流式细胞术实验操作规范手册

流式细胞术实验操作规范手册一、实验前准备（一）试剂与耗材准备1.试剂核查：确认荧光抗体、固定液、破膜剂等试剂的有效期，避免使用过期或变质试剂。抗体需按说明书要求避光保存，使用前平衡至室温，轻柔混匀（避免剧烈振荡导致蛋白变性）。2.耗材预处理：提前清洗、灭菌流式管（或专用上样管），确保无残留去污剂或杂质；准备含1%BSA（或5%FBS）的PBS用于洗涤，BSA/FBS可封闭非特异性结合位点。（二）仪器与环境准备1.仪器状态检查：开机前检查流式细胞仪的液路系统（鞘液、废液桶液位）、激光状态（是否正常点亮）、喷嘴是否堵塞（可通过清水冲洗或低流速试运行判断）。2.环境控制：实验环境温度保持在20-25℃，避免强光直射仪器，防止荧光染料光漂白。（三）实验设计要点1.对照设置：需设置空白对照（仅细胞，无抗体）、同型对照（与一抗种属、亚型匹配的无关抗体）、阳性对照（已知阳性样本），用于确定阴性/阳性群体的界限。2.样本量规划：根据实验目的（如细胞周期、凋亡、表面标志物）计算所需细胞数，通常每管需1×10⁵-1×10⁶个细胞（避免细胞过多导致染色不均或仪器堵塞）。二、样本制备（一）细胞悬液制备1.贴壁细胞：弃培养基，用预温PBS轻柔冲洗2次，加入适量胰酶（含EDTA）消化（时间依细胞类型调整，通常2-5分钟），镜下观察细胞变圆后，加入含血清培养基终止消化，吹打至单细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃上清，PBS重悬。2.悬浮细胞/血液：直接离心（1000rpm，5分钟），弃上清，PBS重悬；血液样本可先经红细胞裂解液处理（如ACK裂解液，室温5分钟），再离心洗涤，获得单个核细胞。3.组织样本：剪碎组织后，用胶原酶/胰酶消化（37℃，30分钟-1小时），经200目滤网过滤，离心洗涤后重悬。（二）染色与固定1.表面染色：将细胞悬液调整至1×10⁶cells/mL，加入适量荧光抗体（体积依说明书，通常5-20μL），避光室温孵育15-30分钟；孵育后用含BSA的PBS洗涤2次（1000rpm，5分钟），弃上清。2.胞内染色（如细胞因子、核抗原）：需先固定（4%多聚甲醛室温15分钟），PBS洗涤后，加入破膜剂（如0.1%TritonX-100或专用破膜液）室温孵育10分钟，再进行胞内抗体染色（步骤同表面染色，注意抗体需适配破膜环境）。3.注意事项：全程避光操作，防止荧光染料淬灭；染色后尽快上机，若需保存，可加入少量PBS，4℃避光存放（不超过24小时）。三、仪器操作流程（一）开机与校准1.开机顺序：先开空气压缩机（若有），再开流式细胞仪主机，最后启动软件（如BDFACSDiva、FlowJo）；等待仪器自检完成（激光稳定、液路无泄漏）。2.校准：使用荧光微球（如BDCS&Tbeads）进行光路校准，确保FSC、SSC及各荧光通道的CV值在正常范围（通常<5%）；若校准失败，检查激光alignment或液流稳定性。（二）上样与数据采集1.样本上样：将染色后的细胞悬液缓慢加入流式管，避免产生气泡；插入上样架，设置流速（通常“低速”模式，____μL/min，细胞浓度高时可适当调快，但需避免液流压力过大导致细胞破碎）。2.参数设置：FSC/SSC：调节电压使细胞群体位于图中合适区域（如淋巴细胞在FSC低、SSC低区域，粒细胞FSC高、SSC高）。荧光通道：以同型对照为基准，调节电压使阴性群体的荧光强度集中在“阴性峰”，阳性群体与阴性群体有明显分离。3.数据采集：设定采集细胞数（通常1×10⁴-1×10⁵个细胞，依实验需求），开始采集，实时观察细胞群体的稳定性（如FSC/SSC散点图无异常聚集）。（三）关机与维护1.关机前处理：用清水或鞘液冲洗管路5-10分钟，清除残留样本；若使用了固定剂或强去污剂，需用专用清洗液（如10%次氯酸钠）冲洗管路（按仪器说明书操作）。2.关机顺序：先关闭软件，再关闭仪器主机，最后关闭空气压缩机；清空废液桶，补充鞘液（若长期不用，需排出管路中液体，防止微生物滋生）。四、数据分析与结果报告（一）数据导入与圈门策略1.软件操作：将采集的FCS文件导入分析软件（如FlowJo），先圈选“活细胞”群体（通过FSC/SSC或死活染料染色，如7-AAD、PI阴性为活细胞）。2.亚群分析：根据实验目的圈选目标亚群（如CD4⁺T细胞），分析其荧光标记的阳性率、平均荧光强度（MFI）等参数。（二）结果解读与统计1.阳性率计算：以同型对照的荧光强度峰值为阈值，统计目标群体中荧光强度超过阈值的细胞比例，即为阳性率。2.统计分析：重复实验（≥3次）后，用GraphPadPrism等软件进行统计，分析组间差异（如t检验、方差分析），结果以“均值±标准差（Mean±SD）”或“中位数（四分位距）”呈现，结合散点图/直方图展示。（三）报告撰写要点1.实验信息：注明样本类型、抗体克隆号、仪器型号、采集细胞数等。2.结果呈现：清晰展示圈门策略图（如FSC/SSC圈活细胞、荧光通道圈阳性群体）、统计图表，并描述关键发现（如“CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例在实验组显著高于对照组，P<0.05”）。五、常见问题与解决方案（一）样本相关问题1.细胞聚集：可能因消化过度（贴壁细胞）、未过滤（组织样本）或染色时未充分重悬导致。解决方案：消化后用滤网过滤，染色时轻柔吹打，或加入少量DNase（10-20μg/mL）降解DNA（细胞凋亡时易释放DNA导致聚集）。2.染色非特异性：可能因抗体浓度过高、封闭不足或破膜不充分（胞内染色）。解决方案：优化抗体浓度（做浓度梯度实验），增加BSA/FBS浓度（如5%FBS），延长封闭时间，确保破膜液充分穿透细胞膜。（二）仪器相关问题1.喷嘴堵塞：表现为FSC/SSC信号异常或流速不稳定。解决方案：用清水或鞘液高压冲洗（按仪器说明书操作），或拆卸喷嘴超声清洗（需专业人员操作）。2.荧光信号弱：可能因染料淬灭、抗体失效或激光功率不足。解决方案：染色后尽快上机，更换新抗体，检查激光功率（必要时联系工程师校准）。六、安全与维护规范（一）生物安全1.样本防护：处理血液、组织等生物样本时，佩戴手套、口罩，操作在生物安全柜内进行；实验后样本需高压灭菌或按医疗废弃物处理。2.化学试剂安全：多聚甲醛、破膜剂等有毒试剂需在通风橱内操作，废液收集后按化学废弃物处理（如多聚甲醛废液用NaOH处理后排放）。（二）仪器维护1.日常维护：每次实验后清洗管路，每周用70%乙醇冲洗管路（防止微生物污染），每月检查激光功率、液流压力。2.定期校准：每季度用标准微球校准仪器，每年联系厂家工程师进行全面维护（如激光alignment、液路检修）。（三）废弃物处理1.生物废弃物：细胞悬液、流式管等经121