无创胚胎植入前非整倍体检测技术的研究进展及展望

无创胚胎植入前非整倍体检测技术的研究进展及展望胚胎植入前非整倍体检测(preimplantationgenetictestingforaneuploidies,PGT-A)技术是目前高龄(年龄≥35岁)、反复的胚胎染色体检测以及胚胎质量评估方法引起了生殖医学工作者的DNA,cfDNA)在无创胚胎植入前非整倍体检测(non-invasivepreimplantationgenetictes中的研究进展及其存在缺陷，并提出应用单分子纳米孔技术检测cfDNA进行niPGT-A的创新性猜想，为niPGT-A技术的进一步研究提胚胎植入前非整倍体检测(preimplantationgenetictestingforaneuploidies,PGT-A)是一种检测体外受精产生的胚胎中染色高龄(年龄≥35岁)、反复种植失败、复发性流产患者提高胚胎种但该操作为有创检查，是否会对胚胎的后续发育造成潜在威胁及其远期影响尚需进一步验证。寻找无创、安全、准确有效的胚胎染色体检测以及胚胎质量评估方法给生殖医学工作者带来了挑战。随着二代测序(next-generationsequencing,NGS)技术的发展与胚胎发育时释放的游离DNA(cell-freeDNA,cfDNA)的发现，通过NGS技术检测cfDNA反映胚胎染色体整倍性，实现了无创PGT-A(non-invasivePGT-A,niPGT-A)。然而，其检测结果的准确性受到众多因素的影响，在临床广泛应用尚被制约。本文概述了近年来通过NGS检测cfDNA在niPGT-A中的研究进展及其存在缺陷，并提出应用单分子纳米孔技术检测cfDNA进行niPGT-A的创新性猜想，为niPGT-A技术的进一步研究提供新的思路niPGT-A是辅助生殖技术的重要革新，近年来在临床研究及应用中展现出了显著的发展潜力。相较于传统PGT-A需要进行侵入性活检操作，niPGT-A的检测材料为囊胚培养液中的cfDNA,可以在避免胚胎损伤风险的同时实现染色体非整倍体筛查。将17对夫妇共42个胚胎培养液进行检测，检测结果与相应全胚胎染色体倍性信息进行比较，发现染色体拷贝数变异检测的成功率可达到100%,与TE细胞染色体整倍体的结果相比一致率达到了85.7%,计算得到灵敏度及特异度分别可达88.2%和84.0%。得到验证后，作者对7对染色体易位平衡或复发性流产的夫妇进行了niPGT-A,选择染其中5对已经实现了健康的活产。该研究展现出的高扩增率与高一致性，使得niPGT-A在临床应用上更具意义。2020年Franco等[2]报道了第一例基于niPGT-A获得活产的巴西女婴，同样提出niPGT-A等[3]对52枚囊胚进行niPGT-A并与TE活检进行对比，研究显示niPGT-A在胚胎倍性和染色体拷贝数的一致率方面均高于TE活检。这些研究结果均提示niPGT-A在辅助生殖技术的临床应用中具有可观前景。Metais[4]便在血液循环中发现了cfDNA的存在，1997年首次证实孕妇血浆中存在胎儿cfDNA,开启了无创产前筛查(non-invasiveprenataltesting,NIPT)新纪元。如今2013年，Stigliani等[5]首次证明了废弃胚胎培养液(spent (mitochondrialDNA,mtDNA),与优质胚胎样本相比Hammond等[6]的研究显示，暴露于胚胎后的培养基中cfDNA含量常发育过程中的凋亡细胞，作为非整倍体的校正机制存在。然而Vera-Rodriguez等[7]则观察到非整倍体和整倍体胚胎的培养基中ICM)的整倍体和非整倍体细胞凋亡，整倍体细胞凋亡的非整倍体细胞，且ICM细胞发生凋亡的比例较TE更高。Gleicher等[8]对此研究提出了质疑，认为TE与培养基直接接触，为整倍体，故无法确认最终核型，使得假阳性率偏高。对此等[9]的团队做出回应，认为减数分裂导致的非整倍体不太可能通最多为40%,此外，通过对嵌合体小鼠胚胎的观察发现ICM中非整倍体细胞的凋亡频率是TE中非整倍体细胞的10倍，由此可推断PGT-A在TE活检中出现假阳性最可能的解释是嵌合体，而非自我校正， [10]通过测序分析培养液中cfDNA的甲基化特征与卵丘细胞或颗粒和TE共同衍生而来，但同时存在来自极体、精子、颗粒细胞DNA的污染。Domingo-Muelas等[11]通过小鼠和人囊胚的活体成像可视1.母源性DNA污染：Xu等[1]研究报道母源性的卵丘-放射冠细胞(具有正常染色体组成)若去除不彻底，残留细胞可能会在胚胎发育过程中释放DNA,导致假阴性结果。Hammond等[6]提出了相同观点。在Vera-Rodriguez等[7]的研究中，母源DNA污染的样本高约占1/3,而卵丘细胞污染较极体更多，约占样本的1/2。 (存在于Y染色体上)和TBC1D3(位于7号染色体上)的比率表明3.胚胎培养液滴体积的影响：Minasi等[13]的研究证实了培5天，小体积(7μL)培养液滴的囊胚形成率显著高于大体积(35μ [14]同样提出第4天更换培养基，丢弃第1~3天分泌的潜在降解的DNA,使用体积10μL培养液滴，替代较常使用的30μL培养液滴。Ho等[15]使用25μL培养液滴进行胚胎培养，研究显示与TE活检相比，第3天的SCM中cfDNA的倍性一致率为56.3%,第5天为45.5%。Yin等[16]同样使用了25μL培养液滴进行胚胎培养，研发育迟缓或阻滞[13]。因此，寻求一个最能平衡自分泌因子有益作用和毒性代谢产物负面影响的培养液滴体积至关重要。此外，Jiao等[17]认为小体积培养液滴(12μL)可以在全基因组扩增(whole更高的cfDNA浓度，更有利于扩增。目前，已有多项研究使用10~15[14,17]。然而最佳培养液滴体积尚未明确，仍需进一步探索。4.cfDNA样本收集时间的影响：Yeung等[18]通过分析168份SCM样本，提出SCM可以从第4天到第5天的较窄生长期收集，以提高倍性一致性，因为在第4天将胚胎移至新鲜培养基中，并在第5天等[14]通过分析1301枚囊胚，提出胚胎cfDNA和TE活检的一致率在第6、第7天时较第5天显著更好。Hanson等[19]的研究表明，胚胎与培养基的接触时间与DNA扩增失败率呈负相关(接触1dDNA扩增失败率为96.2%;2d为42.9%;3d进一步下降至15.2%;4d后全部样本均未出现扩增失败)。为研究分析。胚胎中存在多个细胞系的现象，最常见的嵌合体分为3类：无序嵌合体、非整倍体嵌合体和二倍体-非整倍体嵌合体。无序嵌合体指细胞常细胞系和不同的非整倍体互补共存于同一胚胎中的现象；二倍体-非整倍体嵌合体描述的嵌合体类型仅涉及分析的一条染色体的三体和(或)单体[21]。根据国际胚胎植入前遗传诊断学会2021声明，嵌合率低于20%的胚胎可以被认为是整倍体(可移植),而异常细胞超过80%的胚胎被归类为非整倍体，其余(20%~80%)可归为嵌合体 [22]。人类胚胎在发育的早期着床前阶段，嵌合现象十分普遍，出现在20%~30%,甚至50%的胚胎中；然而，在妊娠的后期，嵌合体率似乎急剧下降，据估计，真正的嵌合体胎儿仅在约0.4%的胎儿中流行，活产中的嵌合体约<0.2%。若嵌合阈值设置不当，可能会导致假致妊娠失败甚至出现畸形胎儿[21,23]。Huang等[3]提出将嵌合阈值设置为60.0%时niPGT可获得最低假阳性率和假阴性率。目前成测序(sequencingbysynthesis,SBS)、连接测序和离析。第二代短读长平台的读长范围为35~600bp。DNA模板制备的初从一端(单端读段)或从两端(双端读段)进行PCR扩增，产生数百由的3'-OH,并与仪器上的数据检测相结合。这种扩增为每个模板配到特定的模板，获得DNA信息[24-26]。目前，已初步实现了应用NGS检测cfDNA进行niPGT,然而NGS具有较高的假阳性率[25,27]。通常，在进行NGS之前，cfDNA还决策需求。条单链DNA(single-strandedDNA,ssDNA)随后穿过纳米孔的纳米级通道(即管腔)。由于不同DNA碱基对电流阻碍程度存在差异，因纳米孔随机准备穿过另一个ssDNA分子进行新的测序[28-30]。(<500bp),但通过技术优化仍可发挥长读长优势，如使用长片段使用便捷[29-30]。产生独特的电信号[31]。多项