大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计

大肠杆菌基因组DNA的提取

一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。

1、试验原理

提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠

(SDS)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽

提分别蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质

的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉

蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA(乙二胺四

乙酸二钠)存在的状况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体

系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA

分别；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地

分别出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最终用无水乙醇沉淀DNAo

为获得高纯度DNA,操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB(十

六烷基三乙基溟化钱)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成

复合物，在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓

度到肯定的程度(0.3mol/LNaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可

将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。最终通过乙醇或异丙醛

沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

2、试验试剂与仪器

1)试验材料：大肠杆菌

2)试验试剂:

LB液体培育基，TE溶液，10%SDS,蛋白酶K,5mol/L

NaCl,CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊彝，异丙噂，70%乙醇

3）试验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅

3、溶液配制

1）LB液体培育基：细菌培育用胶化果白陈10g/L,细菌培育用酵母

提取物5g/L,NaCl10g/L,去离子水。

（搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml,

用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃,1.034X105pa高

压下蒸汽灭菌20min.）

2）TE缓冲液:

IMTris溶液（取Tris242.2g,加dd%。至1600ml,加热溶解）

IMtris-HClpH8.0溶液（取IMTris溶液160ml用分析纯盐酸调至

Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml）,力ddH2O定容至200ml,高压灭

菌备用）

TE缓冲液（10mMTris-HClIMmEDTApH=8.0,IMTris-HCl

BufferPH=8.05ml

0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddH2O匀称混

合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）

3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-2CTC备用）

4)CTAB/NaCl溶液：(5%w/v,5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl

溶液中，需加热到65。。使之溶解，然后室温保存)

4、试验方法步骤

1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培育基中，一级培育过夜，以10%的

接种量进行二级培育，培育至对数期(4-6h)o

2、取菌液1.5ml置于离心管中，以5000rpm冷冻离心lmin,弃上清

液

3、加190ulTE悬浮沉淀，并加10ul10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠

4、加入lul蛋白酶K(20mg/ml),混匀，37C保温1小时。

5、加30ul5moi/LNaCl,混匀。

6、加30ulCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min

7、加入3003酚/氯仿/异戊醇抽提(25:24:1),5000rmp离心

lOmin

8、取上清液,加入3003氯仿/异戊醇(24:1)抽提,5000rmp离心

lOmin

9、取上清液，加入3003的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止lOmin,

沉淀DNA,5000rmp离心lOmin

10、加500ul70%乙群洗沉淀，5000rmp离心lOmin

11、弃上清液，待酒精挥发尽后加303TE溶解

12、溶解于20ulTE中，-20℃保存。

二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。

细菌基因组DNA提取试剂盒：

1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒

DP302-0250次420元

2、TaKaRa细菌基囚组DNA小量纯化试剂盒

TaKaRaDV810A50650元

3、Biomiga细菌基因组DNA提取试剂盒

GD2411-01BacterialgDNAkit50次423元

GD2411-02BacterialgDNAkit250次1798元

4、Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒

BSC12S150次400元

BSC12M1100次750元

5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒

D3350-00E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit5210元

D3350-01E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit50980元

D3350-02E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit2003350元

荧光定量PCR试验（标准曲线法）

定量试验是一种实时试验，用于在聚合酶链反应（PCR）的每个扩增

循环期间测定靶核甘酸序列（靶）数量。其中靶可以是DNA、cDNA

或RNAo

【试验原理】

在实时定量试验中，反应是在PCR产物的扩增达到固定荧光水平常

的循环期间时间点来描述的，而不是在固定循环次数后累积的PCR产物

最终数量来描

述。扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光。

在PCR的最初几次循环中，荧光信号没有明显改变。该预定义的

PCR循环范围称为基线。首先，软件通过计算归一化报告荧光信号强度

（与基线循环相对应的Rn值）的数学趋势，生成一个基线简化扩增曲

线。然后，算法将搜寻扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度

（deltaRn[ARn]值）与阈值交叉的点。ARn值与阈值交叉的分数循

环定义为CT0

一、试验设计

运用StepOne软件中的DesignWizard（设计导向）创建新试验

1、定义试验属性

在ExperimentProperties（试验属性）屏幕上，输入试验的标识

信息，然后选择要设计的试验类型。

1）ExperimentName（试验名称）。

2）Barcode（条码），然后输入您的PCR反应板上的条码。（可

不填）

3）UserName（用户名）。

4）Comments（注释）。（可不填）

5）选择Quantitation（定量）试验类型

6）Next>（下一步）

2、定义方法和材料

在Methods&Materials（方法和材料）屏幕上，选择用于试验的

定量方法、试剂、升降温速度和PCR模板。

1）将StandardCurve（标准曲线）选为定量方法。

将StandardCurve（标准曲线）选为定量方法。标准曲线试验确

定样本中靶序列的肯定量。从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于

归档结果。当设置反应板时，标准曲线方法须要靶、标准品和样本。

用于标准曲线试验的PCR反应包括以下组分：

•样本一其中靶数量未知的样本。

•标准品一数量已知的样本。

・标准品稀释序列一一组用于构建标准曲线的标准品稀释液（例如,

1:2、1:4、1:8、1:16、1:32）o

•重复数一含有相同组分和量的相同反应数。

•阴性比照一含有水或缓冲液的样本，不含模板；也称为“无模板

比照

（NTC）”。阴性比照应不会扩增。

2）为试剂选择TaqMan®Reagents（TaqMan试剂）（包括两

个引物一个探针）。

-假如运用TaqMan试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选

择

TaqMan®Reagents（TaqMan试齐ij）。TaqMan试剂包括两个引

物和一个

TaqMan®探针。引物设计用于扩增靶。TaqMan探针设计用于杂交靶,

并

在扩增靶时产生荧光信号。

切记！AppliedBiosystems不建议将TAMRATM染料随

StepOneTM系统用作荧光报告基团或淬火基团。

-假如运用SYBRGreen试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，

则选

择SYBR®GreenReagents（SYBRGreen试剂）。SYBRGreen

试剂包括两

个引物和SYBRGreen染料。引物设计用于扩增靶.SYBRGreen染

料可在

结合到双链DNA时产生荧光信号。SYBRGreen染料通常是添加到反

应的

SYBRGreen母液的一部分。假如运用SYBRGreen染料：

选择IncludeMeltCurve（包括解链曲线）以执行扩增靶的解链曲线

分析。

将Standard（标准）选为升降温速度。AppliedBiosystems不供应

SYBR

Green试剂的Fast母液。

3）为升降温速度选择Standard（-2hourstocompletearun）

（标准（约两小时完成运行））。

-假如为PCR反应运用Fast试剂，则选择Fast（~40Minutes

to

CompleteaRun）（快速（约4。分钟完成运行））。

-假如为PCR反应运用标准试剂（包括SYBRGreen试剂和

TaqMan试剂），则选择Standard（~2HourstoCompleteaRun）

（标准（约2小时完成运行））。

4）为模板类型选择gDNA（genomicDNA）（gDNA（基因组

DNA））o

5）Next>（下一步）。

3、设置靶

在Targets（靶）屏幕上，输入您想在PCR反应板中定量的靶数

量，然后为每个靶设置检测.

1）单击Howmanytargetsdoyouwanttoquantifyinthe

reactionplate?（您想在反应板中定量多少靶？）字段，然后输入1

（依据须要填）。

留意：靶检测表中的行数将以您输入的数字更新。

2）选择SetUpStandards（设置标准品）复选框，以为靶检测设

置标准品。

建议反应板中的每个靶检测设置一条标准曲线。

留意：SetUpStandards（设置标准品）复选框默认状况下已选

取。

3）设置靶1检测：

a.单击EnterTargetName（输入靶名称）单元格，然后输入

RNaseP（示例）。

b.从Reporter（报告基团）下拉菜单中，选择FAM（默认）。

-假如要将FAMTM染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5'

端，则选择FAM。

-假如要将JOETM染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5,

端，则选择JOE。

-假如要将VIC®染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5'

端，则选择VIC。

-假如您正运用SYBR®Green染料以检测双链DNA,则选择

SYBRo

c.从Quencher（淬火基团）下拉菜单中，选择NFQ-MGB（默

认）。

-假如要将非荧光淬火基团一小沟结合物加在您正用于检测靶的

TaqMan探针的3，端，则选择NFQ-MGB。

-假如您正运用SYBRGreen染料，则选择None（无）。

4）Next>（下一步）。

4、设置标准品

在Standards（标准品）屏幕上，为全部标准曲线输入反应板中的

点数和重复数。对于每条标准曲线，输入起始量并选择序列倍数。

1）单击Howmanypointsdoyouneedforeachstandard

curve?（每条标准曲线您须要多少个点？）字段，然后输入5o

建议每条标准曲线应至少有五个稀释点。

2）单击Howmanyreplicatesdoyouneedforeachpoint?

（每个点您须要多少次重复反应？）字段，然后输入3o

建议每个点三次重复反应。

3）为RNaseP（示例）检测定义标准品数量范围：

a.单击EnterStartingQuantity（输入起始量）字段，然后输入

lOOOOo

由于标准品数量的范围会影响扩增效率计算，因此应细致为您的检测

考虑标准品数量的适当范围：

-为了更精确地测量扩增效率，请运用大范围的标准品数量，扩大

到5个至6个对数级之间。假如您为标准品指定大范围的数量，您需运

用PCR产物或高度浓缩的模板，如cDNA克隆。

-假如您的cDNA模板数量有限且/或靶是低拷贝数转录物，或已

知在给定范围之内，则可能须要小范围的标准品数量。

b.从SelectSerialFactor（选择序列倍数）下列菜单中，选择

l:2o

序列倍数用于计算标准曲线全部点中的数量。假如您的起始数量是

最高数

量，则选择如1:2、1:3之类的稀释倍数。假如您的起始数量是最低数

量，则选择如2X、3X之类的浓缩倍数。

4）查看StandardCurvePreview（标准品曲线预览）窗格。标

准曲线应包含如E点：10000、5000>2500、1250和625。

5）Next>（下一步）。

5、设置样本

在Samples（样本）屏幕上，输入反应板中要包括的样本、重复数

和阴性比照数，然后选择样本/靶反应以进行设置。

1）单击Howmanysamplesdoyouwanttotestinthe

reactionplate?（您想在反应板中检测多少样本？）字段，然后输入2。

（依据须要填）

2）单击Howmanyreplicatesdoyouneed?（您须要多少次重

复反应？）字段，然后输入3o

建议对每个样本反应重复三次反应。

3）单击Howmanynegativecontrolsdoyouneedforeach

targetassay?（每个靶检测您须要多少阴性比照？）,然后输入3。

建议对每个靶检测进行三次阴性比照反应。

4）4.设置样本1:

a.单击EnterSampleName（输入样本名）字段，然后输入

popl（用于重复组1）O

b.保留Color（颜色）字段中的默认设置。

5）设置样本2:

a.单击EnterSampleName（输入样本名）字段，然后输入

pop2（用于重复组2）o

b.保留Color（颜色）字段中的默认设置。

6）j&nAUSample/TargetReactions（全部样本/靶反应）以检

测全部样本中的全部靶。

-选择AllSample/TargetReactions（全部样本/靶反应）以检

测全部样本中的全部靶。

-选择SpecifySample/TargetReactions（指定样本/靶反应）

以指定每个样本中要检测的靶。

7）在WellCount（反应孔数）窗格中，确认存在：

•6个未知反应孔U

•15个标准品反应孔S

・3个阴性比照反应孔N

•24个空反应孔

8）在ViewPlateLayout（查看检测板布局）选项卡上：

a.从ArrangePlateby（反应板布局方式）下拉菜单中，选择

Rows（按行）

（默认）。

b.从PlaceNegativeControls（放置阴性比照）下拉菜单中，选

择UpperLeft（左上角）（默认）。

9）Next>（下一步）。

6、设置运行方式

在RunMethod（运行方法）屏幕上，查看默认运行方法的反应体

积和温度改变过程设置。若须要，您可调整默认运行方法或用Run

Method（运行方法）库中的某种方法进行替换。

1）单击选择GraphicalView（图形视图）选项卡（默认）或

TabularView（表格视图）选项卡。

2）单击ReactionVolumePerWell（每个反应孔的反应体积）字

段，然后输入25pL。

为“反应体积/反应孔”输入介于10至30的值。StepOne系统

支持10至

30pL之间的反应体积。

3）确保温度改变过程设置显示保持和循环阶段。

-确保温度改变过程设置适合试剂。

-假如正执行一步法RT-PCR扩增，则包括一个反转录步骤。

假如试验须要一个不同的温度改变过程设置，调整温度改变过程设置

或用

RunMethod（运行方法）库中的某个温度改变过程设置进行替换。

RunMethod（运行方法）库包括在StepOne软件中。

4）Next>（下一步）o

7、查看反应设置

在ReactionSetup（反应设置）屏幕上，选择检测类型（假如运

用TaqMan试剂），然后查看为打算PCR反应、标准稀释序列和样本

稀释而计算的剂量。若须要，您可调整反应体积、额外反应体积、组分

浓度、标准品浓度和/或稀释后样本浓度。

切记！对反应板中的每个靶检测执行这些步骤。

完成ReactionMixCalculations（反应预混液计算）选项卡

1）选择ReactionMixCalculations（反应预混液计算）选项卡

（默认）。

2）从SelectTarget（选择靶）窗格中，选择RNasePc

3）从AssayType（检测类型）下拉菜单中，选择

Inventoried/MadetoOrder（库存/定制）。

假如正运用TaqMan试剂，选择所运用的检测类型：

-假如正运用AppliedBiosystemsTaqMan@GeneExpression

Assays（库存/定制）或AppliedBiosystemsCustomTaqMan®

GeneExpressionAssays,则

选择Inventoried/MadetoOrder（库存/定制）。

-假如正运用PrimerExpress®软件设计检测，则选择Custom

（定制）。

4）确认ReactionVolumePerWell（每个反应孔的反应体积）字

段中显示25pLo

为“反应体积/反应孔”输入介于10至30的值。StepOne系统

支持10至

30RL之间的反应体积。

5）确认ExcessReactionVolume（额外反应体积）字段中显示

10%o

包括额外反应体积以弥补移液过程中的损失。建议至少打算10%的

额外反应体积。

6）在ReactionsforRNaseP（RNaseP反应）窗格中：

a.确认MasterMixConcentration（母液浓度）字段中显示2.0X。

b.确认AssayMixConcentration（检测预混液浓度）字段中显示

20.0Xo

c.查看PCR反应的组分和计算的剂量。

7）在StandardDilutionSeriesforRNaseP（RNaseP的标准

品稀释序列）窗格中：

a.单击StandardConcentrationinStock（储液中标准品的浓度）

字段，然后输入20000o

b.单击units（单位）字段，然后输入copiesperpLo

c.查看为打算标准品稀释序列计算的剂量。

完成SampleDilutionCalculations（样本稀释计算）选项卡

1）选择SampleDilutionCalculations（样本稀释计算）选项卡。

2)单击DilutedSampleConcentration(10XforReactionMix)

（稀释后样本浓度）（对于反应预混液为10X）,然后输入6.6o

3）从单位下拉菜单中，选择ng/pL（默认）。

4）查看为样本稀释计算的剂量。

8、试验材料订购

在MaterialsList（材料列表）屏幕上，查看建议用于打算PCR

反应板的材料列表。或者，您可从AppliedBiosystemsStore

（AppliedBiosystems产品仓库）订购所建议的材料。创建购物篮，

向购物列表中添加项目，然后登录以提交您的订单。您必需具有不受限

制的网络连接才能访问AppliedBiosystemsStore

（AppliedBiosystems产品仓库）。

1）在AppliedBiosystemsStore（AppliedBiosystems产品仓

库）网站上查找靶检测套件：

a.确保您的计算机已连接到因特网。

b.单击EnterGeneName（输入基因名）字段，输入RNaseP,

然后单击FindAssay（查找检测套件）。

c.在FindAssayResults（发觉检测套件结果）对话框中，选择

您的检测套件。

d.单击ApplyAssaySelection（应用检测套件选择）。

2）完成ExperimentMaterialsList（试验材料列表）窗格：

a.从Display（显示）下拉菜单中，选择AUItems（全部项）（默

认），然后查看建议的材料。若须要，运用右侧的滚动条查看全部项。

3）用于进行定量试验的Inventoried/MadetoOrder检测设计用

于协作以下TaqMan®母液运用：

TaqMan®FastUniversalPCRMasterMix(2X),No

AmpErase®UNG,

250次反应，编号

TaqMan®2XUniversalPCRMasterMix,200次反应，编号

TaqMan®2XUniversalPCRMasterMix,2000次反应，编号

10包装TaqMan®2XUniversalPCRMasterMix,编号

TaqMan®2XUniversalPCRMasterMix,NoAmpErase®

UNG,200次反应，编号

TaqMan®2XUniversalPCRMasterMix,NoAmpErase®

UNG,

2000次反应，编号

10包装TaqMan®2XUniversalPCRMasterMix,No

AnipErase®

UNG,编号

4)靶DNA或cDNA有几种TaqMan和SYBRGreen试剂可用于定

量试验。

a.TaqMan®试剂

TaqMan®FastUniversalPCRMasterMix(2X),No

AmpErase®UNG,250次反应

TaqMan®2XUniversalPCRMasterMix,200次反应，编号

TaqMan®2XUniversalPCRMasterMix,2000次反应，编号

10包装TaqMan®2XUniversalPCRMasterMix,编号

TaqMan®2XUniversalPCRMasterMix,No,AmpErase®UNG,

200次反应，编号

TaqMan®2XUniversalPCRMasterMix,NoAmpErase®UNG,

2000次反应，编号

10包装TaqMan®2XUniversalPCRMasterMix,No

AmpErase®UNG,

编号

TaqMan®PCRCoreReagentsKit,200次反应，编号N808-

0228

b.SYBR®Green试剂

尸owerSYBR®GreenPCRMasterMix(1mL),40次反应，编号

PowerSYBR®GreenPCRMasterMix(5-mL),200次反应，编号

PowerSYBR@GreenPCRMasterMix(10X5-mL),2000次反

应，编号

Z^>iverSYBR®GreenPCRMasterMix(50mL),2000次反应，编

号

SYBR®GreenPCRMasterMix(1-mL),40次反应，编号

SYBR®GreenPCRMasterMix(5-mL),200次反应，编号

SYBR®GreenPCRMasterMix(50-mL),2000次反应，编号

SYBR®GreenPCRCoreReagents,200次反应，编号

9、完成设计向导

要完成DesignWizard（设计向导）工作流程，查看反应板布局,

然后选择一个退出选项。

1）在ReviewPlateforExperiment（查看试验的反应板）窗口

中，查看反应板布局。

2）单击SaveExperiment（保存试验）。

3）在SaveExperiment（保存试验）对话框中，单击Save（保

存）以接受默认文件名和位置。示例试验被保存并关闭，并且您返回到

Home（主页）屏幕c

二、打算反应工作

如何为标准曲线试验打算PCR反应。

1、打算样本稀释

在将样本添加到最终反应预混液之前，执行样本稀释。采纳

StepOneTM软件计算的剂量稀释样本。（样本稀释计算）

依据储液中的样品浓度？ng/pL,Stepone软件计算出稀释剂量。

因为在StepOne软件中，样本量仅限于反应总量的10%,因此须要进

行样本稀释。反应总量为每次反应25pL,因此样本量为每次反应2.5

pLo依据“样本稀释计算”表稀释样本。

1）所需材料

用于稀释样本的稀释液（TE缓冲液或水）、样本储液

微量离心管、移液枪、移液枪枪头、试管振荡器、离心机

2）为每份拟稀释样本标记一个单独的微量离心管：Population1、

Population2等

3）将所需剂量的稀释液添加到每个空反应管内。（14.2pL）

4）将所需剂量的样本储液添加到每个反应管内。（lpL）

5）振荡每份稀释的样本3至5秒，然后短暂地离心反应管。

6）将稀释后样本置于冰上，直到打算好反应板。

2、打算标准品稀释序列

采纳StepOne软件计算的剂量打算标准品稀释序列。（反应预混

液计算）依据储液中的标准品浓度？copies/pL,Stepone软件计算出

剂量。

1）所需材料

用于稀释标准品的稀释液（TE缓冲液或水）、标准品储液

微量禽心管、移液枪、移液枪枪头、试管振荡器、离心机

2）为每份标准品标记一个单独的微量离心管：Std.1、Std.2、

Std.3、Std.4、Std.5。

3）将所需剂量的稀释液添加到每个空反应管内：Std.1

（14.5pL）、Std.2（9.1pL）、Std.3（9.1pL）、Std.4（9.1pL）、

Std.5（9.1pL）o

4）在Std.1反应管中打算稀释液1:

a.振荡储液3至5秒，然后短暂地离心反应管。

b.运用新的移液枪枪头，将3.6PL储液添加到Std.1反应管中。

c.振荡Std.1反应管3至5秒，然后短暂地离心反应管。

5）在Std.2反应管中打算稀释液2：

a.运用新的移液枪枪头，将9.1pL稀释液1添加到Std.2反应管

中。

b.振荡Std.2反应管3至5秒，然后短暂地离心反应管。

6）在Std.3反应管中打算稀释液3:

a.运用新的移液枪枪头，将9.1pL稀释液2添加到Std.3反应管

中。

b.振荡Std.3反应管3至5秒，然后短暂地离心反应管。

7）在Std.4反应管中打算稀释液4：

a.运用新的移液枪枪头，将9.1RL稀释液3添加到Std.4反应管

中。

b.振荡Std.4反应管3至5秒，然后短暂地离心反应管。

8）在Std.5反应管中打算稀释液5:

a.运用新的移液枪枪头，将9.1RL稀释液4添加到Std.5反应管

中。

b.振荡Std.5反应管3至5秒，然后短暂地离心反应管。

9）将标准品置于冰上，直到打算好反应板。

3、打算反应预混液

运用StepOne软件计算的组分和剂量打算反应预混液。（反应预混

液计算）

若试验包括一个以上的靶检测，则为每个靶检测单独打算反应预混

液

1）所需材料

各反应预混液组分

微量离心管、移液枪、移液枪枪头、离心机

2）为反应预混液标记一个适当大小的反应管：ReactionMixo

3）将所需剂量的每种组分添加到反应管中：母液（2.0X）12.5RL、

检测母液（20.0X）1.3RL、水8.8pL,总剂量22.6RL,加上10%的超

额量2.26pL,共计24.86pL,24次反应所需剂量为596.6pL

留意：将检测母液置于冰柜中避光储存，直到打算运用。过多暴露

在光线卜'会影响荧光探针。

计算中包括额外剂量，以便为试剂转移期间发生的损失供应多余剂

量。建议至少打算10%的超额量。

4）用移液枪轻轻吸入并排出反应预混液使其混合，然后盖上反应管

盖。

5）短暂地离心反应管以除去气泡。

6）将反应预混液置于冰上，直到打算好反应板。

留意：运用之前，请执行以下操作:

-摇摆瓶子，彻底混合母液。

-振荡反应管以重新悬浮检测母液，然后短暂地离心反应管。

-将任何冷冻样本置于冰上将其解冻。解冻时，进行振荡以重新悬

浮样本，

然后短暂地离心反应管。

4、打算反应板

为每个重复组打算反应物，然后将它们转移到反应板。采纳

StepOne软件中显示的反应板布局。

1)所需材料

反应预混液ReactionMix、标准品、样本、水

MicroAmpTMFastOptical48-WellReactionPlate

MicroAmpTMOptical48-WellAdhesiveFilm

微量离心管、移液枪、移液枪枪头、离心机

2)打算靶阴性比照反应预混液：

a.向一个适当大小的反应管中，加入下面所列剂量的反应预混液和水。

反应管反应预混液反应预混液剂水量(pL)

量(pL)

1Reactionmix74.68.3

b.用移液枪轻轻吸入并排出反应预混液使其混合，然后盖上反应管盖。

c.短暂地离心反应管以除去气泡。

d.向反应板的相应反应孔中分别加入25PL的阴性比照反应预混液。

3)对于每个重复组，打算标准品反应预混液：

a.向适当大小的反应管中，加入下面所列剂量的反应预混液和标准品。

反应标准品反应预混液反应预混标准品标准品剂

管反应预液剂量量量L)

混液(pL)

1Std1Reaction74.6Std18.3

mix

2Std2Reaction74.6Std28.3

mix

3Std3Reaction74.6Std38.3

mix

4Std4Reaction74.6Std48.3

mix

5Std5Reaction74.6Std58.3

mix

b.用移液枪轻轻吸入并排出反应预混液使其混合，然后盖上各反应管

盖。

c.短暂地离心各反应管以除去气泡。

d.向反应板的相应反应孔中加入25pL的标准品反应预混液。

4）对于每个重复组，打算未知样本的反应预混液：

a.向适当大小的反应管中，加入下面所列剂量的反应预混液和样本。

反未知样本反应预混液反应预混液样本样本剂量

应反应预混剂量（RL）（pL）

管液

1poplReaction74.6popl8.3

mix

2Pop2Reaction74.6Pop28.3

mix

b.用移液枪轻轻吸入并排出反应预混液使其混合，然后盖上各反应管

盖。

c.短暂地离心各反应管以除去气泡。

d.向反应板的相应反应孔中加入25pL的未知（样本）反应预混液。

5）用孔板高透光度盖膜密封反应板。

6）短暂地离心反应板以除去气泡。

7）在您打算好运行试验之前，将反应板置于阴暗处的冰上。

留意：当您打算自己的标准曲线试验时：

•确保您运用适当的耗材。

•确保PCR反应的支配与StepOne软件中显示的反应板布局一样。

您可以:

-接受软件自动生成的反应板布局。

或

-运用AdvancedSetup（高级设置）工作流程更改软件中的反应

板布局。

三、运行试验

1、打算运行

打开试验并将密封的MicroAmpTMFastOptical48-Well

ReactionPlate装载钊StepOneTM扩增仪以打算运行。

1）打开设计的试验

a.打开StepOne

b.从Home屏幕上，单击Open

c.在Open对话框中，导航到experiments文件夹（默认）

&找到创建的试验设计，打开。

2）装载反应板（带无粉手套）

a.打开扩增仪抽屉

b.将反应载体放置在样本加热块中。反应板的方向取决于您所用耗材

的类型：

•若运用一个反应板，让A1反应孔位于样本加热块的左后角。

•若运用反应管条带，则将条带置于样本加热块中。

c.当心地关闭扩增仪抽屉。

2、启动运行

若计算机已通过StepOne系统线缆干脆连接钊StepOne扩增仪，

则执行下列步骤。（并置启动）

1）在StepOne软件中，单击TemperaturePlot（温度曲线）。

2）单击STARTRUN（启动运行）。

3、监视运行

1）并置监视

运行期间，定期查看StepOne软件供应的全部三条曲线是否存在

潜在问题。

a.停止运行

在StepOne软件中，单击STOPRUN（停止运行）。对话框中

包括：

-StopImmediately（马上停止）以马上停止运行。

-StopafterCurrentCycle/Hold（当前循环/保持阶段后停

止）以在当前循环或保持阶段之后停止运行。

-Cancel（取消）以接着运行。

b.实时查看扩增数据

AmplificationPlot（扩增曲线）屏幕允许在StepOne扩增仪运

行期间采集荧光数据时查看样本扩增。若设置了某种方法以采集实时数

据，AmplificationPlot（扩增曲线）屏幕上会显示在ViewPlate

Layout（查看反应板布局）选项卡中所选反应孔的数据。扩增曲线将

比照归一化染料荧光（ARn）循环数。

AmplificationPlot（扩增曲线）屏幕对识别和检查异样扩增非常

有用。异样扩增可能包括以下状况：

•阴性比照反应孔中荧光增加。

•预期循环中不存在可检测荧光（在相同状况下.运用相同试剂从从

前类似的试验运行确定）。

c.实时查看运行的温度数据。

运行期间，TemperaturePlot（温度曲线）屏幕上实时显示样本

加热块、受热护盖门和样本（已计算）的温度c

TemperaturePlot（温度曲线）屏幕对识别硬件故障非常有用。

当监视TemperaturePlot（温度曲线）屏幕时，视察Sample（样

本）、HeatedCover（受热护盖门）和SampleBlock（样本加热块）

曲线是否出现异样状况。

•通常，Sample（样本）和Block（样本加热块）曲线应大约相

互对应。两条曲线存在显著偏差可能表示存在问题。

•HeatedCover（受热护盖门）曲线应保持方法中指定的常温。

偏离一样温度可能表示存在问题。

d.在RunMethod（运行方法）屏幕上查看运行进度

起先运行之后，StepOne系统会在RunMethod（运行方法）

屏幕上显示运行进度。例如对于方法的温度改变过程报告运行进度。

更改运行方法（添加循环、保持或解链曲线）

•在导航窗格中，单击RunMethod（运行方法）。

•在RunMethod（运行方法）屏幕上，执行以下随意操作

-输入要应用于CyclingStage（循环阶段）的循环数。

-若您想要将解链曲线阶段添加到运行的末尾，则选择

AddMeltCurveStagetoEnd（将解链曲线阶段添加到末尾）。

-若您想要将保持阶段添加到运行的末尾，则选择Add

HoldingStagetoEnd（将保持阶段添加到末尾）。

•单击SendtoInstrument（发送到扩增仪）

e.启用/禁用通知设置。

取或取消选取EnableNotifications（启用通知）复选框。

2）远程监视

若将您的StepOne扩增仪连接到网络，您可运用StepOne软件

的远程监视功能从网络上的任何一台计算机上实时查看运行进度。

4、卸载反应板并传输数据

当StepOne扩增仪显示RunHistory（运行历史）屏幕时，从

StepOne扩增仪上卸载反应板，并将试验数据传输到计算机以进行分析。

当StepOne扩增仅完成一次运行时，系统会将运行详情保存到运行

历史

记录，在扩增仪完成另一次运行之前，该运行历史记录会保留在系统中。

1）当StepOne扩增仪触摸屏上显示RunReport（运行报告）屏

幕时

2）打开扩增仪抽屉。

3）从样本加热块中取出反应板。

4）当心地关闭扩博仪抽屉。

切记！不要在运行后关闭StepOne扩增仪电源开关。不运用时，

扩增仪会自动进入休眠模式。

并置数据的传输是自动传输。

四、试验分析

StepOneTM软件运用标准曲线定量方法分析试验数据。

1、试验数据

打开StepOne,从Home屏幕上，单击Open,在对话框中，导

航到experiments文件夹，找到创建的试验设计，打开试验数据文件，

单击Analyze（分析），软件运用默认分析设置来分析数据。

1）软件元素

a.ExperimentMenu（试验菜单）窗格一供应到以卜,软件屏幕

的链接：

•Setup（设置）屏幕

•Run（运行）屏幕

•Analysis（分析）屏幕：

-AmplificationPlot（扩增曲线）

-StandardCurze（标准曲线）

-MulticomponentPlot（多组分曲线）

-RawDataPlot（原始数据曲线）

-QCSummary（QC摘要）

-MultiplePlotsView（多曲线视图）

b.Plot（曲线）窗格一为已打开的试验显示所选分析屏幕。

c.View（视图）选项卡一为已打开的试验显示反应板布局或反应

孔表

d.Experiment（试验）选项卡一为每个打开的试验显示一个选

项卡。

2）如何选择反应孔

要在分析屏幕上显示特定反应孔，在ViewPlateLayout（查看反

应板布局）选项卡上选择相应的反应孔，操作如下：

a.要选择某特定类型的反应孔，运用SelectWellsWith（选择反

应孔类型）下拉菜单：选择Sample（样本）、Target（靶）或

Task（任务），然后选择样本、靶或任务名称。

b.要选择单个反应孔，在反应板布局中单击该反应孔。

c.要选择多个反应孔，按住CTRL键并单击、或按住Shift键并

单击反应板布局中的某反应孔并拖移鼠标覆盖所需的反应孔。

d.要选择全部48个反应孔，单击反应板布局的左上角。

3）如何显示多条曲线

运用MultiplePlots（多曲线）屏幕可同时显示最多4条曲线。

要在MultiplePlots（多曲线）屏幕内导航:

a.从ExperimentMenu（试验菜单）窗格中，选择Analysis

（分析）一

MultiplePlotsView（多曲线视图）。

b.要显示四条曲线，单击：：Showplotsina2x2matrix（以

2X2窗格方式显示曲线）。

c.要在两行中显示两条曲线，单击：Showplotsintworows

（以两行显示曲线）。

d.要在两列中显示两条曲线，单击••Showplotsintwo

columns（以两列显示曲线）。

e.要显示某特定曲线，从每条曲线显示上方的下拉菜单中选择该曲

线。

2、查看标准曲线

StandardCurve（标准曲线）屏幕显示指定为标准品的样本的标

准曲线。StepOne软件依据标准曲线计算未知靶的数量。在Standard

Curve（标准曲线）屏幕上检查以下回来系数值：

•Slope（斜率）/扩增效率

斜率/扩增效率值一扩增效率通过运用标准曲线中回来线的斜率来

计算。

斜率接近-3.3表示最佳，即100%PCR扩增效率。影响扩增效率的因

素包括：

-标准品数量范围，为了获得更精确与更精确的效率测量值，运

用大范围的标准品数量（5至6个对数级（105至106倍）。

-标准品重复数，为了获得更精确的效率测量值，包括重复数以

降低移液误差的影响。

-PCR抑制剂一反应中的PCR抑制剂可降低扩增效率。

•R2值（相关系数）

R2值表示标准曲线回来线与标准反应的单个CT数据点之间的拟合

程度。值L00表示回来线与数据点完全拟合。R?值＞0.99较志向。

・5值

阈值循环（CT）是荧光水平达到阈值时的PCR循环数。CT值＞8

且

＜35较志向°CT值＜8表明反应中有太多模板.CT值＞35表明反应中

靶的数

量太少；对于CT值＞35的状况，期望更高的标准偏差。

1）从ExperimentMenu（试验菜单）窗格中，选择Analysis

（分析）

StandardCurve（标准曲线）。

留意：假如StandardCurve（标准曲线）屏幕中未显示数据，

单击Analyze（分析）c

2）在ViewPlateLayout（查看反应板布局）选项卡上单击反应

板布局的左上角，以在StandardCurve（标准曲线）屏幕上显示全部

48个反应孔。

3）从Target（靶）下拉菜单中，选择All（全部）。

4）从PlotColor（曲线颜色）下拉菜单中，选择Default（默

认）。

5）单击Show/Hidetheplotlegend（显示/隐藏曲线图例）。

6）查看标准曲线下面显示的值。在示例试验中，靶（RNaseP）

的值在可接受范围之内：

-斜率为-3.464。

-R?值为lo

-扩增效率（Eff%）为94.376%o

7）检查全部样本均在标准曲线内。在示例试验中，全部样本

（蓝点）均在标准曲线（红点）内。

8）检查CT值:

a.单击ViewWellTable（查看反应孔表）选项卡。

b.从GroupBy（分类方式）下拉菜单中，选择RepKcate（重

复）。

c.查看g列中的值。在示例试验中，CT值在预期范围（>8且

<35）内。

3、查看扩增曲线

©AmplificationPlot（扩增曲线）屏幕上显示所选反应孔内全部

样本的扩增状况。有三种曲