2024凝胶过滤层析结合液相色谱-串联质谱法测定血清中游离甲状腺激素

2024凝胶过滤层析结合液相色谱•串联质谱法测定血清中游离甲状腺

激素

基于凝胶过滤层析(GFC)进行前处理，结合液相色谱-串联质谱

(LC-MS/MS)建立了血清中游离三碘甲腺原氨酸(FT3)和游离甲状腺

素(FT4)的高通量、高灵敏检测新方法。选用SephadexLH-20凝胶

小柱对150pL血清样本进行过滤分离，先用Tris-HCI缓冲液(0.1

mol/L/PH7.4)淋洗去除结合蛋白的甲状腺激素，然后用甲醇对游离的

甲状腺激素进行洗脱，采用LUMS/MS法进行检测和定量，并进行方

法学验证。结果显示：FT3和FT4的线性相关系数(r2)均不小于0.999

5,批内及批间相对标准偏差为1.8%~10%，准确度为85.4%~

110%,基质效应为85.8%~114%,回收率为85.8%~107%。采用

该方法与平衡透析法(ED)同时检测了95份血清样本，使用IBMSPSS

Statistics26和MedCalc统计软件(v.20.0.0)对检测结果进行配对t

检验分析、PassingBablok回归分析和Bland-Altman一致性分析。

结果表明，GFC/LC-MS/MS与ED/LC-MS/MS法对血清中FT3、FT4

的测定结果无统计学差异(P>0.05)。所建立的方法快速、简便，受干

扰因素相对较少，便于临床推广，可为临床实验室游离甲状腺激素的

快速、高效、准确检测提供参考方法，同时为其它游离激素的检测提

供了一种新的思路。

三碘甲腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)和甲状腺素(Thyroxine,

T4)是两种主要的甲状腺激素，其分泌量的增多或减少均可导致甲状

腺功能障碍，并可增加心血管疾病、糖尿病并发症和妊娠并发症的发

生风险。正常情况下，T3、T4分别约99.7%和99.97%与特异的血浆

蛋白相结合，仅有0.3%和0.03%为游离状态，简称为FT3和FT4。

而游离激素假说认为，甲状腺激素的游离形式才是其活性部分，与生

物效应密切相关。FT3和FT4的测定不受血清结合蛋白的影响，是甲

状腺功能体外实验的灵敏指标，可作为甲亢、甲减、甲状腺肿、重症

感染发热等疾病的辅助诊断。

由于血清中FT3和FT4临床检测的重要性，50多年来研究者们相

继开发了测定FT3和FT4的不同方法。但由于游离甲状腺激素的浓度

极低，的血液浓度为为〜

FT31.4~6.0pg/mL,FT48.020.0pg/mLe

并且结合态与游离态之间的内源性平衡易受到扰乱，使得其检测结果

的重复性、稳定性较差。因此，临床上准确检测游离甲状腺激素仍然

十分困难，极具挑战性。目前，临床实验室通常通过免疫分析方法或

物理分离方法检测FT3或FT4。通过免疫法间接测定的FT3、FT4含

量易因其动态平衡被破坏而有误。尤其是在妊娠期，由于其结合蛋白

的显著变化和嗜异性抗体的存在，使得免疫测定结果不准确。美国甲

状腺协会建议，在妊娠期测定FT4的最佳检测方法为液相色谱-串联

质谱(LC-MS/MS)法。该法分析灵敏度高、特异性好，已成为国外

检测人血清中FT3、FT4的金标准方法。在结合态与游离态之间的内

源性平衡受干扰最小的情况下，从血清中分离出FT3和FT4是该方法

前处理环节的关键。经过多年的发展与改进，平衡透析和超滤已成为

较为成熟和完善的物理分离技术，然而这两种方法均因其自身的局限

性，尚未推广到大多数临床实验室。

凝胶过滤层析（GFC）,利用分子筛作用和选择性洗脱，可以实现

蛋白结合态和游离态的快速分离，加之凝胶载体的惰性高、吸附力弱，

能够减小对内源性平衡的干扰。1979年，Romelli等将凝胶过滤层析

用于游离甲状腺激素测定，证实了该方法不会显著改变血清中的游离

激素水平。在此基础上，本研究拟采用GFC技术，通过进一步优化，

减少样本量，简化操作步骤，建立可靠的快速前处理方法，实现高通

量样本检测，使其适用于临床检测实验室。在此基础上，基于

LC-MS/MS技术建立高灵敏检测方法，以实现临床游离甲状腺激素的

高灵敏、稳定、快速检测，为甲状腺激素临床相关疾病的诊断、预防、

治疗、预后和监测等提供支撑。

1实验部分仪器与装置

LCMS-8050CL岛津液相色谱三重四极杆质谱仪（日本Shimadzu

公司）;PCWJ-10超纯水机（成都品成科技有限公司）；涡旋混匀仪

（金坛区白塔新宝仪器厂）；QB-800296孔板混匀仪（海门市其林

贝尔仪器制造有限公司）；BT25S型十万分之一电子天平（德国

Sartorius公司）；BCY960296孑L正压装置、BCN960296孑L氮吹仪

（深圳逗点生物技术有限公司）；FiveEasyPlusFE28pH计（上海

梅特勒-托利多仪器有限公司）；平衡透析装置（北京汇智和源生物技

术有限公司）。

1.2试剂与材料

甲醇、甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；超纯水（杭州娃哈哈

公司）；氢氧化钠（分析纯，成都金山化学试剂有限公司）；磷酸二

氢钠二水合物和三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCI）（上海阿

拉丁生化科技股份有限公司）；无水磷酸氢二钠（分析纯，上海迈瑞

尔化学技术有限公司）；Proclin300抑菌剂、羟乙基淀粉和牛血清白

蛋白（上海源叶科技有限公司）；表面活性剂TritonX-100（上海毕

得医药科技股份有限公司）；纳他霉素（上海麦克林生化科技有限公

司）；氯化钠（成都市科龙化工试剂厂）；SephadexLH-2096孔过

滤板、96孔提取板、96孔收集板、96孔进样板（纳谱分析技术（苏

州）有限公司）。

1.3样品

T3标准品（98%,批号：21A043-C3,上海甄准生物科技有限公

司）；T4标准品（98%,批号：21A034-F6,上海甄准生物科技有限

公司）；T3内标（T3-13C12,同位素丰度为99.3%,纯度为94.2%,

批号：PR-30090，青岛腾龙微波科技有限公司）；T4内标（T4-13C6,

同位素丰度＞99%，纯度＞98%,批号：22T021-T2,上海甄准

生物科技有限公司）o血清样品均来自淄博市中医医院的剩余样本，

样本的收集及使用已取得医院伦理委员会批准。

1.4标准溶液和内标溶液的配制

分别准确称取T3、T4标准品各10.0mg,用5%氨水-甲醇溶解，

并定容于10mL棕色容量瓶，分别配制得到质量浓度为1.0mg/mL

的T3、T4标准储备溶液。用30%甲醇水稀释标准储备溶液，配制得

到质量浓度分别为2、4、10、20、50、100、150、200pg/mL的

系列标准工作溶液。将内标储备溶液用30%甲醇水稀释，配制得到

T3-13C12、T4・13C6质量浓度均为200pg/mL的混合内标工作溶液。

1.5质控品的制备

准确吸取50|1LProclin300、50RL0.1mg/mL纳他霉素、50|1L

TritonX-100,称取0.9g氯化钠、5.0g羟乙基淀粉、5.0g牛血清

白蛋白，搅拌至完全在纯水中溶解后，使月超纯水稀释至100mL。

使用0.45滤膜对稀释后的溶液进行过滤，收集滤液，得到空白基

质。将不同质量浓度的T3、T4混合标准溶液添加到空白基质中，配

制得到低、中、高质量浓度(分别为10、50、150pg/mL)的质控

品。

1.6样品前处理

SephadexLH-20凝胶小柱预处理：依次使用2mL20%乙醇水、

2mL超纯水进行活化，再用4mL磷酸盐缓冲液(PB,0.1mol/L,

pH7.4)进行平衡，取150HL血清加载至经预处理的Sephadex

LH-20凝胶小柱，正压装置压入填料内，依次用4mLTris-HCI缓冲

液(0.1mol/L,pH7.4)、150匹甲醇进行洗涤，以去除结合蛋白

的甲状腺激素，弃去洗涤液。然后用1.5mL甲醇对游离的甲状腺激

素进行洗脱，收集洗脱液，于室温下氮气吹干，加入150|1L混合内

标工作溶液，振荡混匀2min,待分析。

1.7分析条件

1.7.1色谱条件

Shim-packVeloxSP-C18色谱柱（2.1mmx50mm,1.8pm）;

流动相：A相为0.002%甲酸水溶液流相为甲醇;流速:0.3mL/min;

柱温:45℃;进样量:30同；梯度洗脱：0〜0.5min,30%B;0.5〜5

min,30%〜98%B;5-7min,98%B;7.01〜9min,98%〜30%Bo

1.7.2质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）;数据扫描方式：正离子模式；测

定方式：多反应监测（MRM）模式；脱溶剂气温度：600℃;加热

块温度：400℃;接口电压：4.0kV;雾化气流速：3.0L/min;干

燥气流速：5.0L/min;加热气流速：15.0L/min。各目标物的保留时

间、MRM监测离子对、碰撞电压等参数见表1。

表1各化合物的保留时间与MRM质谓参数

QuantitationQualitalion

.\nalytcKctcntiontiirc/min-

Ion|>air(mlz)Qillisionrnrrg)ArIonpair(mlz)Collisionrnrrg)7V

T33.25651.6/605.8-22651.6/478.9-36

T3-“C”3.25663.7/617.8-22663.7/490.9-36

T43.66777.4/731.7-23777.4/604.7-40

T4」'C,3.66783.5/737.7-26783.5/610.7-40

2结果与讨论

2.1分析条件的优化

2.1.1质谱参数的优化

由于竣基和氨基的存在，甲状腺激素可在正电离模式和负电离模式

下检测，但实验发现T3、T4在ESI正离子采集模式下的灵敏度更高。

将T3、T<T3-13C12,T4-13C6标准溶液进行Q1母离子扫描分析，

扫描范围为m/z100-1000。分别调整脱溶剂气温度、接口电压、加

热块温度、雾化气流速、干燥气流速、加热气流速等参数，使母离子

响应增强，噪音降低。经过优化，T3、T4、T3-13C12.T4-13C6产

生的Q1信号最高，以稳定的[M+H]+为母离子，m/z分别为651.6、

777.4、663.7、783.5。根据前体离子进行产物离子的自动优化，选

择离子丰度高、干扰小且稳定的子离子作为定量离子，次强的作为定

性离子。最佳的质谱参数如〃172〃所示。

2.1.2色谱条件的优化

考察了WatersXBridgePhenyl(2.1mmx50mm,5pm)、

Shim-packGISSC18(2.1mmx50mm,1.9pm)、Shim-pack

VeloxSP-C18(2.1mmx50mm,1.8pm)3种色谱柱对目标化合

物的分离效果。结果表明,Shim-packVeloxSP-C18色谱柱对目标

化合物的信号响应更高，峰形更好，因此选择该色谱柱进行样品分离。

分别考察了纯水、甲酸水(0.1%、0.05%、0.02%、0.01%.0.005%、

0.002%）、氨水（0.1%、0.01%、0.002%）、0.002%乙酸水、0.1%

甲酸+2mmol/L乙酸镀■水溶液作为流动相A,甲醇、乙睛、50%甲

醇•乙睛、0.1%甲酸+2mmol/L乙酸锭一甲醇溶液作为流动相B时待

测物的响应强度，最终选择0.002%甲酸水溶液和甲醇作为流动相。

经梯度优化，使得样品中T3及其同分异构体反三碘甲腺原氨酸（rT3）

和T4具有良好的分离效果（见图1）。

3-

-n-"C,2：663.7/617.8

TVrT3：'651.6/605.8

-13/rT3:651.6/478.9

2

0一

>

-5u

±

=

1-

0

2.53.03.54.04.52.53.0354.04.5

i/minl/min

图1T3.rT3和T4的MRM色谱图（A）与局部放大图（B）

2.2前处理条件的优化

2.2.1尺寸排阻填料及填料量的优化

考察了羟丙基葡聚糖凝胶SephadexLH-20.葡聚糖凝胶Sepha­

dexG-25、大孔树脂TOYOPEARLHW-40F、硅胶微球BioCore

SEC-150的分离性能。将凝胶溶胀,湿法装柱，SPE凝胶小柱经过活

化、平衡、上样、淋洗（1~8管，用缓冲液洗去蛋白结合态）、洗脱

（9~16管，用甲醇洗脱游离态），每管收集0.5mL,分别进行检测,

并将血清样品与标样的检测结果进行比对。以FT4为例，如图2A所

示，根据结合态与游离态的分段情况，最终选用羟丙基葡聚糖凝胶

Sepha-dexLH-20o

LH-2O

（；-25

HW-40E

SEC-150

Killer<|iianlily/mg

图2填料种类（A）和填料量（B）的优化结果

进一步考察了SephadexLH-20填料量分别为5、10、15、20、

30、40、60、100、150mg时的分离效果。如图2B所示，当填料

量在5~40mg之间时，分离得到的FT3、FT4趋于稳定;而当填料

量大于40mg时,分离得到的FT3、FT4明显增多,说明部分与蛋白

结合的T3、T4发生了解离。因此，选用SephadexLH-20填料量为

15mg,此时FT3、FT4的提取分离效果最好。

2.2.2孵育时间及血清稀释倍数的优化

为模拟体内平衡过程，考察了在37℃T，孵育时间分别为0、0.5、

1、1.5、2h的影响。结果显示，随着孵育时间的延长,分离得到的

FT3、FT4含量增多,因此选择不孵育。进一步考察了血清稀释倍数

分别为0、0.5、1、1.5、2倍的影响，结果表明，随着血清稀释倍数

的增加，分离得到的FT3、FT4含量增多，因此选择不稀释。

2.2.3淋洗液的优化

淋洗液主要用于洗去结合蛋白，一般用水或缓冲液。考察了

Tris-HCI缓冲液(0.1mol/L,pH7.4)、PB缓冲液(0.1

mol/LzpH7.4)、0.9%NaCI水溶液、超纯水、PBS缓冲液(0.1mol/L,

pH

7.4)、HEPES缓冲液(pH7.4)的淋洗效果。图3A结果显示Jris-HCI

缓冲液、PB缓冲液、0.9%NaCI水溶液、HEPES缓冲液的淋洗效果

相近，考虑到溶液配制过程以及实验重复性，最终选用淋洗液为

Tris-HCI缓冲液(0.1mol/L,pH7.4)。

(

•

=一W

・

・x

_.

=M

_>

R_

I4O

I_

xA2O

r2

・

EhirnlvohinwVmL

图3淋洗液种类(A)和淋洗液体积(B)的优化结果

考察了Tris-HCI缓冲液(0.1mol/L,pH7.4)体积分别为2、4、

6、8mL时的淋洗效果。如图3B所示，当填料量为15mg,上样量

为150|1L时，淋洗液体积达到4mL以上时提取效果较好，因此选择

淋洗液体积为4mL。

2.3方法学验证

2.3.1线性范围.检出限及定量下限

按〃1.4〃配制系列标准工作溶液，浓度从低到高依次进行检测，每

个浓度水平测定3次。通过LabSolutionsVer.5.60软件进行数据处

理，以标准溶液的质量浓度为X轴，标准品和内标的峰面积比值为Y

轴，进行线性回归分析。结果显示，FT3、FT4分别在2-200pg/mL、

4-200pg/mL范围内呈良好线性关系，相关系数（r2）分别为0.999

9、0.9995。

将不同质量浓度的T3、T4混合标准溶液添加到空白基质中，配制

得到质量浓度分别为8、4、2、1pg/mL的样品,按〃1.6〃方法前处理

后进行检测。分别以信噪比S/N>3和S/N>10确定方法的检出限

（LOD）和定量下限（LOQ），得到FT3、FT4的检出限分别为1、2

pg/mL,定量下限分别为2、4pg/mLo

2.3.2基质效应

基质效应（ME）一般通过比较目标物在样品基质和空白溶剂中的

信号响应进行评价。取6个不同人体的血清样品按“1.6〃方法进行提取

后，分别添加低、中、高浓度（10、50、150pg/mL）的混合标准溶

液，每个浓度水平平行制备3份，将上述样品和标准溶液进行质谱测

定。参照文献方法进行计算，一般认为ME在85%〜115%范围时，

没有明显的基质效应影响。结果显示，FT3、FT4在低、中、高浓度

的基质效应为85.8%~114%,说明没有明显的基质效应。

2.3.3回收率

按〃1.5〃方法制备得到低、中、高浓度的质控样品，每个浓度平行

制备3份，按〃1.6〃方法前处理后上机检测;同时将相同浓度的T3、

T4混合标准溶液上机检测。通过比较质控样品与标准溶液的测定值，

计算得到FT3和FT4的回收率分别为85.8%~103%和89.7%~107%。

2.3.4准确度与精密度

按〃1.5〃方法配制低、中、高3个浓度水平的质控样品，每个浓度

平行制备6份，按〃1.6〃方法前处理后上机检测，得到批内准确度及批

内相对标准偏差（RSD）。通过3个分析批连续三天进行检测，得到

批间准确度及批间RSD。结果显示：FT3和FT4的批内和批间RSD

分别为3.4%~10%和1.8%~8.8%,批内和批间准确度分别为

85.4%~110%和89.1%~102%。

2.4方法对比

将建立的凝胶过滤层析法（GFC）与平衡透析法（ED）同时用于

95例血清样本的检测。按〃1.6〃方法和ED方法（参照CLSIC45-A

指导文件）分别对血样进行前处理，然后按〃1.7〃仪器条件进行检测。

使用IBMSPSSS