AES降解菌的分离鉴定及降解特性研究

AES降解菌的分离鉴定及降解特性研究ScreeningandIdentificationofAlcoholEtherSulfate（AES）

DegradingBacteriaandStudyonBiodegradationCharacteristics目录摘要 AES降解菌的分离鉴定及降解特性研究摘要：AES作为阴离子表面活性剂的代表物，其污染的治理已成为环保工作者的研究热点之一。本文从湖南丽臣实业股份有限公司污水处理池污泥中分离筛选到一株能以AES为唯一碳源生长并能高效降解AES的细菌Z-8。通过形态学观察、生理生化试验、16SrRNA序列分析和构建系统发育树对该菌株进行鉴定，探讨了AES初始浓度、温度、初始pH值和发酵时间对AES降解率的影响。利用红外光谱技术探索了AES的降解机理以及AES对降解菌细胞特性的影响。结果表明，菌株Z-8被鉴定为Pseudomonas假单胞菌Z-8。AES适宜的降解条件为初始浓度400mg/L、培养温度35℃、初始pH值9.0、发酵时间12h的条件下。在此条件下，AES降解率达到99.59%。通过红外检测AES的初步降解经过了-CH2-以及-C-O-S-键的断裂，菌体表面的脂质、蛋白质和多糖参与了AES的降解过程。关键词：AES；Pseudomonasknackmussii；16SrDNA；降解特性；降解机理ScreeningandIdentificationofAlcoholEtherSulfate（AES）

DegradingBacteriaandStudyonBiodegradationCharacteristicsAbstract.Asarepresentativeofanionicsurfactants,AEShasbecomeoneoftheenvironmentalists'researchtopicalpointsforthetreatmentofpollution.Inthisarticle,abacterium,calledZ-8,whichcangrowwithAESastheonlycarbonsourceanddegradeAESinhighefficiency,wasisolatedfromthesewagesludgeofHunanLixinIndustrialCo.ThestrainwasidentifiedbyMorphologicalobservations,physiologicalandbiochemicaltests,16SrRNAsequenceanalysisandphylogenetictreeconstruction,andtheninvestigatetheinfluenceofAESinitialconcentration,fermentationtemperature,initialpHandculturetimeonthedegradationrateofAES,andtoinvestigatethedegradationmechanismofAESandtheeffectsofAESoncellularpropertiesofdegradedbacteria.

TheresultsshowedthatstrainZ-8wasidentifiedasPseudomonasknackmussiiZ-8.ThesuitabledegradationconditionswereAESataninitialconcentrationof400mg/L,incubationtemperatureof35°C,initialpHof9.0andfermentationtimeof12h.Undertheseconditions,theAESdegradationratereached99.59%.TheprimarydegradationofAESbyinfrareddetectionunderwent-CH2-aswellas-C-O-S-bondbreaks,andlipids,proteinsandpolysaccharidesonthesurfaceofthebacteriumwereinvolvedinthedegradationprocessofAES.Keywords.AES；Pseudomonasknackmussii；16SrDNA；characteristicofdegradation;mechanismofdegradation1前言1.1AES的简介AES（全名为脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠）是烷基硫酸盐的改性产物，属于一种阴离子表面活性剂，具有发泡、去污、分散、乳化等特性。由于其在亲水基和疏水基中间嵌入了聚氧乙烯链，因而兼具非离子和阴离子表面活性剂的一些特性，可取代配方中使用的烷基硫酸盐（SDS）而广泛用于餐具洗涤剂、香波和浴液等洗涤产品中，在纺织、金属加工、农药和造纸等工业领域亦有应用[1]，预测脂肪醇醚硫酸盐的市场规模到2024年将增加至15亿美元[2]。1.2AES的危害近年来随着AES的广泛使用，其在生态环境中的含量逐年升高，对环境的影响表现在：AES进入土壤和水体后，能在水体中产生大量的持久性泡沫，阻断水体与空气的交换，减少水体中的溶解氧，造成对生态环境的污染[3]。AES对河流生态进行毒理性研究结果表明AES在高浓度下对蜉蝣类群和蛤蜊种群都有显著损害，影响了水体中鱼类和水生无脊椎动物的生长[4-6]。用小鼠模拟人体接触AES的方式研究结果表明，长期接触和使用AES可使小鼠毛发脱落数量显著增加，末梢血中中性粒细胞百分数明显降低、淋巴细胞百分数明显增加以及降低外周血血清中超氧化物歧化酶的含量，使小鼠体内抗氧化能力的降低，从而影响其正常生理功能[7-8]。1.3AES生物降解的研究性进展生物降解是指在微生物的作用下将表面活性剂分子分解成为微生物的代谢物或细胞物质，并释放CO2及H2O的过程。微生物降解法具备其独特的优点如降解快、费用低、二次污染少等。Swisher[9]对表面活性剂生物降解性与结构的关系研究表明，表面活性剂的生物降解性主要由疏水基团决定，并随着疏水基线性程度增加而增加，末端季碳原子会显著降低降解度，表面活性剂的亲水基性质对生物降解度有次要的影响。其降解需要经历三个过程：初级降解，包括吸附、裂解两个过程，经此阶段，AES表面活性基本丧失；下一阶段是生物降解产物能被环境接受，不会造成二次污染；最终阶段是AES被降解为CO2和水等无机质和其他代谢物[10]。近年来，国内外学者对主要从好氧和厌氧生物降解两大类角度研究AES微生物降解途径，而好氧生物降解的研究则更为集中。1.3.1AES好氧生物降解好氧生物处理法用得最普遍的是活性污泥法[10]，李遵峰等[11]用半连续活性污泥（SCAS）法测定表面活性剂的生物降解度，结果表明，AES在有氧条件下最终生物降解率为95.5%。周大鹏等[12]采用BOD5/COD来评价阴离子表面活性剂的生物降解性，结果表明28天AES生物降解率为70%。1.3.2AES厌氧生物降解已有研究较少关注到AES在厌氧条件下的生物降解。近来的研究确定了AES的初级厌氧生物降解率[1]。董庆斌等[13]在厌氧条件下，研究不同试验条件对AES生物降解性的影响。MadsenT等[14]在厌氧条件下选用高浓度的细菌培养液来测定底物比率，结果表明在厌氧条件下，AES降解更为充分。1.4本文的研究意义及目的AES作为一种应用广泛的阴离子表面活性剂，既易溶于水又溶于油脂，因具备良好的去污、起泡、乳化等性能以及性质温和、不伤皮肤等特点，是餐具洗涤剂、沐浴露、洗发液、洗手液、洗衣液等洗涤剂中的主要组成成分[16]。由于AES在人们日常生活中的应用面增加，其安全性也愈发受到消费者和研究工作者的重视。关于AES的生物降解及降解机理的相关研究，国内外鲜有文献报道。本文采用选择分离法从日用化工厂污水中分离能高效分解AES的细菌，并对分离菌株进行鉴定，探讨AES降解条件并初步探讨其降解机理，试图为AES的生物降解提供理论依据和技术支持。1.5主要研究内容AES降解菌的分离纯化和鉴定从日用化工厂污水中分离筛选出一株AES降解菌，并对其进行形态学、生理生化特性观察以及分子学鉴定。AES降解菌的降解特性研究AES降解菌在降解AES的过程中，AES初始浓度、温度、pH、降解时间等条件对AES降解菌降解率的影响。菌株的降解机理的初步研究通过红外光谱仪考察，降解过程AES官能团以及化学键以及菌体表面官能团的变化，初步探究AES生物降解机理。1.6技术路线图富集、筛选一株能高效降解A富集、筛选一株能高效降解AES的菌株（亚甲基蓝法确定其降解率）AESAES降解菌的分离纯化和鉴定革兰氏染色、生理生化分析、革兰氏染色、生理生化分析、16SrDNA分析鉴定菌株研究A研究AES初始浓度、初始pH、培养温度、培养时间对菌体降解AES能力的影响菌株PseudomonasknackmussiiZ-8对AES的降解特性红外光谱法考察降解A红外光谱法考察降解AES前后，菌体表面官能团的变化情况菌株菌株PseudomonasknackmussiiZ-8对AES的降解机理红外光谱法考察降解A红外光谱法考察降解AES前后，检测降解产物中AES化学键的变化图1技术路线图Fig1Technologyroadmap2材料与方法2.1试验材料2.1.1分离样品取自于湖南丽臣实业股份有限公司污水处理池中的污泥，置于无菌容器中，立即带回实验室进行AES降解菌的富集和分离。2.1.2主要试剂表1实验试剂Table1Experimentreagent名称纯度生产厂家牛肉浸膏BP上海盛思生化科技有限公司蛋白胨BP上海盛思生化科技有限公司琼脂BP合肥博美生物科技有限公司氯化钠AR国药集团化学试剂有限公司七水合硫酸镁AR国药集团化学试剂有限公司七水合氯化亚铁AR国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钾AR国药集团化学试剂有限公司氯化钾AR国药集团化学试剂有限公司2.1.3主要仪器设备表2实验仪器设备Table2Experimentinstrumentsandequipment名称型号生产厂家冰箱BCD-286H青岛海尔股份有限公司电子天平TMP-510湘仪天平仪器设备有限公司电子分析天平AL204梅特勒—托利多仪器有限公司恒温培养箱MJ-160C上海博讯实业有限公司医疗设备厂高温高压灭菌锅SS-325TOMY.KOGYO.CO,LTD立式压力蒸汽灭菌器LDZX-75KBS上海博迅实业有限公司单人单面超净工作台SW-CJ-1B（U）苏州设备净化有限公司pH计pHS-3C上海霄盛仪器制造有限公司双目光学生物显微镜EB-81BF麦克奥迪实业集团有限公司高速冷冻离心机CR21G无锡凯派克斯科技有限公司紫外可见分光光度计752上海光谱仪器有限公司DNA电泳槽DYCP-31DN北京六一仪器厂稳压电泳仪DYY-5北京六一仪器厂凝胶成像仪FR980上海复日科技仪器有限公司PCR仪2720thermalcyclerAppliedBiosystems真空冷冻干燥机CM-25S常州市恒迈干燥设备有限公司红外分光光度计alpha德国布鲁克2.1.4培养基富集培养基：AES0.4g，NH4Cl3g，MgSO4·7H2O0.25g，KCl0.25g，K2HPO41g，FeCl2·4H2O0.001g，H2O1L，pH7.2-7.4。121℃灭菌25min。筛选培养基：与富集培养基相同，另加2%的琼脂。121℃灭菌25min。斜面培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20.0g，H2O1L，pH7.0-7.2。121℃灭菌25min[15]。液体种子培养基：同斜面培养基成分，除去琼脂粉。发酵培养基：成分同富集培养基2.2试验方法2.2.1AES降解菌的分离纯化（1）采样：污泥样品取自于湖南丽臣实业股份有限公司污水处理池。（2）AES降解菌的富集：称取5.00g污泥样品接入100mL富集培养基中，于37℃、170r/min恒温振荡培养箱中富集培养3d。（3）AES降解菌的初筛：按照10倍稀释法[15]将富集液进行稀释，取不同稀释度的稀释液0.1mL涂布于筛选培养基平板中央，涂布均匀，于37℃细菌培养箱培养至长出单菌落。挑取单菌落于选择培养基表面划线纯化，待显微镜镜检时菌体形态一致，将其保存并编号。（4）AES降解菌的复筛：将保存于斜面的菌株分别接种到液体种子培养基中，37℃，170r/min条件下振荡培养24h后，以2%（V/V）的接种量接入AES浓度为400mg/L的发酵培养基中，在相同条件下恒温振荡培养48h，分别测定培养基中AES的含量，计算AES的降解率[16]。（5）菌种保存：将菌种接种在斜面培养基上，培养24h后放置4℃冰箱保存。2.2.2菌株形态观察与鉴定（1）菌体显微形态观察：菌体经革兰氏染色后进行光学显微镜观察。（2）菌落形态特征：制备菌悬液，按一定倍数稀释后涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基表面，然后将固体培养基置于37℃恒温培养箱中培养24h，观察菌落形状、大小、颜色、表面等各方面特征。（3）生理生化特性：按照《常见细菌系统鉴定手册》[17]进行生理生化鉴定。包括接触酶实验、葡萄糖氧化发酵实验、糖或醇类发酵实验、甲基红实验、V-P测定实验、淀粉水解实验、纤维素分解实验、硝酸盐还原实验、亚硝酸盐还原实验、反硝化实验、吲哚实验[16]。（4）16SrDNA序列分析：菌株在种子液体培养基培养24h后，采用上海生工生物工程Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行DNA提取。以提取的基因组DNA为模板，扩增16SrDNA基因片段。正向引物序列：27F：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3',反向引物序列：1492R.5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR扩增体系和反应条件如表3、表4所示，测序由上海生工生物工程有限公司完成。通过BLAST程序\h(http.//www.ncbi.nlm\h./BLAST/Blast.cgi)将16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对，并提交给GenBank。采用NJ法，用MEGA7.0.26构建系统发育树。表3PCR反应体系Table3PCRreactionsystemPCR反应体系浓度体积模板DNA20～50ng/μL0.5μL引物F10μmol/L0.5μL引物R10μmol/L0.5μLdNTP（mix）2.5mmol/L1μLTaqBuffer（withMgCl2）10×2.5μLTaq酶5U/μL0.2μLddH2O19.8μL表4PCR反应条件Table4PCRreactionconditions序号程序温度时间1预变性94℃4min2变性94℃45s3退火55℃45s4延伸72℃1min5循环2to435cycles6修复延伸72℃10min7保存4℃—2.2.3培养方法斜面培养：将保存的菌种接种于斜面培养基表面，37℃恒温培养24-36h。备用[16]。液体种子培养：将活化后的斜面菌种接种于液体培养基中，37℃，170r/min条件下恒温培养24h[16]。发酵培养：按2%（V/V）的接种量将培养好的液体种子接种于装有100mL/300mL三角瓶的发酵培养基中，37℃，170r/min条件下恒温培养48h，测定培养液中AES含量，并计算AES降解率[16]。三次重复。2.2.4菌株Z-8对AES降解特性研究（1）AES初始浓度对菌株Z-8降解AES的影响在培养基中分别添加400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L、1400mg/L的AES，37℃、170r/min条件培养48h，测定培养液中AES含量，计算AES的降解率。（2）培养温度对菌株Z-8降解AES的影响：基于上述试验结果，将三角瓶分别置于28℃、30℃、32℃、35℃和37℃条件下，170r/min恒温振荡培养培养48h，其它条件不变，测定培养液中AES含量，并计算AES的降解率。（3）培养基初始pH值对菌株Z-8降解AES的影响：在上述试验结果的基础上，调节培养基初始pH值分别为3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，其它条件不变，48h后测定培养液中AES含量，并计算AES的降解率。（4）培养时间对菌株Z-8降解AES的影响：在上述试验结果的基础上，每隔3h取样测定三角瓶中发酵液的AES含量，从而计算AES的降解率，到培养48h为止。2.2.5AES含量测定测定方法参照国标GB/T15818-2018[17]，稍加改动。AES标准曲线的制作:操作如表5表5AES标准曲线制作步骤Table5AESstandardcurvepreparationsteps操作药品空白12345—AES含量(mg)00.030.060.090.120.15加液AES溶液(mL)03.06.09.012.015.0ddH2O(mL)10097.094.091.088.085.0振荡静置亚甲基蓝溶液(mL)25萃取三氯甲烷(mg)15，重复萃取三次振荡静置磷酸二氢钠溶液(mL)50萃取三氯甲烷(mg)5，重复萃取三次定容三氯甲烷(mg)至100紫外分光光度计测OD650（2）发酵液预处理4℃，在10000r/min、15min条件下离心发酵液，取上清液，测定AES的含量。以不接种为对照。（3）AES含量测定准确移取适量体积（降解初始取样量2mL～5mL，降解过程取样量可以增至50mL）的降解液于250mL分液漏斗中，加水至100mL,以下步骤按表5“加入亚甲基蓝25mL……再用三氯甲烷定容”程序进行[18]。AES降解率计算公式如下：D=(m0-mn)/m0×100%式中：D为第n小时后AES的降解率，%；m0为初始表面活性剂质量，mg；mn为第n小时后表面活性剂质量，mg[13]。2.2.6AES降解菌降解过程中表面官能团及降解产物变化AES降解菌菌体表面官能团变化：将AES降解菌在发酵培养基降解0h、12h和24h后，于4℃，10000r/min条件下离心15min后分别取沉淀和上清部分。用于检测菌体表面官能团的沉淀部分需先置于－57℃~－60℃真空冷冻干燥仪中干燥24h；而用于检测降解产物化学键变化的上清部分略去此步骤。再加入干燥的光谱纯溴化钾研磨、压片取片状干燥物放置在红外光谱仪的检测台上，将得到的试验结果与上海有机所红外谱图数据库：http.///scdb/main/irs-introduce.asp检索的AES谱图结果进行对比分析，检测降解前后AES降解菌表面基团以及降解产物的变化［18］。3结果与分析3.1菌株筛选3.1.1菌株初筛通过筛选、纯化后，得到8株能以AES为唯一碳源生长的菌株，结果见表6。表6初筛结果Table6Theresultsofinitialscreening编号显微形态菌落形态泡沫消失时间1）（h）Z-1球状红色，圆形，表面湿润、光滑，中央稍凸起48Z-2球状淡黄色，圆形，表面湿润、光滑，菌落扁平96Z-3长杆状黄色，圆形，表面湿润、光滑，中央稍凸起72Z-4长杆状淡黄色，卵圆形，表面干燥、光滑，菌落扁平108Z-5长杆状灰色，圆形，表面干燥、光滑，中央稍凸起96Z-6短杆状乳白色，圆形，表面干燥、粗糙，菌落扁平96Z-7短杆状乳白色，圆形，表面湿润、光滑，菌落扁平48Z-8短杆状灰白色、圆形、表面湿润、光滑、中央稍凸起12注：结果统计时以初始泡沫降解75%视为全部降解。Notes.Degradationof75%oftheinitialfoamisregardedastotaldegradation.3.1.2菌株复筛将8株菌株分别接种到400mg/L的AES发酵培养基中，并于37℃、170r/min条件下恒温振荡培养48h后，分别测定培养液中AES的含量，并计算AES的降解率。结果见图2。所分离的菌株中，相较于其它菌株（降解率均低于60%）。菌株Z-8对AES的降解率最高，为99.67%。因此选择菌株Z-8为试验菌株进行后续试验[16]。 图2AES降解菌复筛结果Fig2ThescreeningresultsofAES-degradingstrain3.2菌株鉴定结果3.2.1形态鉴定结果菌株Z-8在以AES为唯一碳源的筛选培养基上菌落呈灰白色、圆形、表面潮湿、边缘整齐、不透明,结果见图3。在光学显微镜下菌体为短杆状、无芽孢、革兰氏染色为阴性，结果见图4[16]。图4图4细胞形态Fig4Cellmorphology图3菌落形态Fig3Colonymorphology3.2.2生理生化试验生理生化指标见表7。表7菌株Z-8生理生化指标Table7PhysiologicalandbiochemicalindicatorsofstrainZ-8项目实验结果项目实验结果甘露醇＋丁二酸钠－乳糖－麦芽糖＋蔗糖－草酸－木糖＋甲基红（M.R）－山梨醇－硝酸盐还原＋葡萄糖＋反硝化－果糖＋乙酸氧化－甘油－产氨试验＋柠檬酸钠－注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。Notes:"+"indicatespositivewhile"-"indicatesnegative.3.2.316SrDNA序列分析结果菌株Z-8的电泳后凝胶成像分析，结果见图4。将其16SrDNA测序结果在NCBI中比对分析，序列全长为1404bp，与假单胞菌属序列相似度最高。选择Pseudomonasaeruginosa(GQ926936.1)作为外类群，采用NJ法，用MEGA7.0构建与假单胞菌属部分模式种16SrDNA基因系统发育树，结果见图6[16]。表明菌株Z-8与Pseudomonasknackmussii(HG322950.1)的亲缘关系最近，同处一个进化分支。综合菌落形态特征、生理生化特征和16SrDNA基因序列分析以及系统发育树构建结果，将菌株Z-8初步鉴定为PseudomonasknackmussiiZ-8[16]。30001000300010005001500Z-8Marker图5菌株Z-8的16SrDNAPCR扩增结果Fig5PCRamplificationresultofZ-816SrDNA图6菌株Z-8的16SrDNA系统发育树Fig6PhylogenetictreeofZ-8basedonthe16SrDNAsequence3.3发酵条件筛选结果3.3.1AES标准曲线利用Excel软件作AES的标准曲线，以AES含量为横坐标，650nm处的吸光值为纵坐标，结果如图7，y=7.0827x+0.0172，R2=0.9971，因此，该标准曲线具有良好的线性关系和拟合度。图7AES标准曲线Fig7AESstandardcurve3.3.2AES初始浓度对菌株Z-8降解能力的影响从图8可以看出，在AES初始浓度400mg/L-1400mg/L条件下菌株Z-8均对其具有一定的降解能力。当菌株Z-8在AES浓度为400mg/L-600mg/L时，其降解率无明显差异且均在98%以上，当AES浓度为600mg/L时，生长量达到了0.63。且在400mg/L时，对AES具有最佳的去除能力，去除率为99.38%。在AES浓度超过800mg/L，菌株对AES的降解能力急剧下降。在AES初始浓度达到1400mg/L时，AES的降解率仅为2.87%，生长量为0.13。表明菌株Z-8在高浓度的AES条件下生长受到显著的抑制作用，从而影响其降解效率。可能是由于高浓度的AES促进了菌体对胞内离子的释放，同时抑制对胞外离子的利用[18]。因此，选择培养基中AES初始浓度为400mg/L进行后续研究。图8菌株Z-8降解率及生长量随不同初始AES浓度的变化曲线Fig8CurveofdegradationrateandgrowthofstrainZ-8withdifferentinitialAESconcentration3.3.3温度对菌株Z-8降解能力的影响细胞内代谢酶的活性、细胞膜的结构与功能受温度影响，从而影响微生物的生长和代谢。酶只有在最适温度下活性最强，细胞内酶促反应在温度过高或过低都会降低甚至完全停止，导致细胞内物质合成受阻。从图9可以看出，菌株Z-8对温度的适应性范围较广：在温度为30～37℃时，菌株Z-8对AES的降解率均在99%以上[16]。当培养温度为35℃时，AES的生长量最大，达到0.72。随着培养温度的降低，AES的降解率和生长量均缓慢下降。表明低温影响了菌株Z-8的生长。因此，选择培养温度为35℃进行后续试验。图9菌株Z-8降解率及生长量随不同温度的变化曲线Fig9CurveofdegradationrateandgrowthofstrainZ-8withdifferenttemperature3.3.4初始pH对菌株Z-8降解能力的影响由图10结果可知，菌株Z-8对AES的降解率受培养基pH值影响较大，在一定的pH值阈值内，随着培养基初始pH值的升高，AES的降解率也随之提高。当培养基初始pH值为9.0时，AES降解率达到99.47%，生长量也达到了0.73。但培养基初始pH值超过9.0，AES降解率显著下降。分析原因为细胞膜电荷、细胞间物质交换以及细胞结构受环境酸碱度影响，从而影响了细胞对营养物质的吸收、代谢酶系的活性的改变，从而降低细胞对AES的利用率。图10菌株Z-8降解率及生长量随不同pH值的变化曲线Fig10CurveofdegradationrateandgrowthofstrainZ-8withdifferentPhvalue3.3.5培养时间对菌株Z-8降解能力的影响由图11可知，菌株Z-8对AES降解率和生长量均随着培养时间的延长而提高。当培养时间为12h时，AES降解率达到99.59%，生长量达到0.49[16]。而当继续延长培养时间，菌株Z-8对AES降解率间并不存在明显差异。因此，选择培养时间为12h。图11菌株Z-8降解率及生长量随培养时间的变化曲线Fig11CurveofdegradationrateandgrowthofstrainZ-8withculruraltime3.4降解机理3.4.1AES降解菌降解过程中菌体表面官能团变化红外吸收光谱是一种根据分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息来确定物质分子结构和鉴别化合物的分析方法，也是研究生物降解有机物的活性基团变化的常用方法[19]。降解AES0h、12h和24h的菌体在官能团区和指纹区均有吸收峰，结果见表8。降解0h的菌体官能团吸收带在4000～2900cm-1和1800～550cm-1，降解12h和24h的菌体官能团吸收带在1700～480cm-1。图12显示，与降解0d的菌体相比，降解12h和24h的菌体表面官能团吸收带在4000～2900cm-1消失，代表脂质CH、CH2、CH3基团，O-H伸缩振动或胺盐-NH2伸缩振动，证明脂质参与AES降解[20]。在1800～480cm-1出现了官能团吸收带的偏移，代表了羧基C=O、COO-、多糖P=O、酰胺C-N伸缩振动以及蛋白质特有的C-N-C剪式振动，证明菌体表面的蛋白质和多糖参与了AES降解[21]。3.4.2AES降解菌降解过程中降解产物的检测试样的红外光谱图见图13。1245cm-1(Vc-o-s)为AES中硫酸酯的特征吸收峰,并且1125cm-1处出现了醚键(Vc-o-c)的吸收峰。随着AES的降解，可以看到在24h时1245cm-1处的峰明显消失，表明化合物AES中C-O-S键的断裂[22]；同时2850cm-1的吸收峰也消失了，表明在降解过程中亚甲基-CH2断裂，推测AES的脂肪链发生了断裂。表8菌体降解AES的吸收峰波数和基团Table8FunctionalgroupsforbiodegradationofAESbyPseudomonasknackmussiiZ-8吸收峰基团及振动形式3000～2700cm-1饱和-CH-、-CH2-、-CH3基团3400～3200cm-1O-H伸缩振动760～1660cm-1胺盐-NH2伸缩振动1600～1550cm-1、1410cm-1羧基C=O伸缩振动1250cm-1COO-、多糖P=O、酰胺C-N伸缩振动小于650cm-1蛋白质特有的C-N-C剪式振动400030002000100000.2400030002000100000.21.00降解12h菌体降解24h菌体降解0h菌体Wavenumber/cm-1透过率率率11462.2透过率透过率2966.7540.01406.72966.7540.01406.713371337.81555.1555.63440.03440.0图12AES降解过程中菌体表面官能团的变化40003000200010000Wavenumber/cm-112h降解产物40003000200010000Wavenumber/cm-112h降解产物0h降解产物24h降解产物1.000.2透过率112512452850透过率112512452850图13AES降解产物的变化Fig13ChangeofAESdegradationproducts4讨论与结论4.1讨论本文从富含阴离子表面活性剂的污泥中筛选到一株能以AES为唯一碳源且高效降解菌株Z-8，根据16SrDNA基因序列分析比对及形态学观察和生理生化特征，将其鉴定为PseudomonasknackmussiiZ-8[16]。对AES降解特性试验表明菌株Z-8能适应高浓度醇醚硫酸盐，并且对温度适应性较广。显示了该菌对含较高浓度AES废水的处理中具有极好的应用前景。目前已经报道污水中阴离子表面活性剂降解方法主要有震荡培养法、活性污泥模拟法、开放（密闭）法等[23]。对于从自然界分离纯化微生物并应用于阴离子表面活性剂的降解主要集中于十二烷基苯磺酸钠（LAS）的降解研究。国内研究工作者分离出了能有效降解LAS的芽孢杆菌（Bacillussp.）[24]、黄单胞菌(Xanthomonassp.)[25]、可动苯基杆菌

（Phenylobacteriummobile）[26]等，张蔚文等[25]发现LAS降解菌株利用LAS的能力于降解质粒的存在有关，并且国外发现的主要是假单胞菌（Pseudomonasputida），与本文分离得到的菌株结果一致，表明假单胞菌（Pseudomonasputida）在阴离子表面活性剂降解方面存在较好的应用前景。目前关于AES的研究工作集中在对其生物降解性及生态学毒性评价上。王鹏等[27]概述了AES生物降解性的指标以及研究方法和手段。禾治宇等[28]发现AES在生态毒性上表现出比脂肪醇硫酸盐更强的毒性，且生物降解速度相对两种最常见的阴离子表面活性剂(LAS、SDS)较慢。但对AES生物降解特性及降解机理的研究较少，仅有董庆斌等[14]用活性污泥对AES进行了降解特性的研究，而从自然界分离微生物并对微生物进行鉴定和研究AES微生物降解特性的研究，国内外未见文献报道。本文探究各因素（温度、AES初始浓度、pH、培养时间）影响AES降解菌菌株降解能力。其中温度影响AES降解能力试验结果表明，菌株PseudomonasknackmussiiZ-8对温度具有较好的适应性，且在35℃时降解能力最佳，这与董庆斌等[13]研究结果一致。菌株PseudomonasknackmussiiZ-8在弱碱性条件下（pH为9）降解率达到最大，而菌株Plesiomonassp.90-3、Plesiomonassp.90-4在pH为8时具备较好的降解阴离子表面活性剂能力[25]，与本研究结果相似。本文在AES降解机理方面的并未进行深层次的阐述，在检测AES降解产物时采用红外光谱技术，发现AES的初级降解经过C-O-S键的断裂，这一结果与董庆斌[14]红外光谱检测活性污泥初级降解AES的结果一致，但这一结果仍是对AES降解机理的初步解析。而郑力文[29]等则推测AES乳化成分的亲水基团里都含有孤对电子和带部分负电荷的“类氢键”有利于初级降解的吸附阶段。纪树兰[26]在实时监测LAS降解的紫外光谱图后，结合液相色谱-质谱探究了一株可动苯基杆菌对LAS的生物降解机理。白琼洁[19]在探究表面活性剂对菌体的影响时，结合了原子力显微镜和扫描电子显微镜分析菌体表面变化。4.2结论与展望4.2.1结论从湖南丽臣实业股份有限公司污水处理池污泥中分离得到一株高效降解AES的菌株，其降解率达到了99.59%；根据形态观察、生理生化分析及16SrDNA序列分析，菌株与Pseudomonasknackmussii（登录号：HG322950.1）有99%的相似性，命名为Z-8。采用单因素试验法研究了菌株Z-8在不同因素下对AES的降解能力，菌株Z-8的降解率随其生长量同步增长，AES适宜的降解条件为初始浓度400mg/L、培养温度35℃、初始pH值9.0、发酵时间12h，对其降解率达99.59%。红外光谱技术结果显示，菌株PseudomonasknackmussiiZ-8菌体表面的脂质、蛋白质和多糖均参与了AES降解。起作用的主要官能团为：-CH-、-CH2-、-CH3、O-H、-NH2、C=O、COO-、P=O、C-N、C-N-C。AES降解过程中主要经过C-O-S键以及-CH2的断裂，推测AES初步降解脂肪链发生了断裂。4.2.1展望随着人们生活水平及环保意识的提高，生物降解法愈发成为了一项低成本、高效率的选择。目前已报道的文献以评价AES的生物降解性和毒性为主，根据环境微生物学的发展趋势，微生物降解的研究工作侧重于从分子生物学层面定位微生物中参与降解的相关基因、降解产物的检测以及降解机制的解析。因此，今后AES的研究的热点将主要集中在：AES的不同生物降解途径的探索；以及AES的降解过程代谢产物的形成机制、主要参与降解反应的微生物菌属以及动力学。参考文献[1]周大鹏,黄亚茹,秦志荣.脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸盐生物降解和环境安全性评价[J].日用化学品科学，2010，33(07)：33-38.[2]张红梅.国外资讯[J].中国洗涤用品工业，2018，(02)：98-100.[3]俞凌云,孙冬梅,张新申.阴离子表面活性剂测定的方法研究[J].皮革科学与工程,2009，19(02)：72-76.[4]BelangerSE,MeiersEM,BauschRG.Directandindirectecotoxicologicaleffectsofalkylsulfateandalkylethoxysulfateonmacroinvertebratesinstreammesocosms[J].Aquatictoxicology，1995，33(1).：65-87.[5]WolfWD,FeijtelT.Terrestrialriskassessmentforlinearalkylbenzenesulfonate(LAS)insludge-amendedsoils[J].Chemosphere，1998，36(6):1319-1343.[6]ShcherbakovaVA,LaurinavichiusKS,AkimenkoVK.Toxiceffectofsurfactantsandprobableproductsoftheirbiodegradationonmethanogenesisinananaerobicmicrobialcommunity[J].Chemosphere，1999，39(11)：1861-1870.[7]全立群,鲍柱仁,王秀敏.脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸盐(AES)残留对小鼠超氧化物歧化酶SOD的影响[J].中国继续医学教育，2015，7(14)：53-54.[8]全立群.脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸盐(AES)的残留对小鼠的影响[J].中国卫生产业,2013，10(33)：11-12.[9]SwisherRD.SurfactantBiodegration[M].NewYork:MarcelDekkerInc，1987.[10]王学川,任龙芳,强涛涛,等.皮革加脂剂的降解性及评价方法[J].中国皮革，2006，(01)：46-48+50.[11]李遵峰,张高勇,赵郁梅,等.半连续活性污泥法测定表面活性剂的好氧生物降解度[J].日用化学工业，2007，(02)：85-87+96.[12]周大鹏,黄亚茹,符林健,等.几种阴离子表面活性剂生物降解性评价[J].日用化学品科学，2014，37(01)：27-31.[13]董庆斌,赵永红,张广良,等.醇醚硫酸盐(AES)生物降解性的研究[J].印染助剂，2017，34(09)：32-35.[14]MadsenT,RasmussenD.Studiesonthefateoflinearalkylbenzenesulfonatesinsludgeandsludge-amendedsoil[J].TheClerReview，1999，(05)：14-19.[15]杜连祥主编.工业微生物学实验技术[M].天津:天津科学技术出版社,1992.[16]曾典,唐启玲,庞志宇,等.醇醚硫酸盐（AES）降解菌的筛选