《医学科研实践技能》课件-Sysmex流式细胞仪实验操作及应用

Sysmex

流式细胞仪实验操作及应用目

录01

流式基本原理02样本制备03

上机检测04

流式具体应用

01

PART

流式基本原理1.1流式细胞术简介（FlowCytometry）HUMANLargerSmallerPartec仪器的检测范围

0.05um-200um。流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段，在流动状态下，对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。1.1流式细胞术简介（FlowCytometry）HUMAN1.1流式细胞术简介（FlowCytometry）HUMAN分析型流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。分选型流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。1.1流式细胞术简介（FlowCytometry）HUMAN1.2流式细胞流体学系统HUMAN流动室(flowcell,flowchamber)是流式细胞仪的核心部件。流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。进样孔荧光信号激光束鞘液Sheath流动室结构图：单细胞发生器1.3.光学系统——散射光的作用HUMANHUMAN实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片1.3.1散射光的作用1.3.2荧光信号检测HUMAN1.3.3荧光信号通道选择HUMAN通道(channel)

一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道：散射光通道:FSC通道和SSC通道；荧光通道通道命名方式：以FL(fluorescence)加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。Forexample：CyFlow®Cube6有488nm和638nm两根激光器，488nm能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(PerCP)，638能检测FL4(APC)，代表Cube6有6个通道，最多能同时检测4个荧光，6种参数。1.3.4常用荧光素HUMAN<499nm蓝色荧光（Blue）；

500-549nm，绿色荧光（Green）；550-584nm，黄色荧光（Yellow）；

585-615nm，橙色荧光（Orange）；616-700nm，红色荧光（Red）；

≥700nm，远红外荧光（Far-Red）。标记抗体的荧光素荧光素分子激发光波长（nm）发射光波长（nm）通道选择中文名FITC490520FL1异硫氰酸荧光素PE488575FL2藻红蛋白PerCP490675FL3多甲藻叶绿素蛋白APC650660FL4别藻青蛋白PE-Cy5496/546670FL4藻红蛋白-花青素5PE-Cy7496/546767FL4藻红蛋白-花青素71.4电子学系统HUMAN

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样本制备2.1单细胞悬液制备HUMAN2.2免疫荧光染色HUMAN荧光素偶联抗体抗体上偶联荧光素(FITC、PE等)，通过抗原抗体反应让目标细胞特异性的带上荧光。染色过程即抗原抗体反应过程。荧光染料/荧光化合物PI、DAPI等插入核酸链中；CFSE和蛋白质共价结合；AnnexinV-FITC检测凋亡。荧光蛋白如GFP，不需要染色，直接检测。2.2免疫荧光染色HUMAN一般检测时，获取1～2万个细胞，标记0.5～1×106细胞即可。下述情况细胞量需相应增加：检测胞内/核内抗原，离心次数多；细胞周期乙醇固定损失细胞多；检测细胞在标本中比例低0.5～1×106个细胞孵育体积50-100ul上机体积200-500ul终浓度约1×106个/ml加染料洗涤后补加液体

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流式上机检测3.1调节电压/增益HUMAN3.2阈值设定HUMAN阈值Threshold：排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。5%32%默认阈值升高阈值后3.3

圈门HUMAN死细胞或碎片粘连细胞肿瘤细胞株FSC/SSC散点图死细胞加药处理后FSC/SSC散点图通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析3.4调补偿HUMAN不同荧光染料发射峰值不同，但发射谱范围有一定的重叠，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，这种现象就是光谱重叠(spectraloverlap)。FL1530/30FL2585/42发射波长FITC发射谱PE发射谱HUMAN实验操作中，常利用电子技术和计算机软件设置的方法将串入相邻荧光通道的信号扣除，这种技术称为荧光补偿(fluorescencecompensation)。FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1-%FL2通过单标调节补偿补偿前补偿后3.4调补偿HUMAN未补偿正确补偿FITC-PE补偿太大PE-FITC补偿太大补偿调节要合适3.4调补偿3.5数据分析-画图HUMAN3.5数据分析-坐标轴HUMAN由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。

线性(linear;lin)对数(logarithmic;log)一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。

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具体应用4.1周期检测HUMAN4.1周期检测HUMANHUMAN4.2细胞凋亡检测和分析4.2细胞凋亡检测和分析——对照设置HUMAN空白对照：设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。Annexin-V单染组：调节补偿，避免荧光信号串联PI单染组：调节补偿，避免荧光信号串联双染对照组双染实验组HUMAN1.用正常细胞摸索合适消化酶浓度和消化时间；2.尽量避免使用含EDTA的消化酶；如果使用了还有EDTA的消化酶需要充分洗涤3.需要收集上清中已经浮起来的细胞，再用胰酶消化贴壁细胞；4.凋亡洗涤和染色都应该用含钙离子的专门缓冲液；5.当样本表达GFP时，禁用AnnexinV-FITC,推荐使用AnnexinV-APC/7-AAD染色6.与抗体结合不同，AnnexinV的结合不稳定，所以在标记结束后1-3小时内必须要上机检测；7.PI对细胞有一定的毒性，可在上机前5-10分钟加入Pl染料：8.上机检测前用300目筛过滤细胞悬液4.3Annexin-V/PI检测细胞凋亡注意事项4.4数据分析处理HUMAN计算机进行数据的存储CyView为Sysmex-Partec的独有软件，可对数据进行分析数据分析软件：FC