦，有小毒。归肝经”［2］而在现代药理学中，将其性定为平，味定为甘，苦。功能主治方面，我国藏医认为可用于治疗皮肤湿疹、痔疮和其他疾病的分泌物。祛风除湿，而现代药理学普遍将其用于活血化瘀，治疗创伤，细菌感染后的抗菌消炎，止血外用，提高自身免疫力等。2独一味制剂的情况（列表）独一味制剂情况一览表剂型类型传统剂型片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、软胶囊、独一味总环烯醚萜苷类散剂药典记载（2010版）片剂，胶囊剂新剂型自微乳化胶囊、微丸、冻干粉针剂、巴布膏等通过查阅最近这几年的相关文献发现，近年来，独一味制剂的新剂型也层出不穷，广受人们的欢迎且起效迅速药物稳定性好。如采用新技术和新辅料进行新剂型的开发主要的种类为自微乳化软胶囊、微丸、冻干粉针剂、分散剂、巴布膏等。但这些新剂型还处于临床应用的前期阶段，还没有大范围使用，未来关于独一味制剂的研究将重点着手于新剂型的研究与开发上。2独一味药效物质研究情况从天然植物独一味的地上部分，地下部分，全草分离提取出了主要的化学成分单萜中的环烯醚萜苷类，黄酮类，苷类物质苯乙醇苷，香豆素类，挥发油类等。这些成分是独一味发挥镇痛止血消炎等药理作用的主要有效成分，因此其各成分的提取物也被广泛地应用于临床。2.1、化学成分(文献引用)名称类型化学成分药理作用主要研究人员1环烯醚萜苷类山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯、螃蟹甲苷、胡麻属苷、螃蟹甲苷II、番木鳖苷、独一味素A、独一味素B、独一味素C镇痛抗炎张承忠[]易进海[]张凤[]2黄酮类木犀草素、槲皮素、芹菜素-7-O-新陈皮糖甙、1-羟基-2,3,5-三甲氧基吨酮、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、王瑞冬[]易进海[]梁重栋[]张兆琳[]张爱军[]3苯乙醇苷类连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、独一味苷A、去咖啡酰基类叶升麻苷、肉苁蓉苷E。王瑞冬[]孙俊[]张凤[]4挥发油类棕榈酸、亚油酸、亚油酸乙酯、有月桂酸、肉豆蔻、十五烷酸、14-十五碳烯酸。LIU[]刘海峰[]2.2药理作用2.2.1镇痛作用瞿剑[8]通过选取了127例分别具有腰膝疼痛，带状疱疹，痛经以及外科手术的患者，在传统治疗的基础上加用独一味，发现使用独一味的患者其痛感持续时间相比未使用独一味的患者有所减少，治疗总有效率达93.7％。由于独一味舒经活络，去除血瘀，行气活血，使气血运行通畅，从而达到治疗疾病的目的。2.2.2止血作用戴星等[9]通过选取南昌大学第四附属医院妇产科120例接受过宫颈超高频电波刀手术的患者，实验设置了实验组与空白对照组两个组别，对实验组使用独一味制剂（胶囊），对空白组不做任何处理，观察一周后的出血情况。结果表明使用药物的实验组出血率，出血时间，创面愈合率均高于不使用独一味药物对的空白组。表明独一味具有良好的止血作用，可以在医院及设备不完善的地方推广使用。2.2.3妇科疾病李玲等[10]通过随机选取妇科门诊120例子宫颈糜烂患者（排除其他炎症），分为实验组与对照组，观察独一味对宫颈糜烂患者的治疗情况，实验结果发现，独一味对于治疗妇科疾病，例如宫颈糜烂等作用较好，尤其适用于轻、中度患者。重度患者也有一定程度的治疗效果，局部清除子宫糜烂处的炎症,有去腐生肌之功效，且不需要昂贵设备，治疗方便简单，适合对基层医院进行初步治疗。2.2.4抗炎抗菌，提高免疫据最近几年对独一味药理作用以及药代动力学的研究发现，独一味在治疗细菌感染后的消炎，增强自身免疫力等方面也具有较好的疗效。2.2.5癌症止痛将其作为癌症前期的止痛药，具有明显的止痛效果，并且对人体有较小的毒副作用，不易产生耐受性，且根据耐受性有较大的安全范围。2.2.6抗肿瘤（胃溃疡）吴婧等[7]通过体外实验观察独一味的有效提取物对肿瘤细胞的作用发现，独一味提取物的B3部分阻止肿瘤细胞的有丝分裂，对肿瘤细胞的生长繁殖等具有显著的抑制作用。其中抑制肿瘤细胞增殖的关键是独一味的乙酸乙酯提取物，为独一味的药效学研究提供了更深层次的研究价值。3环烯醚萜类化合物的研究情况3.1藏药独一味因其具有良好的止痛止血作用而被广泛的应用于临床，作用与云南白药相似[]，而独一味中的主要有效部位为环烯醚萜苷类，根据郑亚南等[]通过分别采用实验类别具体方法实验结果镇痛实验醋酸扭体法用药后小鼠的扭体次数明显降低热板测痛法用药后增加了小鼠的热板痛阈值抗炎实验二甲苯致耳廓肿胀法环烯醚萜苷类类能明显抑制小鼠耳廓肿胀，而苯乙醇苷类和黄酮类则不是很明显叉菜胶致大鼠足跖肿胀法与上述结果相似，环烯醚萜苷类对足肿胀抑制作用最为显著。3.2环烯醚萜类化合物是一类特殊的单萜类化合物，是毛茛的双醛缩醛衍生物。环烯醚萜类化合物广泛分布于植物界。在杜鹃花科、龙胆科、龙胆科、唇形科等植物中有大量的环烯醚萜苷。

焦磷酸香叶酯(GPP)合成植物体内的环烯醚萜苷类，但其生物合成途径和其他单萜不同。环烯醚萜类化合物具有半缩醛和环戊烷环的结构特征。半缩醛的C1羟基是不稳定的，主要以C1羟基和糖苷的形式存在于植物中，大多数是β-D-糖苷。根据环戊烷是否为开环，可分为两类:环烯醚萜苷和开环环烯醚萜苷。二零一零版的中国药典第一部中记载了藏药独一味，并将山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯作为指标成分。张教授从独一味地上部分分离提出了8-O-乙酰基山栀苷甲酯【】。贾诩等[6]通过对小鼠的镇痛，抗炎实验，小鼠腹腔通透性实验以及8－去羟基山栀子苷急性毒性实验等七个实验对独一味中的环烯醚萜苷类化合物药效学进行了全方位考察研究，发现环烯醚萜苷类化合物在小鼠的镇痛及抗炎实验中均发挥了较好的作用，其中8-O-乙酰山栀苷甲酯和8－去羟基山栀子苷甲酯在各个实验中对小鼠的作用最显著，具有良好的镇痛作用和抗炎作用。可能的机制是中环烯醚萜苷类在体内可以抑制环氧化酶COX的活性，从而抑制前列腺素在体内花生四烯酸代谢中发挥镇痛和抗炎作用。作用机制与阿司匹林类似。环烯醚萜苷类化合物由于其在自然界的广泛分布以及较好的治疗效果，现已成为临床研究的“热门选手”。近年来，研究其药用价值的文献层出不穷，对于其新剂型的制备也成为了当下的热点之一，同时由于其具有多种生理活性和药理作用，很多方面还没有被研究出来，具有很大的发掘空间。也因此吸引了很多中外学者对于其进行更深入的研究。研究前景十分广阔，为我国中药及天然产物走出国门奠定了良好的基础。但通过查阅文献也发现了一些问题，比如：①环烯醚萜苷类化合物代谢过程较复杂，在体内和体外的药理效应不一样，因此，在研究时，应从体内与体外代谢相结合，生理与病理状态相结合，全面研究环烯醚萜苷类化合物的药物效应动力学和药物代谢动力学。②由于环烯醚萜苷类化合物在体内的水解产物化学稳定性差，故对于环烯醚萜苷类化合物在体内的吸收，分布，代谢，排泄等方面研究文献较少。仍处于瓶颈期。4不同产地对药用植物的影响天然药用植物的生长发育过程受外界环境因素影响较大，主要有温度，外界光线，降雨量，空气中所含的水分，土壤的土质情况等。同一种药用植物生长栽培的环境不同，其形态特征，颜色大小，功效作用等都可能会有差别，因而也就有了“道地药材”这一说法。其中，不同产地的药用植物，其有效成分含量，药用部位，药理作用等都有差异。海拔高度是影响上述这些差异的最主要因素，据研究报道，海拔高度升高一百米，温度下降0.62摄氏度，降水量与海拔高度也具有确定性现象之间的关系。由此可见，产地不同，药用植物的生长环境不同，从植物发芽到结果直至最后的采摘过程，环境因子都始终影响着植物的形态大小，功效作用。因而也从一定程度上丰富了物种多样性，形成了多种“同名异物”，“同物异名”的植物，为我国发展中药及天然药物提供了广泛的来源。通过查阅最新文献，杨蕊菁等[11]通过使用高效液相色谱法对10种不同产地的当归进行主成分的含量测定以及分析，发现在不同产地中当归药材质量有显著的差异，其中甘肃岷县麻子川乡绿叶村一社的当归药材质量最好，从而为当归的生产培育条件提供了较好的参考。樊鹏程等[13]用反相高效液色谱测定不同产地中4种环烯醚萜苷类化合物,研究结果表明不同产地环烯醚萜苷类化合物含量差异较大，因此，对不同产地中独一味的主要化学成分环烯醚萜苷类化合物开展含量测定很有必要。5仪器与材料5.1仪器实验仪器仪器名称型号生产厂家高效液相色谱仪检测器进样器纯水机旋转蒸发仪电子天平

5.2试药试剂（药）名称生产厂家产品批号甲醇HPLC级Fisher公司，USA乙腈HPLC级Fisher公司，USA纯化水山栀苷甲酯成都曼彻斯特生物科技有限公司8-O-乙酰山栀苷甲酯成都曼彻斯特生物科技有限公司5.3独一味样品来源地编号产地来源途径生境海拔经度纬度群落组成坡度坡向1阿万仓野外采摘灌丛3749402.5/22阿万仓野外采摘草甸3749402.5/23阿万仓野外采摘草甸37302.5/24阿万仓野外采摘溪边草甸37215阿万仓野外采摘湿地平原34676尼玛购买35817河曲马场购买35368曼日玛购买35136方法与结果6.1色谱条件（）C18色谱柱(4.6mm×250mm，3.5μm)；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脱：0～8min，12%A；11～35min，11%～15%A；体积流量1.0mL/min，检测波长为238nm，柱温为室温(25℃)，进样量10µL。6.2混合对照品溶液的制备将独一味药材置于干燥环境中阴干，精密称取山栀苷甲酯对照品（）mg，8-O-乙酰山栀苷甲酯甲酯对照品（）mg于同一（）ml的容量瓶中，用（）%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为（）mg/ml的对照品溶液。6.3供试品溶液的制备取独一味粉末（）过（）目筛约g，精密称定，置（）ml具塞锥形瓶中，精密加入（）%甲醇（）ml，称定质量，回流提取60min，冷却后补足其重量，摇匀，静置，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。6.4线性关系的考察分别精密吸取6.2项下混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0于6个10ml的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，静置，得到不同浓度的混合对照品溶液。依次取各质量浓度的各溶液10μL，在6.1的色谱条件下测定，横坐标（X）为对照品的质量浓度，纵坐标(Y)为对应的峰面积。绘制标准曲线，结果见表X，表明两种指标性成分在相应的线性范围内，线性关系良好。6.5精密度考察精密吸取对照品溶液10μL，在6.1的色谱条件下，连续进样5次，并记录峰面积。得到山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯的RSD值分别为（），（），表明仪器精密度良好。6.6重复性考察取独一味样品粉末6份，按6.3项下制备供试品溶液的方法，在6.1的色谱条件下测定，记录峰面积，并计算含量，测得两种指标性成分山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯的RSD值分别为（），（），表明该方法重复性好。6.7稳定性考察取同一份供试品溶液，按6.1的色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24h测定，测得指标性成分山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯的RSD值分别为，表明独一味的供试品溶液在室温24h内稳定。6.8加样回收率实验精密称取独一味粉末约0.25g，平行6份，精密称定。分别依次加入（%）甲醇配置的对照品溶液适量，按供试品溶液的制备方法进行制备，精密吸取溶液10μL注入高效液相色谱仪，按6.1项下的色谱条件测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果山栀苷甲酯和8-0-乙酰山栀苷甲酯的平均加样回收率分别为（n=6）XX、XX、XX~。RSD分别为XX、XX~6.9独一味的含量测定取独一味粉末，按6.3条件下制备供试品溶液，2份，精密吸取供试品溶液10μL注入色谱仪，按6.1下的色谱方法测定，用外标法计算独一味中2中成分的含量，结果见表X、表5独一味中两种成分含量测定结果样品编号山栀苷甲酯8-O-乙酰山栀苷甲酯123456787讨论本实验通过测定4个不同产地独一味中环烯醚