《药品生物检定技术》课件-第十六章 几种常见药品的生物活性检定

第十六章几种常见药品的生物活性检定第一节酶第二节肝素第三节洋地黄第四节缩宫素目录第十六章几种常见药品的生物活性检定学习目标第十六章几种常见药品的生物活性检定掌握

掌握尿激酶、肝素、洋地黄和缩宫素生物测定的实验过程

熟悉

熟悉尿激酶、肝素、洋地黄和缩宫素生物测定的原理

了解

尿激酶、肝素、洋地黄和缩宫素基本的临床应用酶第一节第一节酶

20世纪60年代，DeDuve就提出酶类药物是替代治疗遗传缺陷病的一种可行方式。1987年，第一种重组酶类药物activasel诞生，由FDA批准，用于治疗由冠状动脉阻塞引起的心脏病，标志着酶类药物新时代的到来。国内生产品种也从原来的十几种发展到现有的百余种。1.

概述尿激酶是一种具有溶解血栓功能碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存在于人和其他哺乳动物的尿液中，可以从尿液中分离得到。尿激酶有多种分子量形式，主要有31300和54700两种。尿中的尿胃蛋白酶原在酸性条件下可以激活生成尿胃蛋白酶，后者在酸性条件下可以把分子量54700的天然尿激酶降解为分子量31300的尿激酶。第一节酶

1.

概述尿激酶是专属性很强的蛋白水解酶，血纤维蛋白溶酶原是它唯一的天然蛋白质底物，它作用于精氨酸-缬氨酸键使得纤溶酶原转为纤溶酶，并最终导致血栓的溶解。尿激酶的pI（等电点）为pH8~9，主要部分在pH8.6左右。溶液状态不稳定，冻干状态可稳定数年。加入1%EDTA、人血清蛋白或明胶可防止酶的表面变性作用。临床上用于治疗各种血栓性疾病，如心肌梗死、脑血栓、肺血栓、四肢动脉血栓症、视网膜血管闭塞症、风湿性关节炎等。第一节酶

1.

概述《中国药典》（2015年版）以气泡上升法测量其效价，该法系比较尿激酶标准品和供试品溶解蛋白凝块的能力，以测定供试品的效价。测定原理是利用尿激酶激活纤维蛋白溶酶原，使其转化为纤维蛋白溶酶，而纤维蛋白原在凝血酶的作用下转变为纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白溶酶作用下水解为可溶性小分子多肽，此时溶液中气泡上升越快，则说明尿激酶活力越高。第一节酶

1.

概述

试剂（1）牛纤维蛋白原溶液：取牛纤维蛋白原，加巴比妥-氯化钠缓冲液（pH7.8）制成每1ml中含6.67mg可凝结蛋白的溶液。（2）牛凝血酶溶液：取牛凝血酶，加巴比妥-氯化钠缓冲液（pH7.8）制成每1ml中含6.0U的溶液。（3）牛纤维蛋白溶酶原溶液：取牛纤维蛋白溶液酶原，加三羟甲基氨

基甲烷缓冲液（pH9.0）制成每1ml中含1~1.4酪蛋白单位的溶液（如溶液浑浊，离心，取上清液备用）。（4）混合溶液：临用前取等容积的牛凝血酶溶液和牛纤维蛋白溶酶原溶液，混匀。第一节酶

2.

检定方法测定前标准品溶液、供试品溶液的制备标准品溶液的制备取尿激酶标准品，加巴比妥-氯化钠缓冲液（pH7.8）制成每1ml中含60U的溶液。供试品溶液的制备取本品适量，用巴比妥-氯化钠缓冲液（pH7.8）溶解，混匀，并稀释成与标准品溶液相同的浓度。第一节酶

2.

检定方法每管加牛纤维蛋白原溶液0.3ml加入巴-缓冲液（pH7.8）0.90.80.70.6ml依次加标准品溶液0.10.20.30.4ml37℃±0.5℃水浴,反应30-40秒混合溶液0.4

0.40.40.4ml当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记时。每个浓度测3次，求平均值（3次测定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10%）。以尿激酶浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归。供试品按上法测定，用线性回归方程求得效价，计算每1mg供试品的效价（单位）。第一节酶

检定方法

效价测定

取供试品约10mg，精密称定，照凯氏定氮测定法（2015年版《中国药典》四部通则0731）测定：

将样品置凯氏定氮瓶中，加硫酸钾约0.3g、30%硫酸铜5滴、硫酸2ml消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化、泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至澄明，呈绿色后，继续加热10分钟，放冷，加水2ml。第一节酶

检定方法蛋白质含量测定

取2%硼酸吸收液10ml置100ml锥形瓶内，将凯氏蒸馏器冷凝管末端浸入硼酸吸收液内，将消化好的供试品移入凯氏蒸馏器内，用水洗定氮瓶3~4次，将洗液移入蒸馏器内，再加入50%氢氧化钠溶液5ml，然后进行蒸馏，待接收液总体积为35~50ml，将冷凝管末端移出液面，使蒸汽继续冲洗约1分钟，用水淋洗尖端后停止蒸馏。接收液用硫酸滴定液（0.005mol/L）进行滴定，至溶液由蓝绿色变为灰紫色，并将滴定的结果用空白试验校正。将结果乘以6.25，即得供试品中蛋白含量，并计算每1mg供试品中的蛋白量（mg）。第一节酶

检定方法蛋白质含量测定比活计算按照式（13-1）进行。

第一节酶

3.比活计算注：尿激酶保存需遮光，密封，10℃以下；每毫克蛋白中尿激酶活力不得少于100000U。注意事项1．效价测定时所使用的各种蛋白或酶均具有生物活性，因此在测定时保证它们的活性未受任何影响，否则对测定结果会有影响。2．消化时应注意旋转凯氏定氮瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏定氮瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后再继续加热至完全。3．硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。4．在重复性条件下，两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

第一节酶

肝素第二节第二节肝素

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概述肝素最早得自肝脏，但以肺脏含量最丰富。动物体内的肝素以与蛋白结合成复合体的形式存在，故不显抗凝血作用。药用肝素系自猪或牛的肠黏膜中提取，故可能发生过敏反应。《中国药典》（2015年版）规定3种方法，兔全血法、血浆复钙法、APTT法测定肝素效价。原理：肝素系天然酸性黏多糖，具有延长血凝时间的作用。第二节肝素

2.

检定方法标准品溶液的制备

精密称取肝素标准品适量，按标示效价加灭菌注射用水溶解使每1ml中含100U的溶液，分装于适宜容器内，4~8℃贮存，经验证保持活性符合要求，可在3个月内使用。标准品稀释液的制备按高、中、低剂量组用氯化钠注射液配成3种浓度的稀释液，相邻两浓度的比值（r）应相等。兔全血法：

r为1:0.7左右；每1ml中含肝素2~5U血浆复钙法者r为1:0.85左右；1ml中含肝素0.5~1.5UAPTT法r为1：0.85；每1ml含肝素0.4-1.7单位第二节肝素

检定方法兔全血法从动物采血时起至小试管放入恒温水浴的时间不得超过3分钟，注意观察并记录各管的凝结时间。本法的可信限度FL（%）不得大于10%。37℃±0.5℃恒温水浴中标准品高、中、低剂量各3管，每管0.1ml标、供每管加血0.9ml供试品高、中、低剂量各3管，每管0.1ml第二节肝素

检定方法血浆复钙法从立即混匀，避免产生气泡，并开始计算时间。本法的可信限度FL（%）不得大于5%。血浆在37℃±0.5℃恒温水浴中预热5~10分钟后,加入肝素溶液及氯化钙标准品高、中、低剂量各3管，每管血浆：肝素溶液及氯化钙的加入量分别为0.5ml、0.4ml、0.1ml或0.8ml、0.1ml、0.1ml供试品高、中、低剂量各3管，第二节肝素

检定方法APTT法将上述方法测得的凝结时间换算成对数，照生物检定统法法中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。本法的可信限度FL（%）不得大于10%。37℃±0.5℃恒温水浴中预热180秒后,加入氯化钙50μl。标准品高、中、低剂量各3管，每管血浆50μl,肝素溶液50μl、APTT500μl.供试品高、中、低剂量各3管，第二节肝素

注意事项1．用新鲜兔血检定时，取血要求出血快，出血快慢是试验成败的关键，一般多采用动脉取血。2．血液加入预先加入肝素的小试管时，应防止产生气泡，加血后立即用小玻璃棒混匀。3．加血次序由高剂量到低剂量，且标准品和供试品要对应加入血液。4．水浴的水面要高于试管内的液面，防止出现下面凝结、上面不凝结的现象。5．终点观察可采用倒转法，也可采用压板法或测凝棒法，即将试管轻轻倾斜90°，血液不流动为终点。开始时，手拿起管子，并用手指轻轻弹管壁，即可见液面颤动，此时可隔2~3分钟观察1次；当液面开始凝固，手指轻弹管壁已不太颤动时，每隔1分钟观察1次；当手指轻弹管壁几乎不再颤动时，0.5分钟观察1次。洋地黄第三节第三节洋地黄

洋地黄为玄参科植物紫花洋地黄的干叶及其制剂。洋地黄类药物有多种，主要包括地高辛、去乙酰毛花苷、毒毛花苷K等。洋地黄类药物用来治疗各种心脏病引起的充血性心力衰竭和快速性室上性心率失常；其中地高辛是目前治疗心力衰竭最常用的药物。1.

概述第三节洋地黄

洋地黄类药物是一类能选择性作用于心脏，增强心肌收缩的药物，又称强心苷类。强心苷由于增强心肌收缩性，使心脏排出量增加，从而发善动脉系统供血状况，由于心脏排空完全，舒张期延长，使回心血量增加，静脉压下降，从而解除静脉系统淤血症状。洋地黄类药物的共同特点是有效治疗量、中毒量和致死量三者相当接近，加上对药物的耐受性个体差异大，所以容易发生中毒。1.

概述第三节洋地黄

洋地黄类药品效价测定方法，根据其效价与毒性呈平行关系的原理，比较标准品与供试品对动物的最小致死量以决定供试品效价的一种方法，目前《中国药典》（2015年版）介绍的是鸽法。2.

检定方法第三节洋地黄

（1）实验前的准备仪器：天平、离心机、振荡机、灌注装置等试剂：标准品及供试品溶液的制备动物：鸽子的挑选2.

检定方法第三节洋地黄

（2）实验步骤鸽子固定预备灌注装置插入不大于0.02ml滴定管相连的弯注射针头打开滴定管活塞，开始一次注入0.5ml，然后以0.2ml/min的等速连续注入，直至鸽死亡。2.

检定方法第三节洋地黄

（3）实验结果计算将每只鸽注入的稀释液的总量（ml）换算成每公斤体重的致死量（ml）所含的单位数（U/kg），取其10倍量的对数值作为反应值。将反应值按《中国药典》生物检定统计法列表的格式整理。按直接测定法计算M、R、PT、Sm、FL、FL%。以上计算也可编制程序，用计算机计算。2.

检定方法第三节洋地黄

（4）结果判定本法的可信限率（FL%）不得大于15%。实验误差（FL%）的判断，按药典规定，当FL%超过者，可做如下处理。①检验动物来源，实验操作等是否符合实验的要求。②重复实验。③增加每组实验动物以减小误差。2.

检定方法催产素第四节第四节催产素催产素是由下丘脑某些神经细胞合成以后从神经垂体分泌的多肽类激素，对子宫平滑肌有较强的兴奋作用，可引起子宫收缩。催产素系自健康猪、牛的脑神经垂体中提取分离精制或化学合成的由9个氨基酸组成的多肽化合物。1.

概述原理：根据催产素兴奋子宫平滑肌的作用，比较标准品（S）与供试品（T）引起离体大鼠子宫收缩的程度。根据其剂量与反应的两条平行直线关系，间接测定等反应