大鼠椎间盘：生理性与针刺退变的多维度比较探究

大鼠椎间盘：生理性与针刺退变的多维度比较探究一、引言1.1研究背景与意义腰椎间盘退变疾病作为一种常见的脊柱疾病，严重影响着人们的健康和生活质量。据统计，在成年人群中，下腰痛的患病率可达12%，而腰椎间盘退变及其继发的一系列疾病，如腰椎间盘突出症、椎间盘源性疼痛、腰椎管狭窄症及退变性腰椎滑脱症等，被公认为是导致下腰痛的主要原因。随着社会老龄化的加剧以及人们生活方式的改变，腰椎间盘退变疾病的发病率呈上升趋势，给社会和家庭带来了沉重的负担。目前，对于腰椎间盘退变疾病的治疗方法主要包括保守治疗和手术治疗。保守治疗如药物治疗、物理治疗、康复训练等，适用于病情较轻的患者，但对于病情严重的患者，手术治疗往往是必要的选择。然而，手术治疗存在一定的风险和并发症，且术后恢复时间较长。因此，深入研究腰椎间盘退变的发病机制，寻找有效的治疗方法，具有重要的临床意义。大鼠作为一种常用的实验动物，具有易于获得、饲养成本低、繁殖周期短等优点，在椎间盘退变研究中得到了广泛应用。通过建立大鼠椎间盘退变模型，可以模拟人类椎间盘退变的生理和病理过程，为研究椎间盘退变的发病机制和治疗方法提供重要的实验依据。在大鼠椎间盘退变研究中，生理性退变和针刺退变是两种常见的研究模型。生理性退变是指随着年龄的增长，椎间盘自然发生的退变过程；而针刺退变则是通过人为穿刺纤维环等方法，诱导椎间盘发生退变。了解这两种退变模型的异同点，有助于深入认识椎间盘退变的机制，为临床治疗提供更有针对性的理论支持。1.2国内外研究现状在椎间盘退变的研究领域，国内外学者针对大鼠模型展开了大量研究，旨在揭示其发病机制并寻找有效的治疗策略。在生理性退变方面，国外研究起步较早，通过对不同年龄段大鼠椎间盘的长期观察，发现随着年龄增长，大鼠椎间盘内的水分含量逐渐减少，这是由于髓核细胞分泌功能下降，导致蛋白多糖合成减少，水分保留能力降低。同时，Ⅱ型胶原的表达也显著降低，其作为维持椎间盘结构稳定的关键成分，含量减少会致使椎间盘的力学性能下降，纤维环更容易出现裂隙和损伤。此外，细胞凋亡相关基因的表达上调，引发髓核细胞和纤维环细胞凋亡增加，进一步加速了椎间盘的退变进程。国内研究则从中医理论和整体观念出发，深入探讨了环境因素和生活方式对大鼠椎间盘生理性退变的影响。研究发现，长期处于潮湿寒冷环境或过度劳累的大鼠，椎间盘退变程度明显加重，这可能与炎症因子的释放和血液循环障碍有关。而且，通过对大鼠椎间盘退变过程中中医证候的观察，发现其与人类的肾虚、血瘀等证候具有一定的相似性，为中医治疗椎间盘退变提供了理论依据。在针刺退变方面，国外主要聚焦于穿刺技术的改进和优化，以提高模型的稳定性和可重复性。采用高精度的穿刺设备和标准化的操作流程，能够更精准地控制穿刺深度和角度，减少对周围组织的损伤。同时，利用先进的影像学技术和分子生物学检测手段，深入研究针刺退变过程中椎间盘的微观结构变化和分子机制，发现针刺可导致椎间盘内炎症反应加剧，炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等释放增加，这些炎症因子会进一步破坏细胞外基质，诱导细胞凋亡，从而促进椎间盘退变。国内研究则着重于针刺退变模型在中医药研究中的应用，通过观察中药、针灸等干预措施对针刺退变模型的影响，探索中医药治疗椎间盘退变的作用机制。研究表明，一些中药提取物如淫羊藿苷、丹参酮等，能够抑制炎症反应，促进细胞外基质合成，从而延缓椎间盘退变。针灸治疗也可通过调节神经内分泌系统，改善局部血液循环，减轻炎症反应，对针刺退变模型具有一定的治疗作用。尽管国内外在大鼠椎间盘生理性和针刺退变方面取得了一定成果，但仍存在不足之处。一方面，对于两种退变模型在分子机制层面的差异研究还不够深入，尤其是在信号通路的交互作用和关键调控因子的作用机制方面，尚有待进一步探索。另一方面，目前的研究多集中在单一因素对椎间盘退变的影响，而在实际情况中，椎间盘退变往往是多种因素共同作用的结果，因此，如何综合考虑多种因素，建立更符合临床实际的复合模型，也是未来研究需要解决的问题。1.3研究目的与方法本研究旨在通过对大鼠椎间盘生理性退变和针刺退变模型的对比分析，深入探讨两种退变模型在组织形态学、细胞生物学以及分子生物学等方面的异同点，为揭示椎间盘退变的发病机制提供更全面的理论依据，同时为临床治疗腰椎间盘退变疾病提供更具针对性的治疗策略。在实验动物选择上，选用健康成年SD大鼠，其具有遗传背景清晰、生长繁殖快、对实验环境适应性强等优点，能够满足本研究对实验动物数量和质量的要求。将大鼠随机分为生理性退变组、针刺退变组和正常对照组，每组设置足够数量的样本，以确保实验结果的可靠性和统计学意义。对于生理性退变组，让大鼠自然生长至特定年龄阶段，模拟人类椎间盘随着年龄增长而发生的自然退变过程。在此过程中，给予大鼠常规的饲养环境和饮食条件，定期监测大鼠的生长发育情况，确保其健康状态。针刺退变组则采用纤维环穿刺法建立椎间盘退变模型。具体操作如下：在无菌条件下，将大鼠麻醉后固定于手术台上，暴露腰椎间盘。使用21G穿刺针平行于软骨终板进针，穿刺深度精确控制在一定范围内，穿刺成功后旋转穿刺针360°，并停留15-30秒后拔出，以确保对纤维环造成有效的损伤，从而诱导椎间盘退变。术后对大鼠进行精心护理，观察其恢复情况，预防感染等并发症的发生。正常对照组的大鼠不进行任何处理，仅给予与其他两组相同的饲养环境和护理，作为实验的参照标准，用于对比分析生理性退变组和针刺退变组的各项指标变化。为全面评估椎间盘退变的程度和特征，本研究选取了多种观察指标。在影像学方面，采用X线和磁共振成像（MRI）技术，定期对大鼠椎间盘进行扫描。X线可直观地观察椎间隙高度的变化，椎间隙高度降低是椎间盘退变的重要影像学表现之一；MRI则能够清晰地显示椎间盘的内部结构，如髓核、纤维环和软骨终板的形态和信号变化，通过测量T2加权像上椎间盘的信号强度，可评估椎间盘的含水量和退变程度，信号强度降低通常提示椎间盘退变。在组织学方面，对大鼠椎间盘进行苏木精-伊红（HE）染色和免疫组织化学染色。HE染色可观察椎间盘组织的形态结构变化，如髓核细胞的数量和形态、纤维环的排列情况、软骨终板的完整性等；免疫组织化学染色则用于检测特定蛋白的表达，如Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶（MMPs）等，Ⅱ型胶原是椎间盘细胞外基质的重要组成部分，其表达减少与椎间盘退变密切相关，而MMPs的表达增加则可导致细胞外基质的降解，加速椎间盘退变。在分子生物学方面，运用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术检测相关基因的表达水平，如炎症因子基因（TNF-α、IL-1β等）、细胞凋亡相关基因（Bax、Bcl-2等）。炎症因子的释放可引发炎症反应，破坏椎间盘的微环境，促进退变的发生；细胞凋亡相关基因的表达失衡则可导致髓核细胞和纤维环细胞凋亡增加，影响椎间盘的正常功能。在实验数据的统计分析方面，采用SPSS统计软件进行数据分析。对计量资料进行正态性检验和方差齐性检验，若数据符合正态分布且方差齐性，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较各组之间的差异，若存在组间差异，则进一步采用LSD法或Dunnett's法进行两两比较；对于不符合正态分布或方差不齐的数据，采用非参数检验（如Kruskal-Wallis秩和检验）进行分析。计数资料则采用χ²检验进行比较。以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准，确保实验结果的准确性和可靠性。二、大鼠椎间盘生理性退变2.1生理性退变的过程2.1.1不同年龄段特征在幼年时期，大鼠椎间盘呈现出旺盛的生长发育态势。髓核富含水分，其中的脊索细胞数量众多且活力充沛，它们呈圆形或椭圆形，细胞核大而清晰，细胞质丰富，具备强大的分裂增殖能力和合成代谢功能，能够高效地分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原等细胞外基质成分。此时，纤维环的胶原纤维排列紧密且规则，纤维细胞形态较为单一，以成熟的纤维细胞为主，细胞间连接紧密，共同维持着椎间盘的结构稳定性。软骨终板则相对较厚，软骨细胞排列整齐，细胞代谢活跃，能够有效地为椎间盘提供营养物质，保障其正常的生理功能。随着大鼠进入成年期，椎间盘的生长发育逐渐趋于稳定，但也悄然开始了退变的进程。髓核中的水分含量开始缓慢下降，脊索细胞数量逐渐减少，部分脊索细胞发生形态改变，出现老化迹象，其合成代谢功能也有所减弱，导致蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成量逐渐减少。与此同时，纤维环中的胶原纤维开始出现轻微的降解和重塑，纤维细胞的活性也有所降低，细胞间的连接变得相对疏松，这使得纤维环的力学性能稍有下降。软骨终板的厚度略有变薄，软骨细胞的代谢活性也有所降低，营养物质的供应能力受到一定影响，椎间盘的整体功能开始出现轻度衰退。当大鼠步入老年期，椎间盘的退变进程明显加速。髓核中的水分大量丢失，导致其体积明显缩小，弹性显著降低，髓核组织变得更加致密，且形态不规则。脊索细胞数量锐减，大部分脊索细胞发生凋亡或坏死，取而代之的是大量的软骨样细胞，这些软骨样细胞的功能相对较弱，无法有效地维持髓核的正常结构和功能。蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量大幅下降，进一步破坏了髓核的生物力学特性。纤维环的胶原纤维发生严重的降解和断裂，排列紊乱无序，纤维细胞数量减少，纤维环的强度和稳定性大幅降低，容易出现裂隙和破裂，进而导致髓核突出。软骨终板严重变薄，软骨细胞大量凋亡，钙化现象明显，营养物质的运输受到极大阻碍，椎间盘的退变程度已较为严重，严重影响了其正常的生理功能。2.1.2随时间发展规律从整体上看，大鼠椎间盘的退变是一个随年龄增长而渐进的过程，在形态、结构和功能上均呈现出明显的变化规律。在形态方面，幼年时椎间盘的高度相对较高，椎间隙较为宽阔，这为椎间盘提供了充足的活动空间和良好的缓冲能力。随着年龄的增长，椎间盘逐渐失水，髓核体积缩小，导致椎间隙高度逐渐降低。在影像学检查中，X线片上可清晰地观察到椎间隙变窄的现象，这是椎间盘退变的一个重要形态学特征。当退变进一步发展，纤维环出现破裂，髓核突出，可导致脊柱的形态发生改变，如脊柱侧弯、后凸畸形等，严重影响脊柱的正常生理曲度。在结构方面，椎间盘的内部结构逐渐发生改变。髓核的细胞组成和细胞外基质成分发生显著变化，脊索细胞被软骨样细胞替代，蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量减少，使得髓核的凝胶状结构被破坏，逐渐失去了原有的弹性和缓冲能力。纤维环的胶原纤维排列从整齐有序变得紊乱无序，纤维环的完整性受到破坏，容易出现裂隙和分层现象，这使得纤维环对髓核的约束能力下降，增加了髓核突出的风险。软骨终板的钙化和变薄，破坏了其与椎体之间的正常连接和营养供应关系，进一步加剧了椎间盘的退变。在功能方面，椎间盘的退变导致其力学性能逐渐下降。幼年时，椎间盘能够有效地缓冲脊柱的压力和冲击力，维持脊柱的稳定性和正常运动功能。随着退变的发生，椎间盘的弹性和抗压能力降低，无法有效地分散和缓冲脊柱所承受的载荷，导致脊柱的应力分布不均，容易引起椎体骨质增生、小关节退变等继发性改变，进而导致腰部疼痛、活动受限等临床症状的出现。同时，椎间盘退变还可能影响神经功能，当髓核突出压迫周围的神经根或脊髓时，可引起下肢放射性疼痛、麻木、无力等神经症状，严重影响大鼠的生活质量和运动能力。2.2退变机制2.2.1细胞层面变化在大鼠椎间盘生理性退变过程中，细胞层面发生了一系列显著变化，这些变化对椎间盘的结构和功能产生了深远影响。髓核细胞作为髓核的主要细胞成分，在退变过程中其增殖能力逐渐下降。研究表明，随着年龄的增长，髓核细胞进入细胞周期的比例减少，S期细胞的数量明显降低，这意味着细胞的DNA合成和分裂活动受到抑制，导致髓核细胞的更新速度减慢。同时，细胞凋亡现象逐渐增多，凋亡相关基因Bax的表达上调，而抗凋亡基因Bcl-2的表达下调，使得Bax/Bcl-2比值升高，从而诱导髓核细胞凋亡。此外，髓核细胞的分化也发生改变，脊索细胞逐渐被软骨样细胞替代，软骨样细胞虽然能够分泌一定量的细胞外基质，但与脊索细胞相比，其合成和分泌功能较弱，无法有效地维持髓核的正常结构和功能。纤维环细胞同样经历了显著的变化。在增殖方面，纤维环细胞的增殖活性随着退变的进展而逐渐降低，这使得纤维环在受到损伤后，自我修复能力减弱。细胞凋亡方面，纤维环细胞的凋亡率也有所增加，这进一步破坏了纤维环的细胞结构和功能完整性。在分化方面，纤维环细胞的表型发生改变，原本主要表达的I型胶原减少，而II型胶原和软骨特异性蛋白的表达增加，这种分化异常导致纤维环的力学性能下降，更容易受到损伤。同时，纤维环细胞还会分泌更多的基质金属蛋白酶（MMPs），如MMP-1、MMP-3、MMP-13等，这些酶能够降解细胞外基质中的胶原纤维和蛋白多糖，加速纤维环的退变。2.2.2细胞外基质改变细胞外基质是椎间盘的重要组成部分，对于维持椎间盘的结构和功能起着关键作用。在大鼠椎间盘生理性退变过程中，细胞外基质的成分、含量、结构及代谢均发生了显著变化。蛋白多糖作为细胞外基质的重要成分之一，其含量随着退变的发生逐渐减少。蛋白多糖主要由聚集蛋白聚糖和透明质酸等组成，具有强大的亲水性，能够结合大量水分，赋予椎间盘良好的弹性和抗压能力。在退变过程中，由于髓核细胞和纤维环细胞的合成功能下降，以及基质金属蛋白酶等降解酶的活性增加，导致蛋白多糖的合成减少，降解增加。研究发现，聚集蛋白聚糖的核心蛋白和糖胺聚糖链的含量均明显降低，其结构也发生改变，如糖胺聚糖链的长度缩短、分支减少，这使得蛋白多糖的亲水性和保水能力大幅下降，椎间盘的水分含量减少，弹性降低，进而影响其缓冲和支撑功能。胶原蛋白在椎间盘的细胞外基质中也占有重要比例，主要包括I型和II型胶原。I型胶原主要分布于纤维环，赋予纤维环较高的抗拉强度；II型胶原主要存在于髓核，对于维持髓核的结构和稳定性至关重要。在生理性退变过程中，I型胶原和II型胶原的含量均发生变化。II型胶原的含量显著减少，其基因表达水平降低，导致髓核的结构和稳定性受到破坏，髓核容易发生变形和移位。同时，I型胶原的结构和排列也发生改变，纤维环中的胶原纤维变得松散、紊乱，甚至出现断裂，使得纤维环的抗拉强度和稳定性下降，无法有效地约束髓核，增加了髓核突出的风险。此外，胶原蛋白的代谢也出现异常，合成与降解失衡，降解过程增强，进一步加剧了胶原蛋白的减少和结构破坏。2.2.3相关信号通路在大鼠椎间盘生理性退变过程中，多种信号通路参与其中，它们相互作用，共同调节椎间盘细胞的生物学行为和细胞外基质的代谢，对椎间盘退变的发生和发展起着重要的调控作用。转化生长因子-β（TGF-β）信号通路在椎间盘的生长、发育和维持正常功能中发挥着关键作用。在生理性退变过程中，TGF-β信号通路的活性发生改变。正常情况下，TGF-β能够促进髓核细胞和纤维环细胞的增殖和分化，上调II型胶原、蛋白多糖等细胞外基质成分的合成，抑制基质金属蛋白酶的表达，从而维持椎间盘的结构和功能稳定。然而，随着年龄的增长和退变的发生，TGF-β信号通路的功能逐渐失调。一方面，TGF-β的表达水平下降，导致其对细胞增殖和细胞外基质合成的促进作用减弱；另一方面，细胞表面的TGF-β受体表达减少或功能异常，使得细胞对TGF-β的敏感性降低，信号传导受阻。此外，TGF-β信号通路还与其他信号通路相互作用，如与Wnt信号通路存在交叉对话，在椎间盘退变过程中，这种相互作用的失衡可能进一步加剧椎间盘的退变。Wnt信号通路在椎间盘的发育和稳态维持中也具有重要作用。经典的Wnt/β-catenin信号通路在生理性退变过程中被异常激活。在正常椎间盘组织中，Wnt信号通路处于相对稳定的状态，β-catenin在细胞质中被磷酸化并降解，维持较低的水平。当Wnt信号通路被激活时，Wnt蛋白与细胞膜上的受体结合，抑制β-catenin的磷酸化和降解，使其在细胞质中积累并进入细胞核，与转录因子结合，调控相关基因的表达。在椎间盘退变过程中，异常激活的Wnt/β-catenin信号通路会导致髓核细胞和纤维环细胞的增殖和分化异常，促进细胞凋亡，同时抑制II型胶原和蛋白多糖的合成，上调基质金属蛋白酶的表达，加速细胞外基质的降解，从而推动椎间盘退变的进程。此外，非经典的Wnt信号通路如Wnt/PCP（平面细胞极性）通路和Wnt/Ca2+通路也可能参与椎间盘退变的调节，它们通过调节细胞骨架的重组、细胞间的黏附和钙离子浓度等，影响椎间盘细胞的生物学行为和椎间盘的力学性能。2.3影响因素2.3.1遗传因素遗传因素在大鼠椎间盘退变的易感性中起着关键作用，众多研究表明，特定基因的突变或多态性与椎间盘退变的发生发展密切相关。例如，生长分化因子5（GDF5）基因的多态性被发现与大鼠椎间盘退变显著相关。GDF5作为一种重要的细胞因子，在椎间盘的发育和维持正常功能中发挥着重要作用，它能够促进终板软骨的形成和细胞外基质的代谢。当GDF5基因发生多态性改变时，其编码的蛋白质结构和功能可能会受到影响，进而导致椎间盘细胞的增殖、分化和代谢异常，最终增加椎间盘退变的风险。聚集蛋白聚糖基因的多态性也对大鼠椎间盘退变产生重要影响。聚集蛋白聚糖是椎间盘细胞外基质的重要组成部分，具有强大的保水能力，能够维持椎间盘的水分含量和高度，缓冲脊柱的轴向负荷。研究发现，聚集蛋白聚糖基因的某些多态性位点会影响其表达水平和蛋白结构，导致聚集蛋白聚糖的合成减少或功能异常，使椎间盘的保水能力下降，抗压能力减弱，从而加速椎间盘的退变进程。此外，一些与细胞凋亡、炎症反应、基质代谢等相关的基因也被证实与大鼠椎间盘退变的易感性有关。如细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达失衡，会导致髓核细胞和纤维环细胞凋亡增加，加速椎间盘退变；炎症因子基因如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等的多态性，会影响炎症因子的表达和释放，引发炎症反应，破坏椎间盘的微环境，促进退变的发生；基质金属蛋白酶（MMPs）基因的多态性则会影响MMPs的活性和表达水平，导致细胞外基质的降解失衡，加速椎间盘的退变。2.3.2生活习性饮食和运动等生活习性对大鼠椎间盘退变有着不容忽视的影响。在饮食方面，营养物质的摄入与椎间盘的健康密切相关。充足的蛋白质、维生素和矿物质等营养成分对于维持椎间盘细胞的正常代谢和功能至关重要。蛋白质是合成细胞外基质的重要原料，缺乏蛋白质会导致蛋白多糖和胶原的合成减少，影响椎间盘的结构和功能。维生素C参与胶原的合成过程，缺乏维生素C会使胶原合成受阻，降低椎间盘的强度和稳定性。钙、磷等矿物质对于维持骨骼和椎间盘的正常矿化和力学性能具有重要作用，缺乏这些矿物质可能导致椎间盘的退变加速。高脂饮食也是影响大鼠椎间盘退变的一个重要因素。研究表明，长期摄入高脂饮食会导致大鼠体重增加，肥胖程度上升，进而使椎间盘承受的压力增大。同时，高脂饮食还会引起体内炎症反应的激活，炎症因子的释放增加，这些炎症因子会破坏椎间盘的细胞外基质，诱导细胞凋亡，从而加速椎间盘的退变。此外，高脂饮食还可能影响脂质代谢，导致血脂异常，使椎间盘组织中的脂肪堆积，进一步影响椎间盘的营养供应和代谢功能。在运动方面，适度的运动对大鼠椎间盘具有保护作用。运动可以增强脊柱周围肌肉的力量，提高脊柱的稳定性，减少椎间盘所承受的压力。同时，运动还能促进椎间盘的血液循环，增加营养物质的供应，有利于椎间盘细胞的代谢和修复。例如，定期进行游泳运动的大鼠，其椎间盘的退变程度明显低于缺乏运动的大鼠。游泳运动能够使大鼠的脊柱处于自然伸展状态，减轻椎间盘的压力，同时还能锻炼全身肌肉，增强脊柱的稳定性。然而，过度运动或不当的运动方式则可能对大鼠椎间盘造成损伤，促进退变的发生。过度的跑跳、负重等运动可能会使椎间盘受到过大的冲击力和压力，导致纤维环破裂、髓核突出等损伤。长期进行单一方向的运动，如长时间的站立或行走，会使椎间盘的受力不均，加速其退变。此外，运动损伤如扭伤、拉伤等也可能直接损伤椎间盘，引发炎症反应，进而导致椎间盘退变。三、大鼠椎间盘针刺退变3.1针刺退变模型建立3.1.1实验动物与材料实验选用健康成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，共计60只，体重在250-300g之间。选择SD大鼠是因为其具有生长快、繁殖力强、对环境适应能力好等优点，且其椎间盘结构和生理特性与人类有一定的相似性，能够较好地模拟人类椎间盘退变过程。实验材料包括：21G穿刺针，用于纤维环穿刺；10%水合氯醛，作为麻醉剂，用于麻醉大鼠，以保证手术操作的顺利进行；碘伏，用于手术区域的消毒，预防感染；无菌手术器械一套，包括手术刀、镊子、剪刀、缝合针等，用于手术操作；10%中性福尔马林溶液，用于固定椎间盘组织，以便后续的组织学分析；10%乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙液，用于对固定后的椎间盘组织进行脱钙处理，使其能够进行切片和染色；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒，用于对椎间盘组织切片进行染色，以观察其组织形态学变化；免疫组织化学染色试剂盒，用于检测椎间盘组织中特定蛋白的表达情况；磁共振成像（MRI）设备，用于在术前及术后不同时间点对大鼠椎间盘进行扫描，观察其影像学变化。3.1.2手术操作步骤术前准备：将大鼠称重后，按照0.3ml/100g的剂量腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉。待大鼠麻醉成功后，将其仰卧位固定于手术台上，对腹部手术区域进行剃毛处理，并用碘伏进行消毒，铺无菌手术巾。手术暴露：在大鼠右侧旁正中做一长约1.5-2.0cm的切口，远端略过髂嵴2-3mm。将肠管及大网膜用湿纱布小心地向头侧和对侧推移，充分暴露腹后壁。剪开腹后膜，仔细保护好下腔静脉，将腰大肌从脊柱附着点上进行节段性剥离（髂嵴平对L6椎体或L5、6椎间盘），从而清晰地暴露L3-4、L4-5、L5-6、L6-S1椎间盘。纤维环针刺：选用21G穿刺针，针刺角度与椎间盘矢状面呈0-60°，平行于软骨终板进针。对于纤维环部分针刺，深度控制在1.5mm；对于纤维环全层针刺，深度为2.3mm。针刺成功后，旋转穿刺针360°，并停留15-30秒后拔出。在本实验中，对每只大鼠的L5-6椎间盘实施纤维环全层针刺1针，作为实验组；L4-5椎间盘暴露但不穿刺，作为自身对照组。术后处理：针刺完成后，依次缝合腹膜层、肌层，关闭皮肤切口。术后将大鼠放回饲养笼中，密切观察其步态、进食情况，以及有无尿潴留、伤口感染等并发症发生。给予大鼠充足的食物和水，保持饲养环境的清洁和温暖，促进其术后恢复。3.1.3模型验证方法MRI检查：在术前及术后4周、8周、12周，分别对大鼠进行MRI检查。采用1.5T西门子公司MRI扫描设备，矢状面T2扫描参数设置为：TR/TE3500/100ms，Fov12，层厚3mm，间隔0mm。根据改良的Thompson标准，通过观察椎间盘在T2WI上的信号强度和面积变化来判断椎间盘退变程度。1级表示正常，椎间盘信号强度高，面积正常；2级为信号微减弱但高信号区面积明显缩小；3级是信号中等减弱；4级则信号明显减弱。若术后椎间盘信号强度降低，且随着时间推移退变程度逐渐加重，与正常对照组相比有明显差异，则表明模型建立成功。组织学染色：在MRI检查结束后，将大鼠处死，完整取出L3-4、L4-5、L5-6、L6-S1椎间盘。将椎间盘组织放入10%中性福尔马林溶液中，室温下固定24h，然后用10%EDTA脱钙液脱钙1周。脱钙完成后，将组织进行水平面切片，切片厚度为4μm，进行HE染色。在光镜下观察椎间盘的形态变化，包括髓核细胞的数量和形态、纤维环的排列情况、软骨终板的完整性等。正常椎间盘髓核细胞较多，纤维环胶原纤维排列整齐致密；而退变的椎间盘髓核裂隙形成，胶原排列紊乱，髓核细胞数量不断减少，纤维环逐渐分层紊乱、扭曲、断裂。通过对这些形态学变化的观察，与正常对照组进行对比，可验证模型是否成功建立。同时，还可进行免疫组织化学染色，检测髓核中Ⅱ型胶原和I型胶原的表达情况。在正常椎间盘中，Ⅱ型胶原表达丰富，而I型胶原表达较少；在退变椎间盘中，Ⅱ型胶原表达逐渐减少，I型胶原表达逐渐增多。若检测结果符合上述变化趋势，则进一步证明模型建立成功。3.2针刺退变特点3.2.1形态学变化针刺后，大鼠椎间盘在大体形态上呈现出明显的改变。在术后早期，椎间盘外观可能出现轻度肿胀，颜色略显苍白，这是由于针刺损伤引发了局部的炎症反应，导致组织充血、水肿。随着时间的推移，椎间盘逐渐失去原有的饱满度，变得干瘪、皱缩，椎间隙高度也随之逐渐降低。通过X线影像学检查可以清晰地观察到，术后2周，椎间隙高度开始出现轻度下降，与正常对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；术后4周，椎间隙高度进一步降低，下降幅度更为明显；至术后8周，椎间隙高度已显著低于正常水平，部分大鼠的椎间隙甚至出现明显的狭窄。这种椎间隙高度的降低是由于椎间盘内水分丢失、髓核体积缩小以及纤维环结构破坏等多种因素共同作用的结果。除了椎间隙高度的变化，针刺退变的椎间盘在形态上还可能出现其他异常。例如，椎间盘的边缘可能变得不规整，出现骨质增生、骨赘形成等改变。这些骨质增生和骨赘的形成是机体对椎间盘退变的一种代偿性反应，旨在增加脊柱的稳定性，但同时也可能进一步加重对周围组织的压迫，导致疼痛、神经功能障碍等症状的出现。在一些严重退变的椎间盘标本中，还可以观察到纤维环的破裂，髓核突出，这是椎间盘退变的严重阶段，可直接压迫神经根或脊髓，引发严重的临床症状。3.2.2组织学变化在纤维环层面，针刺后纤维环的组织结构发生显著变化。正常情况下，纤维环的胶原纤维排列紧密且规则，呈同心圆状环绕髓核，各层纤维之间相互交织，具有较强的力学强度，能够有效地约束髓核，维持椎间盘的稳定性。然而，针刺损伤后，纤维环的胶原纤维排列逐渐紊乱，纤维之间的连接变得松散，甚至出现断裂。术后4周，在光镜下可见纤维环的外层纤维开始出现扭曲、变形，部分纤维之间出现裂隙；术后8周，纤维环的中层和内层纤维也受到累及，裂隙进一步扩大，纤维环的分层现象更加明显，部分区域的纤维环甚至出现断裂、分离，导致纤维环的完整性遭到严重破坏。髓核在细胞和基质层面也发生了一系列病理变化。针刺后，髓核细胞的数量逐渐减少，细胞形态发生改变。正常的髓核细胞呈圆形或椭圆形，细胞核大而清晰，细胞质丰富，具有较强的代谢活性。随着退变的进展，髓核细胞逐渐变得扁平、萎缩，细胞核固缩，细胞质减少，细胞的代谢活性明显降低。同时，髓核细胞的凋亡率显著增加，这是由于针刺损伤引发的炎症反应和氧化应激等因素，导致细胞内的凋亡信号通路被激活，促使髓核细胞发生凋亡。在基质方面，髓核内的蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量显著减少。蛋白多糖是髓核基质的重要组成部分，具有强大的亲水性，能够结合大量水分，赋予髓核良好的弹性和抗压能力。Ⅱ型胶原则是维持髓核结构稳定的关键成分。针刺退变过程中，由于髓核细胞的合成功能下降，以及基质金属蛋白酶等降解酶的活性增加，导致蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成减少，降解增加，髓核的含水量降低，弹性和抗压能力减弱，逐渐失去原有的凝胶状结构，变得更加致密、纤维化。3.2.3生物化学变化针刺后，椎间盘内的炎症因子水平发生显著变化。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）等炎症因子的表达明显上调。TNF-α作为一种重要的促炎细胞因子，能够激活炎症细胞，诱导其他炎症因子的释放，引发炎症级联反应，导致椎间盘组织的炎症损伤。IL-1β则可促进基质金属蛋白酶的合成和释放，加速细胞外基质的降解，进一步破坏椎间盘的结构和功能。研究表明，在针刺退变模型中，术后1周，椎间盘内TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平就开始显著升高，且随着时间的推移，表达水平持续上升，至术后4周达到高峰，随后虽略有下降，但仍维持在较高水平。基质金属蛋白酶（MMPs）和组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的失衡也是针刺退变的重要生物化学特征。MMPs是一类能够降解细胞外基质成分的蛋白酶，在椎间盘退变过程中发挥着关键作用。针刺损伤后，MMPs的活性和表达水平显著增加，其中MMP-3、MMP-13等的表达上调尤为明显。MMP-3能够降解蛋白多糖和纤维连接蛋白等细胞外基质成分，MMP-13则主要作用于Ⅱ型胶原，导致细胞外基质的降解加速。而TIMPs作为MMPs的内源性抑制剂，其表达水平在针刺退变过程中相对下降，无法有效抑制MMPs的活性，从而导致MMPs/TIMPs失衡，进一步加剧了细胞外基质的降解，促进椎间盘退变。此外，针刺还可导致椎间盘内的抗氧化酶活性降低，氧化应激水平升高。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶能够清除体内的自由基，维持细胞内的氧化还原平衡。在针刺退变模型中，这些抗氧化酶的活性明显下降，导致自由基在椎间盘内大量积累，引发氧化应激反应。氧化应激可损伤细胞的生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子，影响细胞的正常代谢和功能，同时还可激活炎症信号通路，促进炎症因子的释放，进一步加重椎间盘的退变。3.3退变机制3.3.1机械损伤引发的炎症反应针刺作为一种外部机械损伤因素，对大鼠椎间盘组织的微观结构造成了直接破坏。在针刺过程中，穿刺针直接穿透纤维环，这不仅破坏了纤维环的完整性，还导致纤维环中的胶原纤维断裂，纤维细胞受损。这种损伤会引发机体的免疫反应，使炎症细胞迅速向损伤部位聚集。巨噬细胞作为炎症反应的关键参与者，通过趋化作用迁移到针刺损伤的椎间盘区域。它们识别并吞噬损伤组织和病原体，同时释放多种炎症介质，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）等。TNF-α能够激活其他炎症细胞，诱导炎症级联反应，导致炎症反应的放大。IL-1β则可促进基质金属蛋白酶的合成和释放，进一步破坏细胞外基质，加重椎间盘的损伤。此外，针刺损伤还会导致血管内皮细胞的损伤，使血管通透性增加。这使得血浆中的炎症因子、免疫球蛋白等物质渗出到组织间隙，进一步加重炎症反应。炎症反应的持续存在会导致椎间盘组织的微环境发生改变，细胞代谢紊乱，影响椎间盘细胞的正常功能，从而促进椎间盘的退变。3.3.2细胞外基质降解基质金属蛋白酶（MMPs）在针刺退变过程中对细胞外基质的降解起着关键作用。针刺损伤后，椎间盘细胞受到刺激，其基因表达发生改变，导致MMPs的合成和分泌显著增加。其中，MMP-3、MMP-13等在细胞外基质降解中发挥着重要作用。MMP-3能够特异性地降解蛋白多糖和纤维连接蛋白等细胞外基质成分。蛋白多糖是维持椎间盘水分含量和弹性的重要物质，其降解会导致椎间盘失水，弹性降低。纤维连接蛋白则在细胞与细胞外基质的相互作用中发挥重要作用，其降解会破坏细胞与基质之间的连接，影响细胞的正常功能。MMP-13主要作用于Ⅱ型胶原，Ⅱ型胶原是髓核和纤维环外层的主要胶原成分，对于维持椎间盘的结构和稳定性至关重要。MMP-13的过度表达会导致Ⅱ型胶原的降解加速，使髓核和纤维环的结构遭到破坏，椎间盘的力学性能下降。同时，MMPs的活性受到组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的调节。在正常情况下，MMPs和TIMPs保持相对平衡，维持细胞外基质的正常代谢。然而，在针刺退变过程中，TIMPs的表达相对减少，无法有效抑制MMPs的活性，导致MMPs/TIMPs失衡，进一步加剧了细胞外基质的降解，促进椎间盘退变。3.3.3神经病理性改变针刺退变会引发椎间盘内神经纤维的异常生长和神经递质的变化，从而导致神经病理性改变。正常情况下，椎间盘内部的神经纤维分布较少，主要分布在纤维环的外层。然而，在针刺退变过程中，由于炎症反应和细胞外基质的降解，椎间盘的微环境发生改变，这种改变会诱导神经纤维向椎间盘内部生长。研究发现，针刺损伤后，椎间盘内神经生长因子（NGF）的表达上调，NGF是一种促进神经生长和存活的细胞因子，它能够刺激神经纤维的生长和分支。在NGF的作用下，神经纤维从纤维环外层向内部延伸，甚至长入髓核组织，导致椎间盘内神经纤维密度增加。神经递质的变化也是针刺退变中神经病理性改变的重要方面。P物质（SP）和降钙素基因相关肽（CGRP）是两种与疼痛传递密切相关的神经递质。在针刺退变过程中，椎间盘内SP和CGRP的表达明显增加。SP能够激活痛觉感受器，促进疼痛信号的传递，同时还能促进炎症细胞的活化和炎症介质的释放，加重炎症反应。CGRP则具有扩张血管、增加血管通透性的作用，它能够导致局部组织充血、水肿，进一步加重疼痛。此外，CGRP还能增强SP的致痛作用，两者协同作用，使得针刺退变的椎间盘产生明显的疼痛症状。这些神经病理性改变不仅会导致疼痛的产生，还会进一步影响椎间盘的正常功能，加速椎间盘的退变进程。四、两者异同点比较4.1相同点4.1.1细胞与基质变化在大鼠椎间盘生理性退变和针刺退变过程中，细胞与基质层面均发生了一系列相似的变化。从细胞角度来看，髓核细胞数量减少是两者共有的显著特征。在生理性退变中，随着年龄增长，髓核细胞的增殖能力逐渐下降，凋亡率增加，导致细胞数量不断减少。而在针刺退变模型中，针刺造成的机械损伤以及随之引发的炎症反应，会直接损伤髓核细胞，诱导细胞凋亡，同样使得髓核细胞数量显著降低。纤维环结构破坏在两种退变中也十分相似。正常情况下，纤维环的胶原纤维排列紧密且规则，能够有效地约束髓核，维持椎间盘的稳定性。然而，在生理性退变过程中，由于长期的力学负荷、氧化应激等因素，纤维环的胶原纤维逐渐发生降解、断裂，排列变得紊乱，纤维环的强度和稳定性下降。针刺退变则是由于穿刺针直接破坏了纤维环的结构，引发炎症反应，导致纤维环细胞的代谢异常，进一步加速了胶原纤维的降解和破坏，使得纤维环出现裂隙、分层甚至断裂，无法正常发挥其对髓核的约束作用。基质成分改变也是两者的共同之处。蛋白多糖和胶原作为椎间盘细胞外基质的重要组成部分，在两种退变过程中含量均显著减少。在生理性退变中，随着年龄的增加，髓核细胞和纤维环细胞的合成功能逐渐下降，同时基质金属蛋白酶等降解酶的活性增加，导致蛋白多糖和胶原的合成减少，降解增加。针刺退变时，炎症反应激活了基质金属蛋白酶的表达和活性，大量降解蛋白多糖和胶原，使得细胞外基质的含量和结构遭到严重破坏，椎间盘的弹性和抗压能力降低。4.1.2炎症反应炎症反应在大鼠椎间盘生理性退变和针刺退变过程中均扮演着重要角色，且存在诸多共性。在炎症细胞参与方面，巨噬细胞在两种退变中均被激活并聚集到椎间盘组织中。在生理性退变过程中，随着椎间盘组织的老化和损伤，机体的免疫系统被激活，巨噬细胞通过趋化作用迁移到退变的椎间盘区域。它们吞噬损伤的细胞和组织碎片，同时释放多种炎症介质，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等，引发炎症反应。在针刺退变模型中，针刺造成的机械损伤直接刺激了巨噬细胞的活化，使其迅速聚集到损伤部位，释放炎症介质，加剧炎症反应。炎症因子的参与也是两者的共同点。TNF-α和IL-1β等炎症因子在两种退变过程中均表达上调。TNF-α作为一种关键的促炎细胞因子，能够激活其他炎症细胞，诱导炎症级联反应，导致炎症反应的放大。它可以促进白细胞的趋化和活化，增加血管内皮细胞的黏附分子表达，使更多的炎症细胞浸润到椎间盘组织中，进一步加重炎症损伤。IL-1β则可促进基质金属蛋白酶的合成和释放，加速细胞外基质的降解，破坏椎间盘的结构和功能。在生理性退变和针刺退变中，炎症因子的持续升高，导致椎间盘组织的微环境发生改变，细胞代谢紊乱，促进了椎间盘的退变进程。4.1.3疼痛表现在疼痛机制方面，两种退变均涉及神经病理性改变和炎症介质的刺激。在生理性退变过程中，随着椎间盘退变的进展，椎间盘内的神经纤维会发生异常生长，神经末梢向椎间盘内部延伸，导致椎间盘内神经纤维密度增加。同时，炎症反应产生的炎症介质，如P物质（SP）、降钙素基因相关肽（CGRP）等，会刺激这些神经末梢，激活痛觉感受器，从而产生疼痛信号。针刺退变同样会引发神经病理性改变，针刺损伤导致椎间盘内神经生长因子（NGF）表达上调，促进神经纤维的生长和分支，使神经纤维长入椎间盘内部。炎症介质SP和CGRP的释放也会显著增加，它们与神经末梢上的受体结合，激活痛觉传导通路，导致疼痛的产生。从行为学表现来看，两种退变的大鼠均会出现活动减少、对疼痛刺激敏感等相似症状。在生理性退变的大鼠中，由于椎间盘退变导致的腰部疼痛，大鼠会减少日常的活动量，如减少奔跑、跳跃等行为。在受到轻微的疼痛刺激时，会表现出明显的疼痛反应，如躲避、鸣叫等。针刺退变的大鼠同样如此，术后由于椎间盘退变引发的疼痛，大鼠的活动明显受限，对疼痛刺激的阈值降低，即使是轻微的触摸或压迫腰部，也会引起大鼠的疼痛反应，表现出身体蜷缩、挣扎等行为。4.2不同点4.2.1退变速度与进程大鼠椎间盘生理性退变是一个缓慢渐进的过程，贯穿于大鼠的整个生命周期。在幼年时期，椎间盘处于生长发育阶段，结构和功能相对稳定，退变进程极为缓慢，几乎难以察觉。随着年龄的增长，大鼠进入成年期后，椎间盘的退变开始逐渐显现，但仍较为缓慢，可能在数月甚至数年内才会出现较为明显的变化。例如，髓核中的水分含量逐渐减少，纤维环的胶原纤维开始出现轻微的降解和重塑，但这些变化通常是渐进性的，不会在短时间内导致椎间盘功能的急剧下降。当大鼠步入老年期，退变速度会有所加快，但总体上仍然是一个相对缓慢的过程，可能需要数年时间，椎间盘才会出现严重的退变，如髓核明显脱水、纤维环破裂、椎间隙高度显著降低等。相比之下，针刺退变是一种人为诱导的退变方式，其退变速度明显更快，且阶段性特征更为明显。在针刺后的短时间内，通常在术后1-2周，即可观察到椎间盘的明显变化。由于穿刺针直接破坏了纤维环的结构，导致椎间盘内部的力学平衡被打破，髓核受到的约束减少，同时炎症反应迅速启动。这使得椎间盘在短时间内出现水分丢失、髓核形态改变等退变迹象。在术后4-8周，退变进一步加剧，髓核细胞凋亡增加，细胞外基质降解加速，纤维环的结构破坏更为严重，椎间隙高度明显降低。在术后8-12周，椎间盘可能会出现严重的退变，如髓核突出、纤维环完全断裂等，导致椎间盘功能严重受损。这种快速的退变过程与生理性退变的缓慢渐进形成了鲜明的对比，针刺退变在较短的时间内就完成了生理性退变需要较长时间才能达到的退变程度。4.2.2分子生物学变化差异在基因表达方面，生理性退变过程中，基因表达的变化相对较为缓慢且持续。一些与细胞衰老、基质代谢相关的基因表达逐渐改变。例如，衰老相关基因p16INK4a的表达随着年龄的增长而逐渐上调，它可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，导致细胞周期停滞，从而抑制髓核细胞和纤维环细胞的增殖。基质金属蛋白酶（MMPs）基因家族中的部分成员，如MMP-3、MMP-13等，其表达也会随着时间的推移逐渐增加，这些酶能够降解细胞外基质中的胶原纤维和蛋白多糖，促进椎间盘退变。然而，在针刺退变中，基因表达的变化更为迅速且剧烈。针刺损伤后，炎症相关基因如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等的表达在短时间内急剧上调。TNF-α基因的表达在针刺后1-2天内即可显著升高，它可激活炎症细胞，诱导炎症级联反应，导致炎症反应的迅速放大。IL-1β基因的表达也会在同期明显增加，其能够促进MMPs的合成和释放，加速细胞外基质的降解。同时，一些与细胞凋亡相关的基因，如Bax的表达迅速升高，而Bcl-2的表达降低，导致Bax/Bcl-2比值失衡，诱导细胞凋亡，这种基因表达的快速变化在针刺退变中尤为突出。信号通路激活方面，生理性退变中，转化生长因子-β（TGF-β）信号通路和Wnt信号通路的变化较为缓慢且持续。随着年龄的增长，TGF-β信号通路的活性逐渐下降，其对细胞增殖和细胞外基质合成的促进作用减弱，导致椎间盘细胞的功能逐渐衰退。Wnt信号通路的异常激活也是一个渐进的过程，可能在数年的时间内逐渐影响椎间盘细胞的生物学行为，如促进细胞凋亡、抑制细胞外基质合成等。而在针刺退变中，多条信号通路被迅速激活。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在针刺后被快速激活，包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等亚通路。ERK通路的激活可促进炎症因子的表达和细胞凋亡，JNK通路的激活则可进一步加剧炎症反应和细胞损伤，p38MAPK通路的激活可调节多种细胞因子和趋化因子的表达，导致炎症细胞的募集和活化，这些信号通路的快速激活在针刺退变的早期阶段就对椎间盘的退变起到了重要的推动作用。4.2.3影像学特征差异在MRI检查中，大鼠椎间盘生理性退变的信号强度变化相对较为缓慢且呈渐进性。在早期，T2加权像上椎间盘的信号强度可能仅有轻微降低，这是由于髓核中的水分开始逐渐减少，但这种变化并不明显。随着年龄的增长，信号强度逐渐降低，在老年期，椎间盘的信号强度明显减弱，与周围组织的对比度降低。同时，椎间盘的形态改变也较为缓慢，椎间隙高度逐渐降低，可能在数月至数年的时间内才会出现明显的狭窄。在矢状位图像上，可观察到椎间盘的前后径和上下径逐渐减小，髓核的形态逐渐变得不规则。而针刺退变在MRI上的信号强度变化更为迅速且显著。在针刺后的4-8周，T2加权像上椎间盘的信号强度就会明显降低，这是由于针刺损伤导致髓核迅速失水，细胞外基质降解，炎症反应加剧，使得椎间盘的含水量急剧减少，信号强度随之大幅下降。在形态改变方面，针刺退变的椎间盘在短时间内就会出现明显的形态异常。椎间隙高度在术后2-4周就开始明显降低，且降低幅度较大。在矢状位图像上，可清晰地观察到椎间盘的变形，髓核可能向一侧或后方突出，纤维环的完整性遭到破坏，出现裂隙或断裂，这些形态改变在针刺退变中更为快速和明显，与生理性退变的缓慢变化形成了鲜明的对比。五、结论与展望5.1研究结论总结本研究通过对大鼠椎间盘生理性退变和针刺退变的深入研究，全面揭示了两者在退变过程、机制、影响因素以及形态学、组织学、生物化学等方面的异同点。在相同点方面，两种退变在细胞与基质变化上表现出一致性，髓核细胞数量均减少，纤维环结构遭到破坏，蛋白多糖和胶原等基质成分含量显著降低。炎症反应在两者中均扮演重要角色，巨噬细胞被激活并聚集，TNF-α、IL-1β等炎症因子表达上调，引发炎症级联反应，破坏椎间盘的结构和功能。疼痛表现也具有相似性，均涉及神经病理性改变和炎症介质的刺