DB54∕T 0449-2025 藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌三重实时荧光定量PCR检测技术规范

ICS65.020.30

CCSB41

54

西藏自治区地方标准

DB54/T0449—2025

藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜

肺炎放线杆菌三重实时荧光定量PCR检测

技术规范

2025-05-10发布2025-06-10实施

西藏自治区市场监督管理局  发布

DB54/T0449—2025

目次

前言..................................................................................II

1范围................................................................................1

2规范性引用文件......................................................................1

3术语和定义..........................................................................1

4缩略语..............................................................................1

5仪器和设备..........................................................................2

6试剂和耗材..........................................................................2

7样品采集和处理......................................................................2

8核酸提取............................................................................3

9三重实时荧光定量PCR检测............................................................3

10结果判定...........................................................................3

11生物安全措施.......................................................................4

附录A（规范性）培养基及溶液配置......................................................5

附录B（规范性）阳性质粒的构建........................................................6

附录C（规范性）荧光定量引物、Taqman探针名称及序列...................................7

附录D（规范性）荧光定量PCR反应体系及条件............................................8

I

DB54/T0449—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。

本文件起草单位：西藏农牧学院、江苏农牧科技职业学院、泰州市姜堰区三水街道畜牧兽医站、昌

都市畜牧总站。

本文件主要起草人：罗润波、封琦、吴双、朱勇、韦创创、朱善元、商鹏、郑凯毅、普布扎西、赵

红阳、李沛明、张辉、拜占春、韦明邦、李可欣、钟亚男、石斌。

II

DB54/T0449—2025

藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌三重实时

荧光定量PCR检测技术规范

1范围

本文件规定了藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌三重实时荧光定量PCR检测

方法的仪器和设备、试剂和耗材、样品采集和处理、核酸提取、三重实时荧光定量PCR检测、结果判定、

生物安全措施等要求。

本文件适用于藏猪肺部组织、鼻腔或上呼吸道气管分泌物中的副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸

膜肺炎放线杆菌的定性及定量检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则

SN/T4835实验室生物废弃物管理要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

实时荧光定量PCR

指在PCR反应体系中加入荧光基团、利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，实现对未知模板的定

性及定量分析。

3.2

循环阈值

是每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

HPS：副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis）。

PM：多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）。

APP：胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae）。

BHQ1：黑洞淬灭剂-1（BlackHoleQuencher-1）。

1

DB54/T0449—2025

BHQ2：黑洞淬灭剂-2（BlackHoleQuencher-2）。

FAM：一种在荧光定量PCR中常用的荧光探针（FluoresceinAmidite）。

CY5：一种在荧光定量PCR中常用的荧光探针（Cyanine5）。

VIC：一种在荧光定量PCR中常用的荧光探针（ViewItCompounds）。

FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）。

NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NicotinamideAdenineDinucleotide）。

ROX：一种惰性参比染料（6-Carboxy-X-Rhodamine）。

Taqman探针：一种双标记的寡核苷酸水解探针（TaqmanProbe）。

TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液（Tris-EDTAbuffer）。

TSB：胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TrypticaseSoyBroth）。

ddH2O：双蒸水（DoubleDistilledWater）。

5仪器和设备

荧光定量PCR仪、高速台式冷冻离心机、高压灭菌锅、生物安全柜、分析天平、各型号微量移液器、

容量瓶、气浴恒温振荡器等。

6试剂和耗材

除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T6682的要求。

a)商品化FBS。

b)NAD贮存液配制，见附录A。

c)增菌培养液配制，见附录A。

d)2×PerfectStart®IIProbeqPCRSuperMixUDG，也可选择其他商品化2×荧光定量PCR

预混液。

e)50×PassiveReferenceDye，也可选择其他商品化50×ROX参比染料。

f)EASYDilution（forRealTimePCR，TakaraClontech），也可选择其他用于荧光定量PCR

的商品化DNA稀释液。

g)阳性质粒，见附录B。

h)阴性对照为无菌ddH2O。

i)商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒。

j)引物及Taqman探针，见附录C。

k)无菌0.2mL荧光定量PCR管或八联管及各种规格微量移液器吸头。

l)无菌1.5mL棕色避光离心管。

m)10mL一次性摇菌管。

7样品采集和处理

7.1采样工具

下列采样工具适用于本文件。

a)剪刀、镊子、手术刀，经121℃，30min高压蒸汽灭菌并烘干。

b)无菌采样拭子、采样管为一次性用品。

2

DB54/T0449—2025

7.2样品采集

7.2.1组织样品

用灭菌器械，剪取典型病变的肺部新鲜组织，样品量≥5g，于无菌的采样管中编号保存。

7.2.2棉拭子样品

将无菌棉拭子经PBS湿润后插入藏猪鼻腔内2cm～3cm处，并轻轻旋转3次～5次，折断后浸泡于盛有

2.5mL增菌培养基的一次性摇菌管中。

7.3样品保存与运输

上述采集的样品应立即进行检测。不能立即检测的样品，在4℃条件下保存不超过24h，-20℃条件

下保存不超过1个月，-80℃以下条件保存不超过6个月。样品采用低温运输，符合NY/T541的有关规定。

7.4样品处理

7.4.1组织样品处理

取0.5g～1g的组织，将样品接种到盛有2.5mL增菌培养基的一次性摇菌管中，将摇菌管置于37℃，

210r/min，恒温震荡培养16h～24h。

7.4.2棉拭子样品处理

吸取7.2.2中混有棉拭子样品的培养基100μL，接种到盛有2.5mL增菌培养基的一次性摇菌管中，将

摇菌管置于37℃，210r/min，恒温震荡培养16h～24h。

8核酸提取

取7.4中的增菌培养物制备样品DNA，DNA提取采用商品化革兰氏阴性菌DNA提取试剂盒或通用型基因

组DNA提取试剂盒，具体操作步骤参照所选用的试剂盒说明书。

9三重实时荧光定量PCR检测

三重荧光定量PCR反应体系及条件，见附录D。

10结果判定

10.1阈值设定

阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点

为准。

10.2质控标准

下列质控标准适用于本文件。

a)阴性对照品无Ct值或无典型扩增曲线。

b)阳性对照品的Ct值均≤35，扩增曲线明显呈对数增长。

c)检测结果判定需同时满足以上两个条件，否则本次检测无效。

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DB54/T0449—2025

10.3样品判定

下列样品判定适用于本文件。

a)若被检测样品检测结果Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，判定为阳性。

b)若被检测样品检测结果无Ct值或无典型的扩增曲线，判定为阴性。

c)若被检样品检测结果Ct值＞35，且出现典型扩增曲线的样品，判定为可疑，应重复试

验。重复试验结果中Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，判定为阳性，否则判定为阴性。

11生物安全措施

本文件中样品的采集、处理、保存、运输、检测和废弃物处理等涉及到的生物安全措施，按照GB19489、

NY/T541、NY/T1948、SN/T4835等要求进行。

4

DB54/T0449—2025

A

A

附录A

（规范性）

培养基及溶液配置

A.1NAD贮存液的配制

称取1gNAD溶解于100mLddH2O中，充分摇匀溶解后，用0.22μm的细菌滤器过滤，分装于无菌离心

管中，置-20℃保存备用。

A.2增菌培养液的配制

a)称取TSB30g，加入949mLddH2O，加热至充分溶解后摇匀，121℃高压蒸汽灭菌15min，

4℃条件下保存。

b)使用前，加入50mL无菌的FBS和1mL过滤除菌的1%NAD。

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DB54/T0449—2025

B

B

附录B

（规范性）

阳性质粒的构建

B.1HPS阳性对照

由NCBI数据库参考菌株YHP1818（Genebank：GCF_017352235.1）的infB基因保守序列构建的阳性质

粒pUC57-infB。

B.2PM阳性对照：

由NCBI数据库参考菌株FDAARGOS_218（Genebank：GCA_002073255.2）的kmt1基因保守序列构建的

阳性质粒pUC57-kmt1。

B.3APP阳性对照：

由NCBI数据库参考菌株NCTC10976（Genebank：GCF_900638445.1）的apxⅣ基因保守序列构建的阳

性质粒pUC57-apxⅣ。

B.4工作浓度

阳性质粒工作浓度为103～105copies/μL。

6

DB54/T0449—2025

C

C

附录C

（规范性）

荧光定量引物、Taqman探针名称及序列

表C.1荧光定量引物、Taqman探针名称及序列

检测靶标名称序列

上游引物5′-AGCTGACGATGGCGTAATG-3′

HPS下游引物5′-CACGCTCTAGGTTTGCTTCT-3′

Taqman探针5′-FAM-CCATTGAAGCAATCCAACACGCGAAAG-BHQ1-3′

上游引物5′-TTGTGGCAAAGAAAAGCACAGT-3′

PM下游引物5′-TCAGTTGCGCCGTTGTCA-3′

Taqman探针5′-VIC-CACACCAAACTCTGCCCA-BHQ1-3′

上游引物5′-GGTATCGGTGGAACGGTAAAC-3′

APP下游引物5′-CTTTCGCCGCATTCACTAAAC-3′

Taqman探针5′-CY5-CTTAACTTTACCGGCGAGGTGGAAACC-BHQ2-3′

7

DB54/T0449-2025

D

D

附录D

（规范性）

荧光定量PCR反应体系及条件

表D.1荧光定量PCR反应体系及条件

名称25μL反应体系工作浓度

2×PerfectStart®IIProbeqPCRSuperMix

成分112.5μL2×

UDG

成分2HPS引物F0.6μL10μmol/L

成分3HPS引物R0.6μL10μmol/L

成分4HPSTaqman探针0.7μL10μmol/L

成分5PM引物F0.7μL10μmol/L

成分6PM引物R