2026年PCR微生物培训考核试题及答案

2026年PCR微生物培训考核试题及答案一、单项选择题（每题1分，共30分。每题只有一个正确答案，请将正确选项字母填入括号内）1.在实时荧光PCR中，用于定量分析的关键参数是（）A.Ct值B.Tm值C.OD260D.凝胶亮度答案：A2.下列哪种内参基因最适合用于人类粪便样本中细菌总量测定（）A.16SrRNAV4区B.gyrBC.rpoBD.tuf答案：A3.当使用SYBRGreenI法检测艰难梭菌毒素B基因时，熔解曲线出现双峰，最可能的原因是（）A.引物二聚体B.探针降解C.模板过量D.Mg²⁺浓度过低答案：A4.在建立耐碳青霉烯类肠杆菌科（CRE）的qPCR体系时，以下哪对引物靶标最具流行病学意义（）A.blaKPCB.blaTEMC.blaSHVD.blaOXA1答案：A5.若某样本经数字PCR测得copies/μL为3.8，而qPCRCt=31.2，则其扩增效率最接近（）A.85%B.95%C.105%D.115%答案：B6.关于UNG酶防污染体系，下列说法正确的是（）A.可水解含dUTP的DNAB.作用于RNADNA杂交链C.需在94°C永久失活D.对天然DNA模板无影响答案：A7.在提取痰液中结核分枝杆菌DNA时，下列哪种前处理步骤对去除黏蛋白最关键（）A.NALCNaOH液化B.蛋白酶K55°C消化C.65°C热裂解D.氯仿异戊醇抽提答案：A8.若某实验室自建诺如病毒GI/GII双重qPCR，内参采用MS2噬菌体，下列哪项可最直观评估提取效率（）A.MS2Ct值B.GICt值C.GIICt值D.内标ΔCt答案：A9.关于微滴式数字PCR（ddPCR），下列哪项描述错误（）A.无需标准曲线即可绝对定量B.对PCR抑制剂耐受性高于qPCRC.微滴生成油相必须含表面活性剂D.微滴阅读时需使用FAM/VIC双通道即可区分四重体系答案：D10.在构建宏基因组测序用16S文库时，若使用341F/806R引物对，其预期扩增长度约为（）A.292bpB.465bpC.806bpD.1500bp答案：B11.下列哪项不是临床PCR实验室“三区两缓冲”布局中“三区”之一（）A.试剂准备区B.标本制备区C.扩增区D.产物测序区答案：D12.当运行ABI7500Fast仪器时，出现“ROX荧光漂移”报警，最优先检查（）A.反应管盖是否压紧B.探针是否降解C.模板是否过量D.热盖温度是否偏低答案：A13.关于结核分枝杆菌rpoB基因突变检测，下列哪型探针可覆盖最常见的S531L突变（）A.锚定双杂交探针B.TaqManMGBC.分子信标D.FRET杂交探针答案：B14.在COVID19疫情期间，某实验室采用ORF1ab/N双靶标qPCR，结果ORF1abCt=38，NCt=40，内参RNasePCt=25，应报告（）A.阴性B.阳性C.可疑需复检D.无效答案：C15.若某菌株经全基因组测序检出blaNDM1，下列哪对qPCR引物可最快完成暴发调查（）A.F:GGTTTGGCGATCTGGTTTTCR:CGGAATGGCTCATCACGATB.F:ATGGAATTGCCCAATATTATGCR:TCAGCGCAGCTTGTCGC.F:CGTCTAGTTCTGCTGTGCTR:CTGCTTGAGCACCTTTTTAGD.F:AGTGGCTGAAGTGGCTGATAR:CCACGTTATCCAGCGTTATC答案：A16.在提取革兰阳性菌DNA时，加入溶菌酶的最终浓度通常为（）A.1mg/mLB.5mg/mLC.10mg/mLD.20mg/mL答案：C17.下列哪项不是PCR假阴性的常见原因（）A.样本运输>48h未冷藏B.探针序列突变C.引物3′端错配D.退火温度降低2°C答案：D18.关于熔解曲线法区分HPV16/18，下列哪项参数最关键（）A.Tm差值≥2°CB.峰高比值>1.5C.引物浓度0.8μMD.Mg²⁺2.5mM答案：A19.若某实验室参加WHOCREEQA，回报Ct=28.6，靶标为blaIMP，而参考实验室Ct=26.9，其允许偏差为（）A.±0.5B.±1.0C.±1.5D.±2.0答案：C20.在建立艰难梭菌毒素A/BqPCR时，若选择tcdB作为靶标，其最佳扩增长度为（）A.70–120bpB.120–200bpC.200–300bpD.300–500bp答案：B21.下列哪种荧光通道组合最适合四重呼吸道病毒Panel（）A.FAM/VIC/ROX/CY5B.FAM/HEX/TEXASRED/CY5C.FAM/VIC/ABY/JUND.FAM/HEX/ROX/CY5.5答案：C22.当使用QiagenQuantiTectMultiplexPCRKit时，推荐的热启动时间应为（）A.30sB.2minC.5minD.15min答案：D23.若某样本经磁珠法提取后，A260/A280=1.42，提示（）A.蛋白质污染B.酚残留C.RNA污染D.乙醇残留答案：A24.在建立沙门氏菌invAqPCR时，若使用PMAxx处理区分死活菌，其最佳光照时间为（）A.30sB.2minC.5minD.10min答案：C25.关于CRISPRCas12a结合荧光报告基因检测HPV16，下列哪项描述正确（）A.需PAM序列为TTTNB.反式切割活性激活后切割ssDNAFQC.需RNA逆转录步骤D.灵敏度低于qPCR2log答案：B26.若某实验室自建mcr1qPCR，其检出限为10copies/反应，则每毫升血液最低检出菌量为（）A.10CFUB.100CFUC.1000CFUD.无法换算答案：B27.在运行BioRadQX200ddPCR时，微滴生成油出现“白浊”，最可能原因是（）A.油相过期B.20×缓冲液未平衡至室温C.探针浓度过高D.微滴生成卡槽污染答案：A28.下列哪项不是临床PCR实验室质量指标（）A.报告及时率B.污染率C.无效率D.标本接收率答案：D29.若某样本经qPCR检测Ct=22，而同一标本ddPCR测得浓度为1.2×10³copies/μL，则其扩增效率最接近（）A.90%B.95%C.100%D.105%答案：C30.关于结核分枝杆菌XpertMTB/RIFUltra，下列哪项说法正确（）A.检测rpoB81bp核心区B.样本量仅需0.5mLC.可区分死菌活菌D.对RIF耐药检测灵敏度100%答案：A二、配伍题（每题2分，共20分。每组选项可重复选用，但每题只有一个最佳匹配）A.内参基因B.抑制对照C.提取空白D.阳性定量标准E.无模板对照31.监测核酸提取过程中是否交叉污染（）32.用于校正样本间差异及抑制物影响（）33.判断PCR体系是否出现扩增产物污染（）34.建立标准曲线计算未知样本浓度（）35.评估上样量是否足够（）答案：31C32A33E34D35BA.FAMB.HEXC.ROXD.CY5E.TEXASRED36.检测HPV18E6基因（）37.作为内参RNaseP（）38.检测艰难梭菌tcdA（）39.作为passivereference（）40.检测沙门氏菌invA（）答案：36D37B38A39C40A三、判断题（每题1分，共10分。正确打“√”，错误打“×”）41.数字PCR对PCR抑制剂耐受性高于qPCR，因此无需进行提取质控。（）答案：×42.熔解曲线峰型对称且Tm一致，即可排除引物二聚体。（）答案：×43.使用PMA处理样本后，必须立即进行光照激活，否则将失去区分死活菌能力。（）答案：√44.在多重PCR体系中，引物二聚体ΔG<9kcal/mol时，必须重新设计引物。（）答案：√45.结核分枝杆菌rpoBS531L突变导致Tm下降约2.5°C，可用高分辨率熔解曲线区分。（）答案：√46.临床PCR实验室空气流向应为：试剂准备区→标本制备区→扩增区。（）答案：×47.当qPCR效率>110%时，可通过降低引物浓度或提高退火温度进行优化。（）答案：√48.使用SYBRGreenI时，扩增长度越短，荧光信号越强。（）答案：√49.在ddPCR中，微滴数<10000时，定量结果仍可靠。（）答案：×50.对于高GC模板（>70%），加入5%DMSO可降低Tm并提高扩增效率。（）答案：√四、填空题（每空2分，共20分）51.根据《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》，PCR实验室应至少划分________、________、________三个区域。答案：试剂储存与准备区、标本制备区、扩增和产物分析区52.实时荧光PCR扩增效率计算公式为：效率=________−1×100%。答案：10^(−1/斜率)53.数字PCR中，泊松分布修正公式为：copies/微滴=−ln(________)。答案：1−阳性微滴比例54.当使用磁珠法提取200μL血浆中HBVDNA时，洗脱体积50μL，提取回收率80%，若原始浓度为500IU/mL，则终浓度为________IU/mL。答案：160055.结核分枝杆菌rpoB81bp核心区最常见的RIF耐药突变位点为________密码子。答案：53156.在建立mcr1qPCR时，其探针5′端标记________荧光基团，3′端标记________淬灭基团。答案：FAM；BHQ157.用于区分艰难梭菌死活菌的PMA最佳工作浓度为________μM。答案：5058.根据CLSIM100，CRE表型筛选折点中，美罗培南MIC≥________mg/L即为非敏感。答案：159.当qPCR标准曲线R²<________时，需重新制备标准品。答案：0.9960.在运行ABI7500软件时，基线设定应避开________循环之前的信号波动。答案：3五、简答题（每题10分，共30分）61.简述临床PCR实验室防止扩增产物污染的技术措施。答案：（1）物理分区：严格“三区两缓冲”布局，单向流动，物品专用；（2）UNG酶体系：使用dUTP替代dTTP，扩增前UNG酶水解既往含dUTP产物；（3）定时紫外照射：实验结束后对各区紫外照射≥30min，重点照射台面与移液器；（4）耗材一次性：吸头、离心管、手套即用即弃，避免重复使用；（5）阴性对照设置：每批次加NTC、提取空白、抑制对照，监控污染；（6）定期环境擦拭：用1%次氯酸钠擦拭后，再以75%乙醇去除残留氯；（7）人员培训：考核上岗，限制跨区走动，建立污染应急预案；（8）空气过滤：标本制备区安装HEPA正压通风，降低气溶胶负荷；（9）试剂分装：大包装试剂分装后一次性使用，减少开盖次数；（10）定期监测：每月进行环境擦拭检测，若阳性立即停用并溯源。62.某实验室自建HPV16/18双重qPCR，使用SYBRGreenI，结果HPV18出现非特异峰，Tm=79.5°C，与目的峰Tm=81.2°C仅差1.7°C。请给出优化方案并说明原理。答案：（1）重新设计引物：使用PrimerBLAST验证，确保HPV18引物对与其他型别同源性<70%，避免交叉；（2）提高退火温度：每次+0.5°C梯度测试至83°C，选择最高且效率>90%的温度，利用热力学差异消除非特异；（3）降低引物浓度：从0.8μM降至0.3μM，减少引物二聚体及非特异结合；（4）添加增强剂：加入5%DMSO或1M甜菜碱，降低非特异Tm，扩大差异；（5）缩短扩增长度：将HPV18扩增长度由180bp缩短至100bp，使目的Tm升高，差异>2°C；（6）使用探针法：改用TaqManMGB探针，Tm升高3–4°C，彻底消除SYBRGreenI非特异干扰；（7）增加预变性时间：95°C5min，充分裂解二级结构，减少非特异起始；（8）验证优化：重新进行特异性测试，含HPV6/11/31/33/45/52/58等高浓度模板，确保无交叉。6