T-CQAAS 006-2023 花椒品种分子身份证构建方法

T/CQAASIT/CQAAS 32规范性引用文件 33术语和定义 33.1标准样品StandardSample 33.2分子标记MolecularMarker 33.3SSR标记SimpleSequenceRepeatMarker 33.4DNA指纹DNAFingerprint 33.5品种身份证VarietiesID 34方法 34.1DNA提取 34.2花椒叶片的转录组分析 44.3分子标记引物的设计 44.4SRAP标记扩增 4 44.6数据分析 4T/006-2023本文件编写符合GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由重庆市江津区农业农村委员会提出。本文件由重庆市农学会归口。本文件起草单位：重庆市农业科学院果树研究所、重庆市江津区农产品质量安全中心、重庆市江津区花椒产业协会、重庆市江津区花椒加工业协会、重庆市江津先锋花椒城有限公司、重庆蓓廷农业科技有限公司。本文件主要起草人:张义刚、程玥啨、谢永红、曾维友、范烨、苏家奎、池浩、周於强、童建川、陈秀强、赵海忠、杨仕春、刘瑜涵、李剑。3T/006-2023花椒品种分子身份证构建方法本文件规定了花椒品种身份证的术语和定义、方法。本文件适用于花椒品种身份证的构建。2规范性引用文件下列文件的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1标准样品经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品，本标准中为农作物种子，即农作物的种植材料或者繁殖材料，包括籽粒、果实和根、茎、苗、芽、叶等。3.2分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。3.3SSR标记是一类由几个核苷酸（一般为1～6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，由于基本单元重复次数的不同，形成了SSR长度的多态性。3.4DNA指纹具有完全个体特异的DNA多态性，本标准中指SSR等分子标记扩增的多态性。3.5品种身份证指反映品种的商品属性和DNA指纹信息的数字和（或）字母组合。4方法4.1DNA提取采用改良的CTAB法提取花椒新鲜叶片的DNA，具体包括以下步骤：T/006-20234(1)在65℃水浴中预热提前配置好的2×CTAB提取缓冲液，0.1MTris-HCl、0.02MEDTA、1.4MNaCl、2％PVP、2％CTAB；(2)在液氮中研磨石榴叶片至粉末状，转至2.0mL离心管中；颠倒摇匀一次；(4)常温下12000rpm离心5min，吸上清转移至新的2.0mL离心管中；(5)加入等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀5min，放置5min，12000rpm常温离心10min；(6)吸上清到新的2.0mL离心管中，用氯仿/异戊醇重复抽提一次；(7)离心，吸上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置2h，沉淀DNA；(9)倒掉异丙醇，用500μL乙醇洗沉淀两次，(11)加入500μLTE，再加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒摇匀2min；(13)吸上清到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置2h，沉淀DNA；(15)倒掉异丙醇，用500μL乙醇清洗沉淀两次，吹干后用50μLTE溶解DNA；4℃冰箱中保存。(16)使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。4.2花椒叶片的转录组分析从花椒种质资源中选择20个花椒品种或品系，提取叶片总RNA，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行无参转录组测定，并在该公司在线分析平台美吉生物云平台(/)分析转录组数据。4.3分子标记引物的设计根据20个花椒叶片转录组数据分析结果，设计SSR引物和Indel引物。由于SRAP引物为通用引物，因此根据以往的文献报道，设计SRAP上下游引物。4.4SRAP标记扩增SRAP标记扩增体系是：样品基因组DNA1.0μL，2XTaq酶10.0μL，正反引物各1.0μL，ddH2O7.0μL；SRAP引物PCR扩增的程序:94℃预变性4min;94℃变性45s,35℃复性1min,72℃4.5电泳检测96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9μl，PCR产物1.0μl，其中该分子量内标和甲酰胺混合液两者的体积比为0.5：8.5；将PCR产物稀释40倍，在96孔板的各孔中分别加入8.5μl去离4000转min-1离心1min，于ABI3730DNA分析仪上进行毛细管电泳；预电泳15kV，3min；2kV电进样10s；电泳15kV，20min。4.6数据分析T/006-20235用DataCollection软件收集原始数据，用Genemapper软件分析收集的原始数据，比较各峰值的位置与其泳道中的LIZ-500分子量内标，获得SSR扩增片段的精确分子量bp；将花椒品种的DNA指纹信息编码，再结合品种的形态学特征特性及可能具有的特异基因