《药品生物检定技术》课件-第六章 热原及细菌内毒素检查法

第六章热原及细菌内毒素检查法第一节概述第二节热原检查法第三节细菌内毒素检查法目录第六章热原及细菌内毒素检查法学习目标掌握

掌握热原及细菌内毒素检查法实验结果判断和意义

熟悉

熟悉热原及细菌内毒素检查法的操作步骤

了解

了解热原及细菌内毒素检查法的基本原理第六章热原及细菌内毒素检查法概述第一节第六章热原及细菌内毒素检查法第一节概述（1）热原的来源

①热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。

②热原物质是一种对热稳定，溶于水，不溶于乙醇，由活的细菌中来的一类物质，而且微量静注后就能引起高热反应。

③热原主要来源于革兰阴性菌的细菌内毒素。1.热原第一节概述（2）热原的化学性质①耐热性160～180℃加热3小时或250℃加热1小时以上方可彻底破坏内毒素。②水溶性热原具有水溶性，但不具有挥发性。③滤过性热原体积较小，约为1～5nm之间，可通过除菌滤器进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不能通过半透膜。④抗原性热原的多糖体部分可产生抗原性。1.热原第一节概述（3）常见消除热原的方法

①高温法180℃干烤3～4小时或250℃干烤1小时以上可使热原彻底破坏。

②吸附法热原在水溶液中可被常见的吸附剂如活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。

③滤过法热原体积较小，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用3.0～15nm超滤膜可将其除去。

④蒸馏法热原能溶于水但不挥发，可经蒸馏除去原水中的热原，通常需多次蒸馏，并加有隔沫装置。

⑤酸碱法热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。

⑥其他包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。1.热原第一节概述（1）热原是否就是内毒素，在学术上仍有争议。（2）严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性。（3）不存在细菌内毒素意味着不存在热原，控制内毒素就是控制热原2.细菌内毒素及其与热原的关系热原检查法（家兔升温法）第二节第六章热原及细菌内毒素检查法第二节热原检查法（家兔升温法）

由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。该法是将一定剂量的供试品静脉注入家兔体内，在规定时间内观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。

1.试验原理试验动物给药方法测定设备判断标准家兔耳静脉注射肛温计或测温仪给药后体温变化第二节热原检查法（家兔升温法）（1）供试用的家兔应健康合格，体重1.7kg以上，雌兔应无孕。（2）预测体温前7天即应用同一饲料饲养，在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常现象（3）未经用于热原检查的家兔；供试品判定为符合规定但组内升温达0.6℃家兔；或三周内未曾使用的家兔，均应在检查供试品前3～7天内预测体温，进行挑选。（4）挑选试验的条件与检查供试品时相同，仅不注射药液，每隔30分钟测量体温1次，共测8次，8次体温均在38.0～39.6℃的范围内，且最高最低体温的差数不超过0.4℃的家兔，方可供热原检查用。（5）用于热原检查后的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息48小时方可供第2次检查用，其中升温达0.6℃的家兔应休息两周以上。如供试品判定为不符合规定，则组内全部家兔不再使用。2.实验前准备第二节热原检查法（家兔升温法）（6）在热原检查前1～2日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于3℃，实验室的温度应在17～25℃，在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于3℃，应防止动物骚动并避免噪音干扰。（7）家兔在试验前至少1小时开始停止给食并置于宽松适宜的装置中，直至试验完毕。（8）家兔体温应使用精密度为±0.1℃的测温装置。测温探头或肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于1.5分钟，每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过0.2℃，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。（9）当日使用家兔，正常体温应在38.0～39.6℃的范围内，且各兔正常体温之差不得超过1℃。（10）与供试品接触的试验用器皿应无菌、无热原。去除热原通常采用干热灭菌法（250℃、30分钟以上），也可用其他适宜的方法除去热原。2.实验前准备第二节热原检查法（家兔升温法）

取适用的家兔3只，测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38℃的供试品溶液，然后每隔30分钟按前法测量其体温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数。如3只家兔中有1只体温升高0.6或高于0.6℃，或3只家兔体温升高的总和达1.3℃或高于1.3℃，应另取5只家兔复试，检查方法同上。3.操作过程第二节热原检查法（家兔升温法）（1）在初试3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔不超过1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或低于3.5℃，均认为供试品的热原检查符合规定。（2）在初试3只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只；或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和超过3.5℃，均认为供试品的热原检查不符合规定。（3）当家兔升温为负值时，均以0℃计。4.结果判断第二节热原检查法（家兔升温法）（1）降温问题USP、BP、欧洲药典以及我国药典均明确规定降温以“0”计。（2）实验室环境实验室环境不安静，动物受惊扰、骚动，也可影响实验结果。（3）注射液注射液在使用时要预热至38℃，并注意注射速度，不宜过快。（4）肛温计肛温计在使用之前要进行校正,每年定期标定一次。测温时轻轻提起兔尾，将蘸有润滑剂的肛温计或探头缓缓插入肛门，测温时间每兔至少2分钟。看温度计时眼睛要平视，看清刻度读出度数后再用酒精擦拭水银球。（5）耐受性家兔多次使用，复试时，挑选对热原敏感使用过2～3次的家兔进行试验为宜。当供试品不符合规定时，则组内家兔不再使用。供试品符合规定的家兔，需休息2天可再次使用。5.相关要求细菌内毒素检查法第三节第六章热原及细菌内毒素检查法第三节细菌内毒素检查法（1）发展简史

见教材1.基本概念及凝胶法反应原理第三节细菌内毒素检查法（2）反应原理及基本概念1.基本概念及凝胶法反应原理C因子活化的C因子内毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白原β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM活化的G因子（旁路反应）G因子二价阳离子第三节细菌内毒素检查法（2）反应原理及基本概念

①鲎试剂反应原理

②细菌内毒素国家标准品用于标定细菌内毒素工作标准品的效价和标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。

③细菌内毒素工作标准品用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。1.基本概念及凝胶法反应原理第三节细菌内毒素检查法（2）反应原理及基本概念

④细菌内毒素检查用水系细菌内毒素检查法专用水。凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度法测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素含量应小于0.005EU/ml。且对内毒素试验无干扰作用。⑤鲎试剂及鲎试剂灵敏度鲎试剂由鲎血制备而成，是从鲎血的变形细胞裂解物中提取制备而来。在细菌内毒素检查的规定条件下使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。1.基本概念及凝胶法反应原理第三节细菌内毒素检查法（2）反应原理及基本概念

⑥细菌内毒素的量值和细菌内毒素的限值哺乳动物对细菌内毒素有一定的耐受能力，因此不必要求药物绝对不含内毒素，只要不超过一定限度就不会引起热原反应。为保证用药安全，给每一种药物规定了相应的限值（L），只要低于该限值，按照规定给药途径即为安全。限值的确定有两种方式，从药典中查询和根据公式计算，各国药典规定做细菌内毒素检查项的品种都可在药典正文中查到相应的限值。

⑦最大有效稀释倍数最大有效稀释倍数（MVD）是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。1.基本概念及凝胶法反应原理第三节细菌内毒素检查法实验器具的要求：

试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少30分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。2.试验前准备第三节细菌内毒素检查法细菌内毒素检查用水（BET水的要求）：凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。2.试验前准备第三节细菌内毒素检查法（1）供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。2.试验前准备第三节细菌内毒素检查法（2）内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按式确定：L=K/M式中：L为供试品的细菌内毒素限值；

K

为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量；

M

为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量。2.实验前准备第三节细菌内毒素检查法（3）最大有效稀释倍数的确定（MVD）

最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数(1→MVD)，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。

式中：L

为供试品的细菌内毒素限值；

c为供试品溶液的浓度。2.实验前准备第三节细菌内毒素检查法（1）鲎试剂灵敏度的复核①在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。②复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。③根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作用细菌内毒素检查用水溶解，制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素标准溶液。④取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管，另外2管阴性对照（共18管）。3.凝胶法操作过程第三节细菌内毒素检查法（1）鲎试剂灵敏度的复核⑤37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度，从凝胶是否变形和滑落判断试验结果。注意保温和拿取试管的过程应避免受到振动造成假阴性结果。⑥若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。⑦结果计算：

反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc=lg-1（∑X/4）当λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于内毒素检查。但是注意要以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。3.凝胶法操作过程第三节细菌内毒素检查法（2）干扰试验

干扰试验是为了确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为产品能否用细菌内毒素检查法提供依据，并且验证供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时，供试品是否存在干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。3.凝胶法操作过程第三节细菌内毒素检查法（2）干扰试验

用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品按下表制备溶液A、B、C和D。同时制备2支供试品阴性对照和2支阴性对照。3.凝胶法操作过程编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液---2B2λ/供试品溶液供试品溶液12λ4

21λ4

40.5λ4

80.25λ4C2λ/检查用水检查用水12λ2

21λ2

40.5λ2

80.25λ2D无/检查用水---2第三节细菌内毒素检查法（2）干扰试验结果判断：只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。3.凝胶法操作过程第三节细菌内毒素检查法（3）凝胶限度试验

检验供试品中的内毒素含量是否小于限值的定性方法，按下表制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。3.凝胶法操作过程编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2供试品溶液B2λ/供试品溶液2供试品阳性对照C2λ/检查用水2阳性对照D无/检查用水2阴性对照

当阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。第三节细菌内毒素检查法

保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定。阳性对照结果出现阴性，可能是由于内毒素工作品效价标示不准确或效价衰退或失败；稀释内毒素没有使用旋涡混合器或稀释操作不当；鲎试剂效价标示不准确或效价衰退或失效；反应试管放入水浴保温前试管中内容物没有摇匀造成。阴性对照出现阳性结果可能是由于鲎试剂或者水污染、试验器具污染、试验过程操作不当污染造成。4.凝胶法结果判断第三节细菌内毒素检查法

5.凝胶半定量试验编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A

无/供试品溶液检查用水1248—2222B2λ/供试品溶液12λ

2C

2λ/检查用水检查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ

2222D无/检查用水———2A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品系列稀释液。B：供试品阳性对照。（为确证不存在干扰作用）C：标准内毒素系列。（为确证本次试验的操作和环境都符合要求）D：阴性对照第三节细菌内毒素检查法光度测定法分为浊度法和显色基质法浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。6.光度测定法简介第三节细菌内毒素检查法显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中