微生物科室培养操作规范

微生物科室培养操作规范一、概述

微生物科室培养操作规范旨在确保微生物培养过程的标准化、安全化与高效化，适用于临床、科研及工业领域的微生物培养工作。本规范涵盖了培养前的准备、培养过程中的操作要点、培养后的处理及质量控制等关键环节，旨在降低污染风险，提高培养成功率，并为后续实验或临床应用提供可靠的数据支持。

二、培养前的准备

（一）环境要求

1.培养环境需保持洁净，温度控制在22±2℃，湿度控制在50±10%。

2.操作区域应使用超净工作台或生物安全柜，并定期进行紫外线消毒（30分钟/次，每日2次）。

3.空气流动需符合单向流要求，风速维持在0.5m/s左右。

（二）设备与耗材准备

1.培养设备：高压灭菌锅、培养箱、摇床、显微镜等。

2.耗材准备：

(1)培养基：根据需求选择合适的液体或固体培养基，如TSB、LB、麦康凯琼脂等。

(2)器皿：无菌培养皿、试管、三角瓶等，均需高压灭菌（121℃，15分钟）。

(3)个人防护：手套、实验服、口罩、护目镜等。

（三）样品处理

1.临床样品：需先进行初步处理，如离心、过滤等，去除杂质。

2.环境样品：用无菌棉签擦拭目标区域，将样本接种于适当培养基。

3.样品保存：未立即培养的样品需置于4℃冰箱保存，保存时间不超过24小时。

三、培养过程中的操作要点

（一）接种操作

1.无菌操作：在超净台内进行，接种前用75%酒精消毒双手及操作台面。

2.接种方法：

(1)液体样品：用移液器吸取1mL样品，接种至5mL液体培养基中。

(2)固体样品：用接种环挑取少量菌落，划线接种至琼脂平板上。

3.接种量控制：避免过量接种导致培养基过载，一般接种量不超过10^5CFU/mL。

（二）培养条件设置

1.液体培养：37℃恒温培养，180-200rpm摇床振荡，培养时间24-48小时。

2.固体培养：37℃恒温培养，培养时间根据菌种调整（如需氧菌24-48小时，厌氧菌36-72小时）。

3.特殊菌种：如分枝杆菌需在CO2培养箱（5%-10%CO2）中培养。

（三）培养期间监测

1.每日观察菌落生长情况，记录形态、颜色等变化。

2.菌液培养需定期检测浊度，避免过度生长影响实验结果。

3.发现污染需立即隔离并分析污染原因。

四、培养后的处理与质量控制

（一）结果判读

1.琼脂平板：根据菌落形态、颜色、溶血性等特征初步鉴定。

2.液体培养：显微镜观察菌体形态，结合生化试验进行确认。

3.阳性对照：每次培养需设置阳性对照，确保培养基活性。

（二）样品保存

1.纯培养物：用接种环挑取少量菌体，接种至冷冻保存管（含20%甘油），-80℃保存。

2.备用培养基：未使用完的培养基需密封冷藏，有效期不超过2周。

（三）废弃物处理

1.培养废弃物需先高压灭菌（121℃，15分钟），再按医疗废物规范处理。

2.实验台面用70%酒精擦拭消毒，并记录处理过程。

五、质量控制与记录

（一）质量控制

1.定期进行无菌实验，确保培养环境符合标准。

2.使用标准菌株进行验证，确保培养基与操作流程准确。

3.记录培养失败案例，分析原因并改进。

（二）记录要求

1.实验记录需详细记录样品信息、培养条件、结果及处理措施。

2.电子记录需备份，纸质记录需存档3年。

3.关键数据（如菌落计数）需双人核对。

六、注意事项

1.操作全程需严格遵循无菌原则，避免二次污染。

2.培养期间禁止频繁开关培养箱门，以免影响温度稳定性。

3.高压灭菌后器皿需自然冷却，不可强行通风。

**一、概述**

微生物科室培养操作规范旨在确保微生物培养过程的标准化、安全化与高效化，适用于临床、科研及工业领域的微生物培养工作。本规范涵盖了培养前的准备、培养过程中的操作要点、培养后的处理及质量控制等关键环节，旨在降低污染风险，提高培养成功率，并为后续实验或临床应用提供可靠的数据支持。

**二、培养前的准备**

**（一）环境要求**

1.培养环境需保持洁净，温度控制在22±2℃，湿度控制在50±10%。温度过高或过低均会影响微生物生长速度和代谢活动，需使用恒温设备（如恒温培养箱）进行调控。湿度控制则可通过除湿机或加湿器配合环境监测系统实现，以减少空气中水汽对无菌操作的干扰。

2.操作区域应使用超净工作台或生物安全柜，并定期进行紫外线消毒（30分钟/次，每日2次）。超净工作台在运行前需进行空气过滤系统检查（HEPA滤网清洁或更换），确保过滤效率达到99.97%。紫外灯消毒时，操作人员需离开工作区域，关闭柜门以避免暴露。

3.空气流动需符合单向流要求，风速维持在0.5m/s左右。风速过低可能导致空气停滞，增加污染风险；风速过高则可能扰动操作，影响接种精度。需定期使用风速仪检测工作区风速，确保其在规定范围内。

**（二）设备与耗材准备**

1.培养设备：

*高压灭菌锅：需配备压力、温度和时间显示装置，并定期进行性能验证（如使用生物指示剂测试灭菌效果）。操作时需遵循“先将物品放置于灭菌锅内，再加水并关闭锅门”的顺序，避免蒸汽直接冲击导致物品破损。

*培养箱：需定期校准温度传感器，确保实际温度与设定温度一致。箱内应放置温度记录仪，连续监测培养期间温度波动情况。

*摇床：转速需可精确调节，并定期使用转速计校准。振荡幅度不宜过大，一般控制在5-10cm范围内，以避免菌体损伤。

*显微镜：物镜和目镜需定期清洁，并使用标准玻片进行分辨率测试。

2.耗材准备：

***培养基**：

(1)液体培养基：如TSB（胰蛋白大豆肉汤）、TSB增菌液等，需检查包装完整性，溶解后使用无菌水定容至标示体积，并重新进行灭菌处理（如需）。

(2)固体培养基：如LB琼脂平板、麦康凯琼脂平板等，需检查有无霉变或沉淀，融化后需充分搅拌确保琼脂均匀溶解，冷却至45-50℃时倾倒平板，厚度控制在1.5-2mm。

(3)特殊培养基：如血琼脂平板（需检查血液是否凝固）、沙氏培养基（需确保成分准确）等，需根据具体要求准备，并注意无菌保存条件。

***器皿**：

(1)无菌培养皿：需检查底部有无裂纹，灭菌后平放于超净台内待用。

(2)无菌试管/三角瓶：管口或瓶口需用酒精灯火焰烧灼至微微发黄，以灭活表面微生物。管内液体培养基需使用无菌移液管或倾注法分装，避免污染。

***个人防护**：

(1)手套：操作前需用75%酒精对手部进行预处理，然后戴无菌手套。手套使用过程中需避免接触非无菌区域，一旦发现破损或污染需立即更换。

(2)实验服：需穿戴洁净实验服，扣好纽扣，避免外露皮肤。

(3)口罩/面屏：口罩需遮盖口鼻，面屏需覆盖整个面部。定期更换，至少每4小时更换一次或当其潮湿时立即更换。

(4)护目镜：操作过程中需佩戴护目镜，防止溅出的培养基或菌液损伤眼睛。

**（三）样品处理**

1.临床样品：

(1)根据样品类型（如痰液、尿液、脓液、血液等）选择合适的接种容器和培养基。

(2)痰液：需进行浓集处理，如使用NucleicAcidAmplificationTest（NAAT）前处理试剂盒进行裂解和过滤。

(3)尿液：需使用无菌尿杯收集，避免污染。若检测下尿路感染，需在1小时内接种；若检测上尿路感染，需进行增菌处理。

(4)脓液：需用无菌棉签蘸取脓液，或直接将脓液接种于血琼脂平板和巧克力琼脂平板。

(5)血液：需使用血培养瓶（需氧瓶、厌氧瓶），接种量一般不少于5mL，立即送检并尽快培养（ideallywithin4hoursofcollection）。

2.环境样品：

(1)用无菌棉签在目标区域（如操作台面、设备表面、环境表面）擦拭3次，旋转采样，然后将棉签放入含5mL无菌生理盐水的试管中，充分振荡混匀。

(2)对于水样，需用无菌容器收集，避免接触瓶口，带回实验室后根据需要稀释或直接接种。

3.样品保存：

(1)未立即培养的样品需置于4℃冰箱保存，不同类型样品保存时间不同：

*细菌培养：一般不超过24小时。

*病毒培养：需使用特定保存液（如含抗生素和血清），时间可延长至48小时。

*真菌培养：需使用沙氏葡萄糖液，时间可延长至72小时。

(2)需记录样品接收时间、类型、保存条件及预期保存期限。

**三、培养过程中的操作要点**

**（一）接种操作**

1.无菌操作：

(1)接种前30分钟开启超净工作台紫外灯进行照射消毒，操作前关闭紫外灯并打开通风。

(2)用75%酒精喷洒工作台面、设备表面及双手，待酒精挥发后再次进行手部消毒并戴手套。

(3)检查所有培养皿、试管等器皿是否在超净台内，避免中途取出引入污染。

2.接种方法：

(1)液体样品接种：

*使用无菌移液器吸取1mL样品，缓慢加入5mL液体培养基中，轻轻混匀。避免剧烈振荡导致气泡产生或菌体损伤。

*对于需氧菌，接种后需立即将培养瓶置于摇床上。

*对于厌氧菌，接种后需立即密封培养瓶并放入厌氧罐或使用厌氧袋培养。

(2)固体样品接种（琼脂平板）：

*左手持菌种试管（管口火焰灭菌），右手持接种环（环在火焰上烧至红热）。

*轻轻打开试管盖（倾斜45°，避免接触管口），用接种环在菌落表面轻轻划线（如四区划线法），或挑取单个菌落。

*将接种环再次火焰灭菌后关闭试管盖。

*左手持培养皿（皿盖打开呈60°），右手将带有菌种的接种环在皿内琼脂表面划线。划线时避免划破琼脂表面。

*划完后，将接种环再次火焰灭菌，盖上皿盖，将培养皿放回超净台内。

(3)固体样品接种（液体培养基）：

*使用无菌移液管，按上述液体样品接种方法进行。

3.接种量控制：

(1)避免接种过多导致培养基浑浊度过高，影响后续观察和计数。一般接种量控制在10^3-10^5CFU/mL范围内为宜。

(2)对于特殊菌种（如分枝杆菌），需精确控制接种量，并使用专用接种工具（如L型接种针）。

**（二）培养条件设置**

1.液体培养：

(1)将接种后的培养瓶放入37℃恒温培养箱中。

(2)对于需氧菌，设置摇床转速为180-200rpm，确保氧气充分溶解。

(3)对于兼性厌氧菌，可不通气培养。

(4)培养时间根据菌种和实验目的调整：

*一般细菌常规培养：24-48小时。

*厌氧菌：36-72小时（需无氧环境）。

*真菌：48-72小时（部分酵母菌可能更快）。

2.固体培养：

(1)将接种后的培养皿放入37℃恒温培养箱中，避免直接阳光照射。

(2)培养时间根据菌种调整：

*需氧菌：24-48小时。

*厌氧菌：36-72小时。

*分枝杆菌：初次培养需6-8周（需特殊CO2培养箱）。

3.特殊菌种培养：

(1)分枝杆菌：需在配备5%-10%CO2的专用培养箱中培养，并使用分枝杆菌专用培养基（如L-J琼脂）。

(2)真菌：部分真菌（如念珠菌）可在室温（25-28℃）培养，时间可能需延长至48-72小时。

(3)病毒：需在含有特定细胞培养液和血清的细胞培养瓶中培养，置于37℃CO2培养箱。

**（三）培养期间监测**

1.每日观察菌落生长情况，记录形态、颜色、大小、溶血性等特征。

(1)菌落形态：记录是光滑型还是粗糙型，是否有荚膜、鞭毛等特殊结构。

(2)菌落颜色：记录是白色、黄色、粉色、绿色、蓝色等，以及是否有沉淀物。

(3)溶血性：对于血琼脂平板，需观察是否有α溶血（绿色）、β溶血（透明）、γ溶血（无变化）。

2.菌液培养需定期检测浊度（使用分光光度计测定OD值），避免过度生长影响实验结果。

(1)OD值与菌浓度关系：一般OD600=1.0对应约10^8CFU/mL（大肠杆菌）。

(2)过度生长可能导致培养基成分消耗、pH值变化，影响后续实验（如药敏试验）。

3.发现污染需立即隔离并分析污染原因。

(1)污染表现：菌落形态异常、生长速度过快、培养基颜色改变等。

(2)处理措施：将污染培养物丢弃（需高压灭菌后再丢弃），并对污染源头（如设备、操作、环境）进行调查。

(3)预防措施：加强无菌操作培训、定期维护设备、改善环境等。

**四、培养后的处理与质量控制**

**（一）结果判读**

1.琼脂平板：根据菌落形态、颜色、溶血性等特征初步鉴定。

(1)创建菌落特征档案，包括典型照片、生长时间、生化反应等。

(2)对于可疑菌落，需进行纯化（划线分离）后再次观察。

2.液体培养：显微镜观察菌体形态，结合生化试验进行确认。

(1)显微镜检查：观察菌体是革兰氏阳性还是阴性，有无荚膜、芽孢、鞭毛等。

(2)生化试验：使用API系统、VITEK-2Compact等自动化系统或传统生化管进行鉴定。

3.阳性对照：每次培养需设置阳性对照，确保培养基活性。

(1)阳性对照菌株：通常选择已知典型菌株（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）。

(2)阳性对照结果：阳性菌株应在规定时间内形成典型菌落或显色反应。

**（二）样品保存**

1.纯培养物：用接种环挑取少量菌体，接种至冷冻保存管（含20%甘油），-80℃保存。

(1)冷冻保存液：除甘油外，可添加DMSO（二甲基亚砜）以提高抗冻性。

(2)保存前需确认菌株纯度，并进行革兰氏染色、镜检等验证。

2.备用培养基：未使用完的培养基需密封冷藏，有效期不超过2周。

(1)液体培养基：需用无菌塞密封，避免水分蒸发和污染。

(2)固体培养基：需用保鲜膜或铝箔封口，然后放入4℃冰箱。

**（三）废弃物处理**

1.培养废弃物需先高压灭菌（121℃，15分钟），再按医疗废物规范处理。

(1)高压灭菌：确保所有培养物（包括菌落、培养基残留）被彻底灭活。

(2)分类处理：根据废物类型（如感染性废物、普通废物）进行分类收集，贴上标签。

2.实验台面用70%酒精擦拭消毒，并记录处理过程。

(1)擦拭顺序：从清洁区向污染区擦拭，避免交叉污染。

(2)记录内容：包括消毒时间、消毒剂、操作人员等信息。

**五、质量控制与记录**

**（一）质量控制**

1.定期进行无菌实验，确保培养环境符合标准。

(1)无菌实验：每月至少进行1次，使用不含指示剂的空白培养基进行培养。

(2)结果判定：无菌实验培养物应为无菌生长，若有菌生长则需立即调查原因并采取纠正措施。

2.使用标准菌株进行验证，确保培养基与操作流程准确。

(1)标准菌株：如大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923等。

(2)验证项目：生长速度、典型菌落形态、生化反应等。

3.记录培养失败案例，分析原因并改进。

(1)失败案例记录：包括样品信息、培养条件、失败现象、分析原因等。

(2)改进措施：根据分析结果修订操作规程或设备维护计划。

**（二）记录要求**

1.实验记录需详细记录样品信息、培养条件、结果及处理措施。

(1)样品信息：包括样品编号、类型、接收时间、患者信息（如适用）等。

(2)培养条件：包括培养基类型、接种量、温度、CO2浓度、培养时间等。

(3)结果及处理：包括菌落观察结果、纯化过程、鉴定结果、保存措施等。

2.电子记录需备份，纸质记录需存档3年。

(1)电子记录：使用实验室信息管理系统（LIMS）或电子表格，定期进行系统备份。

(2)纸质记录：使用防水防墨记录本，按项目编号存档，并指定专人管理。

3.关键数据（如菌落计数）需双人核对。

(1)菌落计数：对于平板计数，需使用标准方法（如三区计数法）进行，并由第二人复核。

(2)数据准确性：确保计数结果用于后续实验（如药敏试验、载量测定）的可靠性。

**六、注意事项**

1.操作全程需严格遵循无菌原则，避免二次污染。

(1)无菌操作：所有接种、分装等操作均在超净工作台内进行，动作轻柔，避免气流扰动。

(2)无菌观念：进入实验室需更换鞋套，禁止佩戴饰品，长发需束起。

2.培养期间禁止频繁开关培养箱门，以免影响温度稳定性。

(1)开关频率：尽量减少开关次数，如需更换培养物，需快速操作并立即关闭。

(2)温度影响：频繁开关可能导致温度波动，影响生长曲线和实验结果。

3.高压灭菌后器皿需自然冷却，不可强行通风。

(1)冷却方式：灭菌结束后，保持锅盖关闭，待压力降至0后打开锅门，器皿自然冷却。

(2)强行通风危害：可能导致培养基沸腾溢出或玻璃器皿炸裂。

一、概述

微生物科室培养操作规范旨在确保微生物培养过程的标准化、安全化与高效化，适用于临床、科研及工业领域的微生物培养工作。本规范涵盖了培养前的准备、培养过程中的操作要点、培养后的处理及质量控制等关键环节，旨在降低污染风险，提高培养成功率，并为后续实验或临床应用提供可靠的数据支持。

二、培养前的准备

（一）环境要求

1.培养环境需保持洁净，温度控制在22±2℃，湿度控制在50±10%。

2.操作区域应使用超净工作台或生物安全柜，并定期进行紫外线消毒（30分钟/次，每日2次）。

3.空气流动需符合单向流要求，风速维持在0.5m/s左右。

（二）设备与耗材准备

1.培养设备：高压灭菌锅、培养箱、摇床、显微镜等。

2.耗材准备：

(1)培养基：根据需求选择合适的液体或固体培养基，如TSB、LB、麦康凯琼脂等。

(2)器皿：无菌培养皿、试管、三角瓶等，均需高压灭菌（121℃，15分钟）。

(3)个人防护：手套、实验服、口罩、护目镜等。

（三）样品处理

1.临床样品：需先进行初步处理，如离心、过滤等，去除杂质。

2.环境样品：用无菌棉签擦拭目标区域，将样本接种于适当培养基。

3.样品保存：未立即培养的样品需置于4℃冰箱保存，保存时间不超过24小时。

三、培养过程中的操作要点

（一）接种操作

1.无菌操作：在超净台内进行，接种前用75%酒精消毒双手及操作台面。

2.接种方法：

(1)液体样品：用移液器吸取1mL样品，接种至5mL液体培养基中。

(2)固体样品：用接种环挑取少量菌落，划线接种至琼脂平板上。

3.接种量控制：避免过量接种导致培养基过载，一般接种量不超过10^5CFU/mL。

（二）培养条件设置

1.液体培养：37℃恒温培养，180-200rpm摇床振荡，培养时间24-48小时。

2.固体培养：37℃恒温培养，培养时间根据菌种调整（如需氧菌24-48小时，厌氧菌36-72小时）。

3.特殊菌种：如分枝杆菌需在CO2培养箱（5%-10%CO2）中培养。

（三）培养期间监测

1.每日观察菌落生长情况，记录形态、颜色等变化。

2.菌液培养需定期检测浊度，避免过度生长影响实验结果。

3.发现污染需立即隔离并分析污染原因。

四、培养后的处理与质量控制

（一）结果判读

1.琼脂平板：根据菌落形态、颜色、溶血性等特征初步鉴定。

2.液体培养：显微镜观察菌体形态，结合生化试验进行确认。

3.阳性对照：每次培养需设置阳性对照，确保培养基活性。

（二）样品保存

1.纯培养物：用接种环挑取少量菌体，接种至冷冻保存管（含20%甘油），-80℃保存。

2.备用培养基：未使用完的培养基需密封冷藏，有效期不超过2周。

（三）废弃物处理

1.培养废弃物需先高压灭菌（121℃，15分钟），再按医疗废物规范处理。

2.实验台面用70%酒精擦拭消毒，并记录处理过程。

五、质量控制与记录

（一）质量控制

1.定期进行无菌实验，确保培养环境符合标准。

2.使用标准菌株进行验证，确保培养基与操作流程准确。

3.记录培养失败案例，分析原因并改进。

（二）记录要求

1.实验记录需详细记录样品信息、培养条件、结果及处理措施。

2.电子记录需备份，纸质记录需存档3年。

3.关键数据（如菌落计数）需双人核对。

六、注意事项

1.操作全程需严格遵循无菌原则，避免二次污染。

2.培养期间禁止频繁开关培养箱门，以免影响温度稳定性。

3.高压灭菌后器皿需自然冷却，不可强行通风。

**一、概述**

微生物科室培养操作规范旨在确保微生物培养过程的标准化、安全化与高效化，适用于临床、科研及工业领域的微生物培养工作。本规范涵盖了培养前的准备、培养过程中的操作要点、培养后的处理及质量控制等关键环节，旨在降低污染风险，提高培养成功率，并为后续实验或临床应用提供可靠的数据支持。

**二、培养前的准备**

**（一）环境要求**

1.培养环境需保持洁净，温度控制在22±2℃，湿度控制在50±10%。温度过高或过低均会影响微生物生长速度和代谢活动，需使用恒温设备（如恒温培养箱）进行调控。湿度控制则可通过除湿机或加湿器配合环境监测系统实现，以减少空气中水汽对无菌操作的干扰。

2.操作区域应使用超净工作台或生物安全柜，并定期进行紫外线消毒（30分钟/次，每日2次）。超净工作台在运行前需进行空气过滤系统检查（HEPA滤网清洁或更换），确保过滤效率达到99.97%。紫外灯消毒时，操作人员需离开工作区域，关闭柜门以避免暴露。

3.空气流动需符合单向流要求，风速维持在0.5m/s左右。风速过低可能导致空气停滞，增加污染风险；风速过高则可能扰动操作，影响接种精度。需定期使用风速仪检测工作区风速，确保其在规定范围内。

**（二）设备与耗材准备**

1.培养设备：

*高压灭菌锅：需配备压力、温度和时间显示装置，并定期进行性能验证（如使用生物指示剂测试灭菌效果）。操作时需遵循“先将物品放置于灭菌锅内，再加水并关闭锅门”的顺序，避免蒸汽直接冲击导致物品破损。

*培养箱：需定期校准温度传感器，确保实际温度与设定温度一致。箱内应放置温度记录仪，连续监测培养期间温度波动情况。

*摇床：转速需可精确调节，并定期使用转速计校准。振荡幅度不宜过大，一般控制在5-10cm范围内，以避免菌体损伤。

*显微镜：物镜和目镜需定期清洁，并使用标准玻片进行分辨率测试。

2.耗材准备：

***培养基**：

(1)液体培养基：如TSB（胰蛋白大豆肉汤）、TSB增菌液等，需检查包装完整性，溶解后使用无菌水定容至标示体积，并重新进行灭菌处理（如需）。

(2)固体培养基：如LB琼脂平板、麦康凯琼脂平板等，需检查有无霉变或沉淀，融化后需充分搅拌确保琼脂均匀溶解，冷却至45-50℃时倾倒平板，厚度控制在1.5-2mm。

(3)特殊培养基：如血琼脂平板（需检查血液是否凝固）、沙氏培养基（需确保成分准确）等，需根据具体要求准备，并注意无菌保存条件。

***器皿**：

(1)无菌培养皿：需检查底部有无裂纹，灭菌后平放于超净台内待用。

(2)无菌试管/三角瓶：管口或瓶口需用酒精灯火焰烧灼至微微发黄，以灭活表面微生物。管内液体培养基需使用无菌移液管或倾注法分装，避免污染。

***个人防护**：

(1)手套：操作前需用75%酒精对手部进行预处理，然后戴无菌手套。手套使用过程中需避免接触非无菌区域，一旦发现破损或污染需立即更换。

(2)实验服：需穿戴洁净实验服，扣好纽扣，避免外露皮肤。

(3)口罩/面屏：口罩需遮盖口鼻，面屏需覆盖整个面部。定期更换，至少每4小时更换一次或当其潮湿时立即更换。

(4)护目镜：操作过程中需佩戴护目镜，防止溅出的培养基或菌液损伤眼睛。

**（三）样品处理**

1.临床样品：

(1)根据样品类型（如痰液、尿液、脓液、血液等）选择合适的接种容器和培养基。

(2)痰液：需进行浓集处理，如使用NucleicAcidAmplificationTest（NAAT）前处理试剂盒进行裂解和过滤。

(3)尿液：需使用无菌尿杯收集，避免污染。若检测下尿路感染，需在1小时内接种；若检测上尿路感染，需进行增菌处理。

(4)脓液：需用无菌棉签蘸取脓液，或直接将脓液接种于血琼脂平板和巧克力琼脂平板。

(5)血液：需使用血培养瓶（需氧瓶、厌氧瓶），接种量一般不少于5mL，立即送检并尽快培养（ideallywithin4hoursofcollection）。

2.环境样品：

(1)用无菌棉签在目标区域（如操作台面、设备表面、环境表面）擦拭3次，旋转采样，然后将棉签放入含5mL无菌生理盐水的试管中，充分振荡混匀。

(2)对于水样，需用无菌容器收集，避免接触瓶口，带回实验室后根据需要稀释或直接接种。

3.样品保存：

(1)未立即培养的样品需置于4℃冰箱保存，不同类型样品保存时间不同：

*细菌培养：一般不超过24小时。

*病毒培养：需使用特定保存液（如含抗生素和血清），时间可延长至48小时。

*真菌培养：需使用沙氏葡萄糖液，时间可延长至72小时。

(2)需记录样品接收时间、类型、保存条件及预期保存期限。

**三、培养过程中的操作要点**

**（一）接种操作**

1.无菌操作：

(1)接种前30分钟开启超净工作台紫外灯进行照射消毒，操作前关闭紫外灯并打开通风。

(2)用75%酒精喷洒工作台面、设备表面及双手，待酒精挥发后再次进行手部消毒并戴手套。

(3)检查所有培养皿、试管等器皿是否在超净台内，避免中途取出引入污染。

2.接种方法：

(1)液体样品接种：

*使用无菌移液器吸取1mL样品，缓慢加入5mL液体培养基中，轻轻混匀。避免剧烈振荡导致气泡产生或菌体损伤。

*对于需氧菌，接种后需立即将培养瓶置于摇床上。

*对于厌氧菌，接种后需立即密封培养瓶并放入厌氧罐或使用厌氧袋培养。

(2)固体样品接种（琼脂平板）：

*左手持菌种试管（管口火焰灭菌），右手持接种环（环在火焰上烧至红热）。

*轻轻打开试管盖（倾斜45°，避免接触管口），用接种环在菌落表面轻轻划线（如四区划线法），或挑取单个菌落。

*将接种环再次火焰灭菌后关闭试管盖。

*左手持培养皿（皿盖打开呈60°），右手将带有菌种的接种环在皿内琼脂表面划线。划线时避免划破琼脂表面。

*划完后，将接种环再次火焰灭菌，盖上皿盖，将培养皿放回超净台内。

(3)固体样品接种（液体培养基）：

*使用无菌移液管，按上述液体样品接种方法进行。

3.接种量控制：

(1)避免接种过多导致培养基浑浊度过高，影响后续观察和计数。一般接种量控制在10^3-10^5CFU/mL范围内为宜。

(2)对于特殊菌种（如分枝杆菌），需精确控制接种量，并使用专用接种工具（如L型接种针）。

**（二）培养条件设置**

1.液体培养：

(1)将接种后的培养瓶放入37℃恒温培养箱中。

(2)对于需氧菌，设置摇床转速为180-200rpm，确保氧气充分溶解。

(3)对于兼性厌氧菌，可不通气培养。

(4)培养时间根据菌种和实验目的调整：

*一般细菌常规培养：24-48小时。

*厌氧菌：36-72小时（需无氧环境）。

*真菌：48-72小时（部分酵母菌可能更快）。

2.固体培养：

(1)将接种后的培养皿放入37℃恒温培养箱中，避免直接阳光照射。

(2)培养时间根据菌种调整：

*需氧菌：24-48小时。

*厌氧菌：36-72小时。

*分枝杆菌：初次培养需6-8周（需特殊CO2培养箱）。

3.特殊菌种培养：

(1)分枝杆菌：需在配备5%-10%CO2的专用培养箱中培养，并使用分枝杆菌专用培养基（如L-J琼脂）。

(2)真菌：部分真菌（如念珠菌）可在室温（25-28℃）培养，时间可能需延长至48-72小时。

(3)病毒：需在含有特定细胞培养液和血清的细胞培养瓶中培养，置于37℃CO2培养箱。

**（三）培养期间监测**

1.每日观察菌落生长情况，记录形态、颜色、大小、溶血性等特征。

(1)菌落形态：记录是光滑型还是粗糙型，是否有荚膜、鞭毛等特殊结构。

(2)菌落颜色：记录是白色、黄色、粉色、绿色、蓝色等，以及是否有沉淀物。

(3)溶血性：对于血琼脂平板，需观察是否有α溶血（绿色）、β溶血（透明）、γ溶血（无变化）。

2.菌液培养需定期检测浊度（使用分光光度计测定OD值），避免过度生长影响实验结果。

(1)OD值与菌浓度关系：一般OD600=1.0对应约10^8CFU/mL（大肠杆菌）。

(2)过度生长可能导致培养基成分消耗、pH值变化，影响后续实验（如药敏试验）。

3.发现污染需立即隔离并分析污染原因。

(1)污染表现：菌落形态异常、生长速度过快、培养基颜色改变等。

(2)处理措施：将污染培养物丢弃（需高压灭菌后再丢弃），并对污染源头（如设备、操作、环境）进行调查。

(3)预防措施：加强无菌操作培训、定期维护设备、改善环境等。

**四、培养后的处理与质量控制**

**（一）结果判读**

1.琼脂平板：根据菌落形态、颜色、溶血性等特征初步鉴定。

(1)创建菌落特征档案，包括典型照片、生长时间、生化反应等。

(2)对于可疑菌落，需进行纯化（划线分离）后再次观察。

2.液体培养：显微镜观察菌体形态，结合生化试验进行确认。

(1)显微镜检查：观察菌体是革兰氏阳性还是阴性，有无荚膜、芽孢、鞭毛等。

(2)生化试验：使用API系统、VITEK-2Compact等自动化系统或传统生化管进行鉴定。

3.阳性对照：每次培养需设置阳性对照，确保培养基活性。

(1)阳性对照菌株：通常选择已知典型菌株（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）。

(2)阳性对照结果：阳性菌株应在规定时间内形成典型菌落或显色反应。

**（二）样品保存**

1.纯培养物：用接种环挑取少量菌体，接种至冷冻保存管（含20%甘油），-80℃保存。

(1)冷冻