《仪器分析教程》教学课件-第10章-高效液相色谱法

2025/12/22仪器分析教程

第10章高效液相色谱法10.1概述HighPerformanceLiquidChromatography（HPLC)10.1.1HPLC的特点10.1.2HPLC与GC的比较2025/12/2210.1概述高压高速高效高灵敏度应用范围广10.1.1HPLC的特点高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2025/12/2210.1概述10.1.2HPLC与GC的比较1.相同点①液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度分离度、选择性等与气相色谱一致。②液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。2025/12/2210.1概述10.1.2HPLC与GC的比较2.不同点由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：2025/12/2210.1概述10.1.2HPLC与GC的比较2.不同点

①流动相

HPLC：液体（载液），会与样品发生相互作用；GC：气体（载气），与样品呈惰性。②固定相

HPLC：种类较少，仅十几种，分离选择性在很大程度上要通过选用不同的流动相来改变。

GC：种类较多，数百种，分离选择性主要通过选用不同的固定相来改变。

2025/12/2210.1概述10.1.2HPLC与GC的比较2.不同点

③分析对象

HPLC：受样品挥发度和热稳定性的限制，非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70～80%。GC：能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；2025/12/2210.1概述10.1.2HPLC与GC的比较2.不同点

④分离温度HPLC：通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择GC：一般在高于室温下分离，最高可达300～400℃左右。⑤色谱柱

HPLC:柱较短较细

GC：柱较长较粗

2025/12/2210.1概述10.1.2HPLC与GC的比较2.不同点

⑥流动相驱动力HPLC：采用高压泵GC：高压载气。

3.优点与不足液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。2025/12/22仪器分析教程10.2概述10.2.1高压输液系统10.2.2进样系统10.2.3分离系统10.2.4检测系统2025/12/2210.2高效液相色谱仪液相色谱仪器2025/12/2210.2高效液相色谱仪液相色谱仪器2025/12/2210.2高效液相色谱仪液相色谱仪器2025/12/2210.2高效液相色谱仪液相色谱仪器2025/12/2210.2高效液相色谱仪2025/12/2210.2高效液相色谱仪高效液相色谱仪主要由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测和记录系统四大部分组成。

HPLC流程示意图

2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.1高压输液泵HPLC主要部件之一，为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。高压输液泵主要由贮液器、高压泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.1高压输液泵（1）贮液器

一般由玻璃、不锈钢或聚四氟乙烯制成，容量为1～2L。贮液器应带有脱气装置。2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.1高压输液泵（2）高压泵一般要求泵的输出压力高达15～50Mpa。

①恒压泵：输出的压力恒定，而流量则随色谱系统阻力的变化而变化，不适于梯度洗脱，

②恒流泵：在一定的操作条件下，输出的流量恒定，柱阻力或流动相黏度改变只引起柱前压力的变化，特别适合梯度洗脱。

2025/12/2210.2高效液相色谱仪外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。10.2.1高压输液泵（3）梯度洗脱装置2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.1高压输液泵梯度洗脱装置示意图2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.2进样系统

（1）注射器进样2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.2进样系统

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：（2）六通阀进样2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.2进样系统（3）自动进样器可自动进样、适合大量样品的分析、实现自动化。2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.3分离系统

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.4检测系统

1.紫外检测器原理：基于待测组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系服从比耳定律。

特点：灵敏度高；线形范围高；流通池很小（容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。应用最广，对大部分有机化合物有响应。2025/12/2210.2高效液相色谱仪

紫外检测器的重要进展：

光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.4检测系统

2.荧光检测器

高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.4检测系统

3.电导检测器原理：基于被测组分的导电能力的不同，它对温度和载液流速较敏感，是离子交换色谱中使用最广泛的检测器。2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.4检测系统

4.示差折光检测器原理：基于被测组分和流动相的折光率的不同，特点：该检测器为通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数），是除紫外检测器之外应用最多的检测器。其灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱类型：偏转式、反射式和干涉型三种。2025/12/2210.2高效液相色谱仪10.2.4检测系统

4.示差折光检测器类型：偏转式、反射式和干涉型三种。2025/12/22仪器分析教程10.3液相色谱速率理论10.3.1涡流扩散10.3.2分子扩散10.3.3固定相传质阻力10.3.4流动相传质阻力10.3.5提高柱效的方法2025/12/2210.3液相色谱速率理论

HPLC的理论基础与GC相似，但它们的流动相不同。前者为液体、后者为气体，二者流动相的性质有明显的差别，液体的扩散系数只有气体的万分之一至十万分之一，液体的粘度比气体大一百倍，而密度为气体的一千倍左右。以上差别将影响组分在色谱两相中的扩散和传质运动，进而影响色谱的分离分析过程，因此，在描述两种色谱的速率理论时会有所不同。2025/12/2210.3液相色谱速率理论

由Giddings、Snyder等人提出的液相色谱速率理论方程如下：Hed

：涡流扩散项；

Hid-分子扩散项；Hm-流动相传质阻力项；Hsp-固定相传质阻力项。

2025/12/2210.3液相色谱速率理论1.涡流扩散项减小固定相粒度、柱子填充均匀，均有利于提高柱效。式中，dp

：固定相的平均颗粒直径，

λ

：固定相的填充不规则因子。2025/12/2210.3液相色谱速率理论2.分子扩散项式中，

Cd：填充系数；

Dm：组分在流动相中的扩散系数

当载液流动的线速度μ>0.5cm/s时，Hid项通常可以忽略不计

2025/12/2210.3液相色谱速率理论3.固定相传质阻力项

改善传质，加快溶质分子在固定相上的解吸过程可解决由固定相传质所引起的峰扩展。式中：df：固定液的液膜厚度；

Ds：试样分子在固定液内的扩散系数；

Cs：与分配比k有关的系数。2025/12/2210.3液相色谱速率理论4.流动相传质阻力项

①流动相流动区域内的传质阻力项Hm

②在流动相滞留区内的传质阻力项Hsm

2025/12/2210.3液相色谱速率理论5.提高柱效的方法1.采用粒度小而均匀、孔穴较浅的固定相担体，这是提高液相色谱柱效最有效的途径；2.采用低粘度溶剂作流动相，以减小在柱内的流动阻力；3.适当降低流动相流速；4.适当提高柱温，以降低流动相粘度，增大扩散系数。5.尽量减小连接管、检测器流通池死体积。

2025/12/22仪器分析教程10.4高效液相色谱法的分类10.4.1液-液分配色谱法10.4.2液-固色谱法10.4.3离子交换色谱法10.4.4空间排阻色谱法2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

根据分离机理不同，高效液相色谱法分为液—液分配色谱法、液—固吸附色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法、离子色谱法和空间排阻色谱法等。10.4.1液—液分配色谱法（Liquid—liquidpartitionchromatography）固定相与流动相均为液体（互不相溶）。1.基本原理组分在固定相和流动相上的分配，分离顺序取决于分配系数的大小，分配系数K（或分配比k）大的组分，保留值大，后出柱。2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

10.4.1液—液分配色谱法（Liquid—liquidpartitionchromatography）（1）正相液—液色谱法

固定液极性大于流动相极性的色谱法。

应用：分离极性较强的化合物，如脂肪酸、甾醇类、类脂化合物磷脂类化合物等有机物。

根据固定液和流动相的极性不同：

（2）反相液—液色谱法固定液极性小于流动相极性的色谱法。应用：是目前应用的最多最有效的液相色谱法。适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等非极性或弱极性化合物。2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类10.4.1液—液分配色谱法（Liquid—liquidpartitionchromatography）2.液—液分配色谱固定相

早期为在全多孔型担体或表面多孔性担体上涂渍固定液，固定液流失，较少采用。现多采用化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。如：硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C、硅氧碳键型：≡Si—O—C等。2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

10.4.1液—液分配色谱法2.液—液分配色谱固定相

（1）传质快；（2）寿命长，稳定性好；

（4）选择性好，可键合不同官能团；（5）有利于梯度洗脱。化学键合固定相的特点：2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

10.4.1液—液分配色谱法（Liquid—liquidpartitionchromatography）3.液—液分配色谱流动相

由洗脱剂和调节剂两部分组成。前者的作用是将试样溶解和分离；后者则用以调节前者的极性和强度，以改变组分在柱中的移动速度和分离状态。对流动相的要求：①对试样有适当的溶解度，以防在柱头产生沉淀；②与固定相不互溶，不与试样发生化学反应；③与所用检测器相匹配；④粘度应较小，以获得较高的柱效；⑤纯度高，毒性小，价格便宜，不污染环境和腐蚀仪器。2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

10.4.1液—液分配色谱法（Liquid—liquidpartitionchromatography）4.应用

液—液色谱法对极性化合物和非极性化合物都能达到满意的分离效果。例如，Permaphase—ODS键合相反相液—液色谱对稠环芳烃完成了很好的分离。

2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

10.4.2液—固吸附色谱法（Liquid-solidadsorptionchromatography）1.分离原理组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；利用吸附剂对溶剂和各组分分子的吸附能力不同得以分离。

2.固定相

为固体吸附剂，极性：如硅胶、氧化铝等，非极性：活性炭等。较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

10.4.2液—固吸附色谱法（Liquid-solidadsorptionchromatography）3.流动相各种不同极性的一元溶剂或按一定比例混合的多元溶剂。4.应用

不同类型的有机化合物及几何异构体的分离分析。如，有机氯农药的分析。

2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

10.4.3离子交换色谱法（Ion-exchangechromatography

）1.分离原理组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长。阴离子交换：

阳离子交换：

2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

10.4.3离子交换色谱法（Ion-exchangechromatography

）2.固定相阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂。2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

10.4.3离子交换色谱法（Ion-exchangechromatography）3.流动相阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液。分离离子或可离解的化合物，常用于无机离子和生物物质的分离，例如碱金属、碱土金属、稀土金属等金属离子混合物的分离，；食品添加剂及污染物的分析；氨基酸、蛋白质、糖类、核糖核酸、药物等样品的分离。4.应用2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

10.4.4空间排阻色谱法（Stericexclusionchromatography）1.分离原理按组分分子的尺寸大小和形状的差别进行分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；

2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

10.4.4空间排阻色谱法（Stericexclusionchromatography）2.固定相凝胶(具有一定大小孔隙分布)。（1）软质凝胶适用于常压下低流速的分离与分析。（2）半硬质凝胶目前应用最多，适用于非极性有机流动相。（3）硬质凝胶流动相可为水或非水溶剂，适应于较高流速下工作。2025/12/2210.4高效液相色谱法的分类

10.4.4空间排阻色谱法（Stericexclusionchromatography）3.固定相空间排阻色谱中，选择流动相不是为了控制分离，而仅仅是作为试样的载体。常用的流动相有四氢呋喃、十氢化萘、氯仿、二甲基甲酰胺和水等。4.应用主要用于分离相对分子质量在2×103～2×106之间的生物大分子和高聚物。以及测定其相对分子质量的分布（分级）状况间）等，

2025/12/22仪器分析教程10.5高效液相色谱分析方法的建立及分析方法

10.5.1HPLC分析方法的建立10.5.2HPLC定性定量方法2025/12/2210.5HPLC分析方法的建立及分析方法10.5.1HPLC分析方法的建立1.了解样品信息和分析目的

样品的大体组成、浓度范围、组分的物理性质和紫外光谱图及分析目的。

2.样品预处理称重、稀释；液液萃取、液固萃取、提取，蒸馏等

2025/12/2210.5HPLC分析方法的建立及分析方法10.5.1HPLC分析方法的建立3.选择合适的分析方法

原则：一般根据试样的相对分子质量大小，溶解度及分子结构等进行分离方法初步选择。2025/12/2210.5HPLC分析方法的建立及分析方法10.5.1HPLC分析方法的建立4.样品的检测根据被测化合物性质选择适当的检测器。如：紫外检测器一般检测含有共轭不饱和键的化合物。5.HPLC的注意事项①流动相要清洁；②应对样品进行净化预处理；③样品进样量适当；④控制好pH值范围（一般2-8）；⑤选择适当的缓冲溶液；⑥控制好系统的压力（一般＜15Mpa);⑦经常清洗色谱柱。

2025/12/2210.5HPLC分析方法的建立及分析方法10.5.2HPLC定性定量方法1.HPLC定性方法①GC的定性方法基本上都可用于HPLC②利用HPLC检测器的选择性进行定性③利用反相色谱中的“a，C”指数定性

反相色谱中有机调节剂的浓度c与待测组分的分配比k之间满足对数线性关系，可表示为：某一组分的a，C指数与某已知标样相同，即可认定两者为同一种化合物

2025/12/2210.5HPLC分析方法的建立及分析方法10.5.2HPLC定性定量方法1.HPLC定量方法①GC的定量方法基本都可用于HPLC②标准加入法③痕量组采用峰高定量法

废水样品中五氯苯（PCP）的分析

2025/12/22仪器分析教程10.6高效毛细管电泳

10.6.1HPCE的装置10.6.2HPCE的分离原理10.6.3HPCE的特点10.6.4HPCE的分离模式2025/12/2210.6高效毛细管电泳

电泳：带电粒子在外电场的作用下，向与其所带电荷相反的电极迁移的现象。速度ν电泳

电渗流现象：玻璃表面存在硅羟基,pH>3时,形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。

2025/12/22

10.6高效毛细管电泳1.经典电泳分离法电泳法：利用电泳现象对物质进行分离分析的方法。所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。

2025/12/222.高效毛细管电泳高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：

一是采用了0.05mm内径的毛细管；二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。

10.6高效毛细管电泳2025/12/2210.6高效毛细管电泳

10.6.1HPCE的装置HPCE的基本装置为：高压电源、毛细管柱、进样系统、检测器、两个贮液器和控制及数据处理系统。其仪器装置下图所示。2025/12/2210.6高效毛细管电泳

10.6.1HPCE的装置1.高压电源一般为30kV，电流为200～300μA，稳定、连续可调的直流电源，具有恒压、恒流和恒功率输出。

2.毛细管柱

柱长度一般为10～100cm、内径为25～100μm，最常用的是50μm。常用的毛细管为用高纯石英拉制的圆柱形毛细管。

2025/12/2210.6高效毛细管电泳

10.6.1HPCE的装置3.进样系统nL级进样

（1）压差法进样靠虹吸作用将试样吸入

（2）电动进样简单，易于实现自动化4.检测器紫外或激光诱导荧光检测器（可检测到：10-19～10-21mol·L-1）2025/12/22高效毛细管电泳仪器（1）10.6高效毛细管电泳2025/12/2210.6高效毛细管电泳高效毛细管电泳仪器（2）2025/12/2210.6高效毛细管电泳高效毛细管电泳仪器（3）2025/12/2210.6高效毛细管电泳

10.6.2分离原理电场作用下，柱中出现电泳现象和电渗流现象。

带电粒子的迁移速度等于电泳和电渗流两种速度的矢量和。

正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；

中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；

阴离子：两种效应的运动方向相反，ν电渗流>ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。2025/12/2210.6高效毛细管电泳10.6.3毛细管电泳的特点

高灵敏度：可检测出低至10-21

mol/L浓度的物质。高分离效率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子;4分钟内将碱金属和镧系元素的24种阳离子完全分离。试样用量少：仅需几nL（10-9L）的试样仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。2025/12/2210.6高效毛细管电泳10.6.3毛细管电泳的特点

不足之处：进样不够方便。应用范围相对较窄。分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。2025/12/2210.6高效毛细管电泳10.6.4毛细管电泳的特点分离模式

按照毛细管内的分离介质和分离原理的不同，HPCE目前有以下6种主要的分离模式。

1.毛细管区带电泳（CZE）

最普遍、最基本的一种分离模式。CZE分离是基于各组分的净电荷与其质量比（荷质比）的差异而实现的，其分离介质通常为电解质水溶液，

主要应用于氨基酸、肽、蛋白质、多种离子和带电粒子的分离分析，还可用于对映体拆分和构像分析等。2025/12/2210.6高效毛细管电泳10.6.4毛细管电泳的特点分离模式

2.毛细管凝胶电泳（CGE）将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。2025/12/2210.6高效毛细管电泳

在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作