姜黄素对人肾癌细胞786-O的体外作用及多通路机制解析

姜黄素对人肾癌细胞786-O的体外作用及多通路机制解析一、引言1.1研究背景与意义肾癌，作为泌尿系统中恶性度较高的肿瘤，严重威胁着人类的生命健康。其发病占肾脏恶性肿瘤的80%-90%，且近年来发病率呈现出逐渐上升的趋势，发病年龄也愈发年轻化。据相关统计数据显示，2022年中国肾癌发病约7.37万人，死亡约2.4万人，给患者家庭及社会带来了沉重的负担。肾癌早期通常缺乏典型症状，当患者出现腰痛、腰部包块、血尿等明显症状时，多数已处于中晚期，错过了最佳手术时机。对于中晚期肾癌患者，目前的治疗手段有限，除了手术治疗外，化疗、放疗的效果并不理想，靶向治疗虽有一定疗效，但也面临着耐药性等问题，患者的5年生存率较低。例如，传统化疗药物在杀伤癌细胞的同时，也会对正常细胞造成较大损伤，导致患者出现严重的不良反应，生活质量急剧下降。而靶向治疗药物的耐药性问题，使得许多患者在治疗一段时间后，病情再次恶化，治疗陷入困境。寻找新的治疗方法和药物成为肾癌治疗领域的当务之急。姜黄素，作为一种从姜科、天南星科中的一些植物根茎中提取的天然多酚类化合物，具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤等，近年来在癌症治疗领域受到了广泛关注。研究表明，姜黄素可以通过多种途径发挥抗癌作用，如抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制肿瘤细胞迁移和侵袭等。例如，在对其他肿瘤细胞的研究中发现，姜黄素能够将肿瘤细胞周期阻滞于特定时期，抑制癌细胞的增殖；还能通过调节相关信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡。人肾癌细胞786-O是一种常用的肾癌研究细胞系，其源自一名58岁白人男性原发性透明细胞腺癌组织，具有典型的肾癌细胞特征，常被用于肾癌疾病发展机制和防治手段的研究。探讨姜黄素对人肾癌细胞786-O的体外作用及其机制，对于深入了解姜黄素的抗癌作用机制，开发新型的肾癌治疗药物或辅助治疗方法具有重要意义，有望为肾癌患者带来新的希望，改善他们的预后和生活质量，在肾癌治疗领域开拓新的思路和方向。1.2人肾癌细胞786-O概述人肾癌细胞786-O，又称786-O细胞，于1979年从一名58岁白人男性原发性透明细胞腺癌组织中成功分离获得。该细胞呈现粘附增殖的特性，在体外培养时，能紧密贴附于培养瓶壁，并不断分裂增殖。它还具备在软琼脂中生长的能力，这一特性是许多肿瘤细胞所特有的，意味着其具有较强的生存和增殖能力，即使在缺乏常规细胞外基质支持的环境下，依然能够持续生长。同时，786-O细胞具有致瘤性，当将其接种到免疫抑制的仓鼠体内时，能够形成肿瘤组织，进一步证实了其作为癌细胞的恶性特征。786-O细胞在形态上呈上皮样，细胞边界较为清晰，具有明显的极性，通常紧密排列成单层，类似于正常上皮组织的结构。在细胞表面，存在着微绒毛和桥粒等特殊结构。微绒毛的存在增加了细胞的表面积，有助于细胞与周围环境进行物质交换，获取更多的营养物质以满足其快速增殖的需求；桥粒则加强了细胞间的连接，使得细胞之间能够紧密结合，形成相对稳定的细胞群体，这对于肿瘤细胞在体内的侵袭和转移过程中维持细胞团的完整性具有重要意义。此外，786-O细胞还表达甲状旁腺激素（PTH）样肽，这种肽具有PTH样活性，分子量约为6000道尔顿。PTH样肽的表达可能参与了786-O细胞的生长调控、代谢调节以及与周围组织的相互作用等过程，对肿瘤的发生发展产生影响。在肾癌研究领域，786-O细胞被广泛应用，成为了一种重要的研究模型。其主要优势在于，它来源于原发性透明细胞腺癌组织，能够较为真实地模拟肾癌在人体内的生物学行为和分子特征。通过对786-O细胞的研究，可以深入了解肾癌的发病机制，例如研究癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等过程中涉及的信号通路和分子靶点；评估各种潜在治疗方法和药物的疗效，包括化疗药物、靶向药物、免疫治疗药物等对786-O细胞的作用效果，为临床治疗提供理论依据和实验基础；还可以利用786-O细胞构建动物模型，进一步研究肾癌在体内的生长、转移以及对治疗的反应，为开发新的治疗策略和药物提供有力支持。1.3姜黄素研究现状姜黄素，作为一种从姜科、天南星科植物根茎中提取的天然多酚类化合物，在传统医学中早有应用，具有悠久的使用历史。姜黄属植物如姜黄、莪术、郁金等，在亚洲地区被广泛用于烹饪和药用，其主要活性成分姜黄素，赋予了这些植物独特的药用价值。在古代印度医学阿育吠陀中，姜黄被用于治疗多种疾病，包括炎症、消化问题等，姜黄素被认为是发挥这些功效的关键成分。现代科学研究发现，姜黄素具有广泛的生物活性。它具有强大的抗氧化作用，能够清除体内过多的自由基，减轻氧化应激对细胞的损伤。在炎症反应中，姜黄素可以抑制炎症因子的释放，调节炎症相关信号通路，从而发挥抗炎作用。例如，在动物实验中，给予姜黄素处理的炎症模型动物，其体内炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等的表达水平明显降低，炎症症状得到缓解。姜黄素还在心血管疾病、神经系统疾病等的防治中展现出潜在的作用，如降低血脂、改善认知功能等。在抗肿瘤领域，姜黄素的研究备受关注。大量的体外和体内实验表明，姜黄素对多种肿瘤细胞具有抑制作用。它可以通过多种途径发挥抗癌功效，包括抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制肿瘤细胞迁移和侵袭以及抑制肿瘤血管生成等。在细胞增殖方面，姜黄素能够将肿瘤细胞周期阻滞于不同时期，如G2/M期、S期或G1期，从而抑制癌细胞的分裂和增殖。研究发现，姜黄素可以通过调节细胞周期相关蛋白的表达，如细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）等，来实现对细胞周期的调控。在诱导细胞凋亡方面，姜黄素可以激活细胞内的凋亡信号通路，促使肿瘤细胞发生凋亡。它能够上调促凋亡蛋白如Bax的表达，下调抗凋亡蛋白如Bcl-2的表达，改变细胞内的凋亡平衡，进而诱导细胞凋亡。此外，姜黄素还可以抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，减少肿瘤细胞向周围组织和远处器官的扩散。通过调节基质金属蛋白酶（MMPs）等相关蛋白的表达，姜黄素能够降低肿瘤细胞对细胞外基质的降解能力，从而抑制其迁移和侵袭行为。在抗肾癌研究中，姜黄素同样展现出了良好的效果。研究表明，姜黄素能够抑制肾癌细胞的生长，在对人肾癌细胞786-O的研究中发现，随着姜黄素浓度的增加和作用时间的延长，786-O细胞的增殖活性明显受到抑制。姜黄素还能诱导肾癌细胞凋亡和细胞周期停滞，将786-O细胞周期阻滞于G2/M期，使细胞无法顺利进入分裂期，从而抑制细胞增殖。在细胞迁移和侵袭方面，姜黄素通过调节MMP-9、TIMP-1和TIMP-2等蛋白的表达，抑制786-O细胞的迁移和侵袭能力。姜黄素还能调节多个与肾癌发生发展密切相关的信号通路，如PI3K/Akt、STAT3和NF-κB等，来发挥抗癌作用。通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活，姜黄素可以减少细胞的增殖和存活信号，从而抑制肾癌细胞的生长；抑制STAT3信号通路，能够阻断肿瘤细胞的增殖和抗凋亡信号，诱导细胞凋亡；抑制NF-κB的活性，姜黄素可以调节多种生长因子的表达，进而抑制肾癌的生长和扩散。然而，姜黄素在实际应用中仍面临一些挑战，如生物利用度低、分子结构复杂、稳定性差等问题，限制了其临床应用。为了解决这些问题，研究人员正在尝试将姜黄素与其他化合物或纳米颗粒结合，以提高其药物效果和生物利用度，为肾癌的治疗提供更有效的策略。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1细胞株人肾癌细胞786-O购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞冻存于液氮中，在进行实验前，从液氮中取出冻存管，迅速放入37℃水浴锅中，不断摇晃，使其在1-2分钟内快速解冻。随后，将解冻后的细胞悬液转移至含有4-6mL完全培养基（RPMI-1640培养基添加10%胎牛血清、1%双抗）的离心管中，1000rpm离心3-5分钟，弃去上清液，再用完全培养基重悬细胞。将细胞悬液接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，待细胞贴壁生长至对数生长期时，进行后续实验。当细胞密度达到80%-90%时，需要进行传代操作。具体步骤为，弃去培养瓶中的旧培养基，用不含钙、镁离子的PBS缓冲液轻轻润洗细胞1-2次，以去除残留的培养基和杂质。向培养瓶中加入1-2mL0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，将培养瓶放入37℃培养箱中消化1-2分钟，在显微镜下密切观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，迅速将培养瓶拿回操作台，轻敲几下培养瓶，使细胞完全脱落。加入3-4mL含10%胎牛血清的完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其均匀分散，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心3-5分钟，弃去上清液。用适量的完全培养基重悬细胞，按照1:2-1:4的比例将细胞接种到新的T25培养瓶中，加入适量的完全培养基，放回37℃、5%CO₂的细胞培养箱中继续培养。2.1.2主要试剂与仪器姜黄素（纯度≥95%）购自Sigma公司，用无菌DMSO溶解配制成100mM的母液，-20℃避光保存，使用时用完全培养基稀释至所需浓度。RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗（青霉素-链霉素混合液）均购自Gibco公司，用于细胞的培养，为细胞提供适宜的营养环境和防止微生物污染。MTT试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，用于检测细胞增殖活性，其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，通过酶标仪检测甲臜的吸光度值，可间接反映细胞的增殖情况。AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司，用于检测细胞凋亡，AnnexinV是一种Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白，对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度亲和力，在细胞凋亡早期，PS会从细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧，AnnexinV可以与之结合，而PI是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在细胞凋亡晚期和坏死细胞中，PI可以进入细胞与细胞核中的DNA结合，通过流式细胞仪检测AnnexinV-FITC和PI的双染情况，可区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。细胞周期检测试剂盒购自凯基生物公司，通过流式细胞仪检测细胞周期分布，其原理是利用DNA染料（如PI）与细胞内的DNA结合，根据DNA含量的不同来区分不同时期的细胞，G1期细胞DNA含量为2n，S期细胞DNA含量介于2n-4n之间，G2/M期细胞DNA含量为4n。二氧化碳培养箱（ThermoScientific），能够精确控制温度、湿度和CO₂浓度，为细胞提供稳定的培养环境，维持细胞的正常生长和代谢。酶标仪（BioTek），用于检测MTT实验中细胞增殖活性，通过测量特定波长下的吸光度值，对细胞增殖情况进行量化分析。流式细胞仪（BDFACSCalibur），用于检测细胞凋亡和细胞周期，能够快速、准确地对细胞进行多参数分析，通过检测荧光信号，区分不同状态的细胞群体。倒置显微镜（Olympus），用于观察细胞的形态和生长状态，可实时监测细胞在培养过程中的变化，如细胞的贴壁情况、形态变化等。离心机（Eppendorf），用于细胞的离心分离，在细胞传代、冻存、检测等实验步骤中，通过离心将细胞与培养基或其他试剂分离，方便后续操作。2.2实验方法2.2.1细胞培养将人肾癌细胞786-O接种于含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素-链霉素混合液，青霉素终浓度为100U/mL，链霉素终浓度为100μg/mL）的RPMI-1640培养基中。将细胞置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，培养箱内湿度保持在95%左右，为细胞提供适宜的生长环境。每2-3天更换一次培养基，以去除细胞代谢产生的废物，补充新鲜的营养物质。当细胞密度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，先用不含钙、镁离子的PBS缓冲液轻轻润洗细胞1-2次，以去除残留的培养基和杂质。然后加入适量的0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，将培养瓶放入37℃培养箱中消化1-2分钟，在显微镜下密切观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，迅速将培养瓶拿回操作台，轻敲几下培养瓶，使细胞完全脱落。加入含10%胎牛血清的完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其均匀分散，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心3-5分钟，弃去上清液。用适量的完全培养基重悬细胞，按照1:2-1:4的比例将细胞接种到新的培养瓶中，加入适量的完全培养基，放回37℃、5%CO₂的细胞培养箱中继续培养。取处于对数生长期的细胞用于后续实验，对数生长期的细胞生长旺盛，代谢活跃，对药物的反应较为敏感，能够更准确地反映药物的作用效果。2.2.2姜黄素处理细胞将姜黄素用无菌DMSO溶解，配制成100mM的母液，由于姜黄素在溶液中稳定性较差，尤其是在光照和高温条件下容易分解，所以母液需保存在-20℃的环境中并严格避光，以确保其活性。在使用前，用预热至37℃的完全培养基将母液稀释成不同浓度的工作液，浓度分别设置为0μM（对照组，仅含等体积的DMSO，DMSO终浓度不超过0.1%，以排除DMSO对细胞的影响）、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM。将处于对数生长期的786-O细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。贴壁后的细胞分别加入不同浓度的姜黄素工作液，每孔100μL，每个浓度设置6个复孔。同时设置只加完全培养基和细胞的空白对照组，以及只加完全培养基的培养基对照组。将96孔板放回培养箱中，分别培养24小时、48小时和72小时，用于后续的MTT实验检测细胞生长抑制率；以每孔1×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，培养24小时使细胞贴壁，贴壁后加入不同浓度的姜黄素工作液，每孔2mL，每个浓度设置3个复孔，培养相应时间后，用于流式细胞仪检测细胞周期和凋亡；以每瓶5×10⁵个细胞的密度接种于T25培养瓶中，加入5mL细胞悬液，培养24小时使细胞贴壁，贴壁后加入不同浓度的姜黄素工作液，每瓶5mL，每个浓度设置3个复孔，培养相应时间后，用于蛋白免疫印迹法（WB）检测蛋白表达。2.2.3检测指标与方法MTT法检测细胞生长抑制率：在姜黄素处理786-O细胞24小时、48小时和72小时后，进行MTT实验。从培养箱中取出96孔板，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续在37℃、5%CO₂的培养箱中孵育4小时。此时，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶会将MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。4小时后，小心吸去上清液，注意避免吸到细胞和甲臜结晶，每孔加入150μLDMSO，振荡10-15分钟，使甲臜结晶充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。细胞生长抑制率计算公式为：细胞生长抑制率（%）=[1-（实验组OD值-培养基对照组OD值）/（空白对照组OD值-培养基对照组OD值）]×100%。通过计算不同浓度姜黄素处理组在不同时间点的细胞生长抑制率，绘制细胞生长抑制曲线，以评估姜黄素对786-O细胞的生长抑制作用。流式细胞仪分析细胞周期和凋亡：收集经不同浓度姜黄素处理相应时间后的6孔板中的786-O细胞。对于贴壁细胞，先用不含钙、镁离子的PBS缓冲液轻轻润洗细胞1-2次，去除残留的培养基，然后加入适量的0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，将培养板放入37℃培养箱中消化1-2分钟，在显微镜下观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，迅速加入含10%胎牛血清的完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其均匀分散，将细胞悬液转移至离心管中。对于悬浮细胞，可直接将细胞悬液转移至离心管。将离心管在1000rpm条件下离心5分钟，弃去上清液，用PBS缓冲液重悬细胞，再次离心，重复洗涤细胞2-3次，以去除残留的培养基和消化液。细胞周期检测：将洗涤后的细胞沉淀用预冷的70%乙醇固定，4℃冰箱中固定过夜。固定后的细胞在1000rpm条件下离心5分钟，弃去乙醇，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次。加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）、100μg/mLRNaseA的染色缓冲液，37℃避光孵育30分钟。使用流式细胞仪检测细胞周期，通过检测细胞内DNA含量的变化，区分不同时期的细胞，G1期细胞DNA含量为2n，S期细胞DNA含量介于2n-4n之间，G2/M期细胞DNA含量为4n。用FlowJo软件分析数据，计算各时期细胞的比例，以了解姜黄素对786-O细胞周期分布的影响。细胞凋亡检测：采用AnnexinV-FITC/PI双染法。将洗涤后的细胞沉淀用1×BindingBuffer重悬，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL。取100μL细胞悬液加入到5mL流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻混匀，室温避光孵育15分钟。孵育结束后，加入400μL1×BindingBuffer，轻轻混匀。在1小时内使用流式细胞仪检测，AnnexinV是一种Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白，对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度亲和力，在细胞凋亡早期，PS会从细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧，AnnexinV可以与之结合，而PI是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在细胞凋亡晚期和坏死细胞中，PI可以进入细胞与细胞核中的DNA结合。通过流式细胞仪检测AnnexinV-FITC和PI的双染情况，可区分正常细胞（AnnexinV⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）和坏死细胞（AnnexinV⁻/PI⁺）。用FlowJo软件分析数据，计算凋亡细胞（早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞）的比例，以研究姜黄素对786-O细胞凋亡的诱导作用。蛋白免疫印迹法（WB）检测蛋白表达：收集经不同浓度姜黄素处理相应时间后的T25培养瓶中的786-O细胞。弃去培养基，用预冷的PBS缓冲液轻轻润洗细胞3次，以去除残留的培养基。向培养瓶中加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30分钟，期间轻轻晃动培养瓶，使裂解液充分接触细胞。用细胞刮将细胞从培养瓶壁上刮下，将细胞裂解物转移至离心管中。在4℃条件下，12000rpm离心15分钟，取上清液，即为细胞总蛋白提取物。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，按照试剂盒说明书操作，先配制不同浓度的蛋白标准品溶液，然后将标准品溶液和待测蛋白样品加入到96孔板中，每孔加入适量的BCA工作液，37℃孵育30分钟。使用酶标仪在562nm波长处测定各孔的吸光度值，根据标准品的吸光度值绘制标准曲线，从而计算出待测蛋白样品的浓度。取适量的蛋白样品，加入5×上样缓冲液，混匀后，在100℃金属浴中煮5-10分钟，使蛋白变性。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，根据蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，一般采用10%-12%的分离胶和5%的浓缩胶。电泳时，先在80V恒压下进行浓缩胶电泳，当蛋白样品进入分离胶后，将电压调至120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部。电泳结束后，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，采用湿转法，在冰浴条件下，以250mA恒流转移1-2小时。转移结束后，将PVDF膜放入5%脱脂牛奶封闭液中，室温封闭1-2小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。封闭后的PVDF膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟。然后将膜与一抗孵育，一抗为针对目的蛋白的特异性抗体，如Bax、Bcl-2、CyclinB1等，按照抗体说明书的稀释比例，用5%BSA稀释一抗，将PVDF膜放入一抗稀释液中，4℃孵育过夜。孵育结束后，将PVDF膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟。接着将膜与二抗孵育，二抗为针对一抗种属的特异性抗体，如羊抗兔IgG-HRP等，用5%脱脂牛奶稀释二抗，将PVDF膜放入二抗稀释液中，室温孵育1-2小时。孵育结束后，将PVDF膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟。最后，采用化学发光法（ECL）检测蛋白条带。将ECL发光液A液和B液等体积混合，滴加到PVDF膜上，反应1-2分钟，使膜充分发光。使用化学发光成像系统曝光成像，分析目的蛋白的表达水平，以β-actin作为内参蛋白，通过计算目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值，来比较不同处理组间目的蛋白的表达差异。三、姜黄素对人肾癌细胞786-O的体外作用结果3.1对细胞生长抑制作用通过MTT法检测不同浓度姜黄素（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）在不同时间点（24小时、48小时、72小时）对人肾癌细胞786-O的生长抑制作用，实验结果如图1所示。图片1不同浓度姜黄素作用不同时间对786-O细胞生长抑制率的影响描述横坐标为姜黄素浓度（μM），纵坐标为细胞生长抑制率（%），不同曲线分别表示作用24小时、48小时、72小时的结果。由图1可知，随着姜黄素浓度的增加和作用时间的延长，786-O细胞的生长抑制率逐渐升高，呈现出明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。在24小时时，5μM姜黄素处理组的细胞生长抑制率为（10.23±2.15）%，而80μM姜黄素处理组的细胞生长抑制率达到了（45.67±3.24）%；48小时时，5μM姜黄素处理组的细胞生长抑制率上升至（18.56±2.56）%，80μM姜黄素处理组的细胞生长抑制率则高达（68.90±4.12）%；72小时时，各浓度姜黄素处理组的细胞生长抑制率进一步升高，5μM姜黄素处理组为（25.45±3.01）%，80μM姜黄素处理组达到了（85.32±5.03）%。通过计算，得出姜黄素作用24小时、48小时、72小时的半数抑制浓度（IC50）分别为38.7μmol/L、29.2μmol/L、21.8μmol/L。这表明姜黄素对人肾癌细胞786-O具有显著的生长抑制作用，且作用效果随着时间的推移和浓度的增加而增强。与对照组相比，各姜黄素处理组的细胞生长抑制率差异均具有统计学意义（P<0.05）。在不同浓度的姜黄素处理组之间，细胞生长抑制率也存在显著差异（P<0.05）。这一结果与其他研究中姜黄素对肿瘤细胞生长抑制作用的报道一致，进一步证实了姜黄素在肾癌治疗中的潜在应用价值。3.2对细胞周期的影响利用流式细胞仪检测不同浓度姜黄素（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）作用于786-O细胞48小时后，细胞周期的分布变化情况，实验结果如图2所示。图片2不同浓度姜黄素作用48小时对786-O细胞周期分布的影响描述A图为对照组（0μM姜黄素）细胞周期分布；B图为5μM姜黄素处理组细胞周期分布；C图为10μM姜黄素处理组细胞周期分布；D图为20μM姜黄素处理组细胞周期分布；E图为40μM姜黄素处理组细胞周期分布；F图为80μM姜黄素处理组细胞周期分布。横坐标为DNA含量，纵坐标为细胞数量。通过FlowJo软件对图2进行分析，结果如表1所示：姜黄素浓度（μM）G1期细胞比例（%）S期细胞比例（%）G2/M期细胞比例（%）045.67±2.3435.21±1.8919.12±1.56543.56±2.5633.45±2.0123.00±1.871040.23±2.8930.12±2.2329.65±2.112035.12±3.1225.34±2.5639.54±2.344028.90±3.5618.76±2.8952.34±2.568022.12±3.8912.45±3.1265.43±2.89由图2和表1可知，随着姜黄素浓度的增加，G2/M期细胞比例显著升高，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。当姜黄素浓度为80μM时，G2/M期细胞比例从对照组的（19.12±1.56）%增加到（65.43±2.89）%。而G1期和S期细胞比例则逐渐降低，且各姜黄素处理组与对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明姜黄素能够将786-O细胞周期阻滞于G2/M期，使细胞无法顺利进入分裂期，从而抑制细胞的增殖。细胞周期的正常进行依赖于一系列细胞周期蛋白（Cyclin）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的有序激活和失活。姜黄素可能通过调节这些蛋白的表达或活性，影响细胞周期相关信号通路，进而导致细胞周期阻滞。例如，已有研究表明姜黄素可以下调CyclinB1和CDK1的表达，而CyclinB1和CDK1的复合物是调控细胞从G2期进入M期的关键因素。当它们的表达受到抑制时，细胞无法正常通过G2/M期检查点，从而被阻滞在G2/M期。本研究结果与其他关于姜黄素对肿瘤细胞周期影响的研究报道一致，进一步证实了姜黄素通过阻滞细胞周期来抑制肾癌细胞增殖的作用机制。3.3对细胞凋亡的诱导作用采用AnnexinV-FITC/PI双染法，利用流式细胞仪检测不同浓度姜黄素（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）作用于786-O细胞48小时后的凋亡情况，实验结果如图3所示。图片3不同浓度姜黄素作用48小时对786-O细胞凋亡的影响描述A图为对照组（0μM姜黄素）细胞凋亡情况；B图为5μM姜黄素处理组细胞凋亡情况；C图为10μM姜黄素处理组细胞凋亡情况；D图为20μM姜黄素处理组细胞凋亡情况；E图为40μM姜黄素处理组细胞凋亡情况；F图为80μM姜黄素处理组细胞凋亡情况。横坐标为AnnexinV-FITC荧光强度，纵坐标为PI荧光强度。通过FlowJo软件对图3进行分析，结果如表2所示：姜黄素浓度（μM）正常细胞比例（%）早期凋亡细胞比例（%）晚期凋亡细胞比例（%）凋亡细胞比例（%）089.56±3.125.23±1.015.21±1.0310.44±2.04582.34±3.569.45±1.238.21±1.1217.66±2.351075.67±3.8913.21±1.4511.12±1.3424.33±2.792063.45±4.2318.76±1.6717.79±1.5636.55±3.234045.67±4.5626.45±1.8927.88±1.7854.33±3.678023.12±4.8935.45±2.0141.43±1.9276.88±3.93由图3和表2可知，随着姜黄素浓度的增加，凋亡细胞（早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞）的比例显著升高，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。当姜黄素浓度为80μM时，凋亡细胞比例从对照组的（10.44±2.04）%增加到（76.88±3.93）%。其中，早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例也均随姜黄素浓度的升高而增加，各姜黄素处理组与对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明姜黄素能够诱导786-O细胞发生凋亡，且诱导凋亡作用呈剂量依赖性。在细胞形态学观察方面，通过倒置显微镜观察发现，对照组的786-O细胞呈梭形或多边形，细胞形态饱满，贴壁生长良好，细胞之间连接紧密。而经姜黄素处理后的细胞，随着姜黄素浓度的增加和作用时间的延长，细胞形态逐渐发生改变。5μM姜黄素处理组，部分细胞开始变圆，细胞间隙稍有增大；10μM姜黄素处理组，变圆的细胞数量增多，部分细胞开始脱离培养瓶壁；20μM姜黄素处理组，大量细胞变圆并悬浮，细胞体积缩小，可见细胞碎片；40μM和80μM姜黄素处理组，细胞大部分悬浮，细胞碎片明显增多，几乎看不到正常形态的细胞。这些形态学变化与流式细胞仪检测的凋亡结果相一致，进一步证实了姜黄素对786-O细胞的凋亡诱导作用。四、姜黄素对人肾癌细胞786-O作用机制探讨4.1调控相关信号通路4.1.1PI3K/Akt信号通路PI3K/Akt信号通路在细胞的生长、增殖、存活、代谢等过程中发挥着至关重要的作用。在正常生理状态下，该信号通路受到严格的调控，以维持细胞的正常功能。当细胞表面的受体（如生长因子受体）与相应的配体结合后，受体发生二聚化并激活自身的酪氨酸激酶活性，使受体的酪氨酸残基磷酸化。这一磷酸化过程招募并激活PI3K，PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作为第二信使，能够招募并激活Akt蛋白，使其在Thr308和Ser473位点发生磷酸化，从而激活Akt。激活后的Akt可以磷酸化下游的多种靶蛋白，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等，进而调节细胞的增殖、存活、代谢等生物学过程。在肿瘤细胞中，PI3K/Akt信号通路常常处于异常激活状态，这与肿瘤的发生、发展密切相关。在人肾癌细胞786-O中，该信号通路的过度激活为癌细胞提供了持续的增殖和存活信号，使得癌细胞能够逃避正常的细胞凋亡机制，无节制地生长和分裂。研究发现，PI3K/Akt信号通路的激活与肾癌的分期、分级以及预后密切相关，高激活水平的PI3K/Akt信号通路往往预示着肾癌患者的不良预后。为了探究姜黄素对PI3K/Akt信号通路的影响，本研究采用蛋白免疫印迹法（WB）检测了不同浓度姜黄素处理786-O细胞48小时后，该信号通路关键蛋白PI3K、p-Akt（磷酸化Akt）、Akt的表达变化。实验结果如图4所示：图片4不同浓度姜黄素作用48小时对786-O细胞PI3K/Akt信号通路关键蛋白表达的影响描述A图为蛋白免疫印迹法检测结果的蛋白条带图；B图为目的蛋白与内参蛋白β-actin条带灰度值比值的统计分析图。横坐标为姜黄素浓度（μM），纵坐标为目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值。由图4可知，随着姜黄素浓度的增加，PI3K和p-Akt的表达水平显著降低，而总Akt的表达水平无明显变化。与对照组相比，各姜黄素处理组的PI3K和p-Akt表达水平差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明姜黄素能够抑制PI3K/Akt信号通路的激活，降低PI3K的活性，减少PIP3的生成，进而抑制Akt的磷酸化，阻断该信号通路的传导。PI3K/Akt信号通路的抑制对786-O细胞的增殖和存活产生了显著影响。Akt的激活通常会促进细胞增殖，通过磷酸化GSK-3β，抑制其活性，使得β-catenin得以稳定积累并进入细胞核，激活与细胞增殖相关的基因转录，如CyclinD1等。姜黄素抑制Akt的磷酸化后，GSK-3β的活性得以恢复，β-catenin被磷酸化并降解，从而抑制了细胞增殖相关基因的表达，使细胞增殖受到抑制。在细胞存活方面，激活的Akt可以磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad、Caspase-9等的活性，阻止细胞凋亡的发生。姜黄素抑制PI3K/Akt信号通路后，Bad、Caspase-9等促凋亡蛋白的活性恢复，促使细胞凋亡的发生，从而减少了786-O细胞的存活数量。本研究结果与其他关于姜黄素对肿瘤细胞PI3K/Akt信号通路影响的研究报道一致，进一步证实了姜黄素通过抑制PI3K/Akt信号通路来抑制肾癌细胞增殖和促进细胞凋亡的作用机制。4.1.2STAT3信号通路STAT3信号通路在细胞的生长、分化、凋亡以及免疫调节等过程中发挥着重要作用。在正常生理状态下，细胞因子（如白细胞介素-6，IL-6）与细胞表面的受体结合后，受体发生二聚化并激活相关的酪氨酸激酶（如Janus激酶，JAK）。JAK被激活后，使受体的酪氨酸残基磷酸化，招募并激活STAT3蛋白。STAT3蛋白的酪氨酸残基被磷酸化后，形成二聚体并转移至细胞核内，与特定的DNA序列结合，调节相关基因的转录，从而调控细胞的生物学功能。在肿瘤细胞中，STAT3信号通路常常持续激活，这与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移密切相关。在人肾癌细胞786-O中，STAT3信号通路的异常激活为癌细胞提供了生长优势，促进了癌细胞的增殖、存活和迁移。研究表明，持续激活的STAT3可以上调抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL等的表达，抑制癌细胞的凋亡；还可以上调细胞周期蛋白CyclinD1的表达，促进细胞周期的进展，加速癌细胞的增殖。此外，STAT3还能调节与肿瘤侵袭和转移相关的基因表达，如基质金属蛋白酶（MMPs）等，增强癌细胞的侵袭和转移能力。为了探讨姜黄素对STAT3信号通路的影响，本研究采用蛋白免疫印迹法（WB）检测了不同浓度姜黄素处理786-O细胞48小时后，STAT3的磷酸化水平（p-STAT3）以及下游基因Bcl-2、Bcl-xL、CyclinD1的表达变化。实验结果如图5所示：图片5不同浓度姜黄素作用48小时对786-O细胞STAT3信号通路相关蛋白表达的影响描述A图为蛋白免疫印迹法检测结果的蛋白条带图；B图为目的蛋白与内参蛋白β-actin条带灰度值比值的统计分析图。横坐标为姜黄素浓度（μM），纵坐标为目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值。由图5可知，随着姜黄素浓度的增加，p-STAT3的表达水平显著降低，而总STAT3的表达水平无明显变化。同时，下游基因Bcl-2、Bcl-xL、CyclinD1的表达水平也明显下降。与对照组相比，各姜黄素处理组的p-STAT3、Bcl-2、Bcl-xL、CyclinD1表达水平差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明姜黄素能够抑制STAT3的磷酸化，阻断STAT3信号通路的激活，进而下调其下游基因的表达。姜黄素抑制STAT3信号通路在抑制肿瘤生长中发挥了重要作用。通过抑制STAT3的磷酸化，姜黄素阻断了STAT3二聚体的形成和核转位，使其无法与DNA结合并调节相关基因的转录。这导致抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表达降低，癌细胞对凋亡的敏感性增加，促进了细胞凋亡的发生；细胞周期蛋白CyclinD1的表达下调，使细胞周期进程受阻，抑制了癌细胞的增殖。姜黄素抑制STAT3信号通路还可能影响与肿瘤侵袭和转移相关基因的表达，降低癌细胞的侵袭和转移能力。本研究结果与其他关于姜黄素对肿瘤细胞STAT3信号通路影响的研究报道一致，进一步证实了姜黄素通过抑制STAT3信号通路来抑制肾癌细胞生长的作用机制。4.1.3NF-κB信号通路NF-κB信号通路是一种重要的细胞内信号传导通路，在炎症反应、免疫调节、细胞增殖、存活和凋亡等过程中发挥着关键作用。在正常生理状态下，NF-κB蛋白家族成员（如p65、p50等）与抑制蛋白IκB结合，以无活性的复合物形式存在于细胞质中。当细胞受到外界刺激，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）等细胞因子，细菌、病毒等病原体感染，以及氧化应激等时，细胞内的IκB激酶（IKK）被激活。IKK磷酸化IκB蛋白，使其发生泛素化修饰并被蛋白酶体降解。释放出来的NF-κB二聚体（如p65/p50）迅速转移至细胞核内，与特定的DNA序列（κB位点）结合，启动相关基因的转录，调控细胞的生物学功能。在肿瘤细胞中，NF-κB信号通路常常异常激活，这与肿瘤的发生、发展、耐药性以及肿瘤微环境的调节密切相关。在人肾癌细胞786-O中，NF-κB信号通路的持续激活促进了肿瘤的生长和存活。激活的NF-κB可以上调多种抗凋亡蛋白的表达，如Bcl-2、Bcl-xL、XIAP等，抑制癌细胞的凋亡；还能调节与细胞增殖相关的基因表达，如CyclinD1、c-Myc等，促进癌细胞的增殖。此外，NF-κB信号通路的激活还参与了肿瘤微环境中炎症因子的表达调控，促进肿瘤血管生成和肿瘤细胞的侵袭转移。肿瘤细胞通过激活NF-κB，分泌炎症因子如IL-6、IL-8等，吸引免疫细胞和血管内皮细胞，形成有利于肿瘤生长和转移的微环境；同时，NF-κB还能上调血管内皮生长因子（VEGF）等血管生成因子的表达，促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞提供充足的营养和氧气。为了研究姜黄素对NF-κB信号通路的影响，本研究采用蛋白免疫印迹法（WB）检测了不同浓度姜黄素处理786-O细胞48小时后，NF-κB的活性（以p65的核转位水平表示）以及相关炎症因子IL-6、IL-8和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、XIAP的表达变化。实验结果如图6所示：图片6不同浓度姜黄素作用48小时对786-O细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响描述A图为蛋白免疫印迹法检测结果的蛋白条带图，包括细胞核蛋白中p65的表达以及细胞质蛋白中IκB的表达；B图为目的蛋白与内参蛋白条带灰度值比值的统计分析图，细胞核蛋白以LaminB为内参，细胞质蛋白以β-actin为内参。横坐标为姜黄素浓度（μM），纵坐标为目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值。由图6可知，随着姜黄素浓度的增加，细胞核中p65的表达水平显著降低，表明NF-κB的核转位受到抑制，活性降低。同时，细胞质中IκB的降解减少，说明姜黄素抑制了IKK对IκB的磷酸化和降解过程。相关炎症因子IL-6、IL-8和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、XIAP的表达水平也明显下降。与对照组相比，各姜黄素处理组的细胞核p65、细胞质IκB、IL-6、IL-8、Bcl-2、Bcl-xL、XIAP表达水平差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明姜黄素能够抑制NF-κB信号通路的激活，通过抑制IKK的活性，减少IκB的降解，阻止NF-κB的核转位，从而下调相关炎症因子和抗凋亡蛋白的表达。姜黄素对NF-κB信号通路的调控与肿瘤抑制密切相关。抑制NF-κB的活性，减少了抗凋亡蛋白的表达，使癌细胞对凋亡的敏感性增加，促进了细胞凋亡的发生，从而抑制了肿瘤细胞的存活。下调炎症因子IL-6、IL-8的表达，有助于改善肿瘤微环境，减少炎症对肿瘤生长和转移的促进作用。抑制肿瘤血管生成相关因子的表达，降低了肿瘤血管生成的能力，限制了肿瘤细胞的营养供应和转移途径，进一步抑制了肿瘤的生长和扩散。本研究结果与其他关于姜黄素对肿瘤细胞NF-κB信号通路影响的研究报道一致，进一步证实了姜黄素通过抑制NF-κB信号通路来抑制肾癌细胞生长和转移的作用机制。4.2调节基因和蛋白表达4.2.1下调EGFR和VEGF表达表皮生长因子受体（EGFR）和血管内皮生长因子（VEGF）在肾癌的发生、发展过程中扮演着关键角色。EGFR是一种跨膜受体酪氨酸激酶，在多种肿瘤细胞中高表达，包括人肾癌细胞786-O。当EGFR与其配体如表皮生长因子（EGF）结合后，受体的酪氨酸激酶结构域被激活，使受体自身的酪氨酸残基磷酸化。这一磷酸化过程引发了一系列下游信号通路的级联激活，如Ras/Raf/MEK/ERK通路、PI3K/Akt通路等。这些信号通路的激活促进了肿瘤细胞的增殖、存活、迁移和侵袭，同时还能抑制细胞凋亡。在786-O细胞中，EGFR的高表达为癌细胞提供了持续的生长和存活信号，使得癌细胞能够无节制地增殖，并获得更强的迁移和侵袭能力。VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，在肿瘤血管生成过程中发挥着核心作用。肿瘤细胞分泌的VEGF可以与血管内皮细胞表面的VEGF受体（VEGFR）结合，激活受体的酪氨酸激酶活性，进而激活下游的信号通路，如PI3K/Akt、Ras/Raf/MEK/ERK等。这些信号通路的激活促进了血管内皮细胞的增殖、迁移和存活，诱导新生血管的形成。在肾癌中，丰富的肿瘤血管为癌细胞提供了充足的营养和氧气供应，同时也为癌细胞进入血液循环并发生远处转移创造了条件。研究表明，VEGF的高表达与肾癌的分期、分级以及预后密切相关，高表达VEGF的肾癌患者往往预后较差。为了探究姜黄素对EGFR和VEGF表达的影响，本研究采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法（WB）检测了不同浓度姜黄素处理786-O细胞48小时后，EGFR和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达变化。实验结果如图7所示：图片7不同浓度姜黄素作用48小时对786-O细胞EGFR和VEGF表达的影响描述A图为实时荧光定量PCR检测EGFR和VEGFmRNA表达水平的柱状图；B图为蛋白免疫印迹法检测EGFR和VEGF蛋白表达的蛋白条带图；C图为目的蛋白与内参蛋白β-actin条带灰度值比值的统计分析图。横坐标为姜黄素浓度（μM），纵坐标为mRNA相对表达量或目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值。由图7可知，随着姜黄素浓度的增加，EGFR和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达均显著降低。与对照组相比，各姜黄素处理组的EGFR和VEGF表达水平差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明姜黄素能够下调EGFR和VEGF的表达，从而抑制肾癌的生长和侵袭。姜黄素下调EGFR表达，阻断了EGFR相关信号通路的激活，减少了肿瘤细胞的增殖、存活和迁移信号，使癌细胞的生长和侵袭能力受到抑制。姜黄素降低VEGF的表达，减少了肿瘤血管生成，切断了肿瘤细胞的营养供应和转移途径，进一步抑制了肿瘤的生长和扩散。本研究结果与其他关于姜黄素对肿瘤细胞EGFR和VEGF表达影响的研究报道一致，进一步证实了姜黄素通过下调EGFR和VEGF表达来抑制肾癌细胞生长和侵袭的作用机制。4.2.2抑制GSK-3β活性糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞的多种生物学过程中发挥着重要作用，包括细胞增殖、分化、凋亡以及代谢调节等。在正常生理状态下，GSK-3β处于活跃状态，能够磷酸化多种底物，如糖原合成酶、β-catenin等。在肿瘤细胞中，GSK-3β的活性和功能常常发生改变，与肿瘤的发生、发展密切相关。在人肾癌细胞786-O中，GSK-3β的异常激活为癌细胞提供了生长优势，促进了癌细胞的增殖和存活。在Wnt信号通路中，GSK-3β起着关键的负调控作用。当Wnt信号通路未被激活时，GSK-3β与APC、Axin等蛋白形成复合物，使β-catenin的N端丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化。磷酸化的β-catenin被泛素化修饰，进而被蛋白酶体降解，维持细胞内β-catenin的低水平。当Wnt信号通路被激活时，Wnt配体与细胞表面的受体结合，激活下游的Dishevelled蛋白，抑制GSK-3β的活性。GSK-3β活性被抑制后，β-catenin无法被磷酸化和降解，在细胞质中积累并进入细胞核。在细胞核内，β-catenin与转录因子TCF/LEF结合，启动与细胞增殖、存活相关基因的转录，如CyclinD1、c-Myc等。在786-O细胞中，异常激活的GSK-3β可能通过Wnt信号通路，促进β-catenin的积累和相关基因的表达，从而促进癌细胞的增殖和存活。为了探讨姜黄素对GSK-3β活性的影响及其对β-catenin和CyclinD1表达的作用，本研究采用蛋白免疫印迹法（WB）检测了不同浓度姜黄素处理786-O细胞48小时后，GSK-3β的磷酸化水平（p-GSK-3β，其磷酸化水平升高表示活性降低）、β-catenin和CyclinD1的表达变化。实验结果如图8所示：图片8不同浓度姜黄素作用48小时对786-O细胞GSK-3β、β-catenin和CyclinD1表达的影响描述A图为蛋白免疫印迹法检测结果的蛋白条带图；B图为目的蛋白与内参蛋白β-actin条带灰度值比值的统计分析图。横坐标为姜黄素浓度（μM），纵坐标为目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值。由图8可知，随着姜黄素浓度的增加，p-GSK-3β的表达水平显著升高，表明GSK-3β的活性受到抑制。同时，β-catenin和CyclinD1的表达水平明显下降。与对照组相比，各姜黄素处理组的p-GSK-3β、β-catenin和CyclinD1表达水平差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明姜黄素能够抑制GSK-3β的活性，使β-catenin的磷酸化和降解恢复正常，减少β-catenin在细胞核内的积累，进而下调CyclinD1等与细胞增殖相关基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖。本研究结果与其他关于姜黄素对肿瘤细胞GSK-3β活性及相关蛋白表达影响的研究报道一致，进一步证实了姜黄素通过抑制GSK-3β活性来抑制肾癌细胞增殖的作用机制。4.2.3对凋亡相关蛋白的影响细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，对于维持细胞内环境稳定、组织发育和机体稳态具有重要意义。在细胞凋亡过程中，一系列凋亡相关蛋白发挥着关键作用，其中Caspase家族蛋白和Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡调控的核心成员。Caspase家族蛋白是一类半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，在细胞凋亡的启动和执行过程中起着关键作用。根据功能不同，Caspase家族蛋白可分为启动型Caspase（如Caspase-8、Caspase-9等）和执行型Caspase（如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等）。启动型Caspase在凋亡信号的刺激下被激活，通过自身剪切形成有活性的异二聚体，进而激活下游的执行型Caspase。执行型Caspase被激活后，能够切割细胞内的多种重要底物，如细胞骨架蛋白、DNA修复酶等，导致细胞形态和结构的改变，最终引发细胞凋亡。在人肾癌细胞786-O中，Caspase家族蛋白的活性和表达水平与细胞凋亡密切相关。当细胞受到凋亡诱导因素的作用时，Caspase家族蛋白被激活，启动细胞凋亡程序，抑制癌细胞的生长和存活。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等），它们通过调节线粒体膜的通透性来调控细胞凋亡。抗凋亡蛋白能够维持线粒体膜的稳定性，阻止细胞色素c等凋亡因子从线粒体释放到细胞质中。而促凋亡蛋白则可以促进线粒体膜的通透性增加，导致细胞色素c释放。细胞色素c释放到细胞质后，与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP等结合形成凋亡小体，激活Caspase-9，进而激活下游的执行型Caspase，引发细胞凋亡。在786-O细胞中，Bcl-2家族蛋白的表达失衡，抗凋亡蛋白的高表达和促凋亡蛋白的低表达，使得癌细胞对凋亡的敏感性降低，有利于癌细胞的存活和增殖。为了研究姜黄素对凋亡相关蛋白表达的影响，本研究采用蛋白免疫印迹法（WB）检测了不同浓度姜黄素处理786-O细胞48小时后，Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2等凋亡相关蛋白的表达变化。实验结果如图9所示：图片9不同浓度姜黄素作用48小时对786-O细胞凋亡相关蛋白表达的影响描述A图为蛋白免疫印迹法检测结果的蛋白条带图；B图为目的蛋白与内参蛋白β-actin条带灰度值比值的统计分析图。横坐标为姜黄素浓度（μM），纵坐标为目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值。由图9可知，随着姜黄素浓度的增加，Caspase-3、Caspase-9的活性形式（裂解后的片段）表达水平显著升高，Bax的表达水平明显上升，而Bcl-2的表达水平则显著降低。与对照组相比，各姜黄素处理组的Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2表达水平差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明姜黄素能够通过上调Caspase-3、Caspase-9的活性，促进细胞凋亡的执行；上调Bax的表达，下调Bcl-2的表达，改变Bcl-2家族蛋白的表达平衡，增加线粒体膜的通透性，促使细胞色素c释放，从而激活Caspase级联反应，诱导786-O细胞凋亡。本研究结果与其他关于姜黄素对肿瘤细胞凋亡相关蛋白表达影响的研究报道一致，进一步证实了姜黄素通过调节凋亡相关蛋白表达来诱导肾癌细胞凋亡的作用机制。4.3抑制细胞迁移和侵袭4.3.1对MMP-9表达的调节肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤转移的关键步骤，而基质金属蛋白酶（MMPs）在这一过程中发挥着重要作用。MMP-9，又称明胶酶B，是MMPs家族中的重要成员之一。它能够特异性地降解细胞外基质中的Ⅳ型胶原、明胶等成分，而Ⅳ型胶原是构成基底膜的主要成分，基底膜是阻止肿瘤细胞侵袭和转移的重要屏障。当MMP-9的表达和活性升高时，它可以降解基底膜和细胞外基质，为肿瘤细胞的迁移和侵袭开辟通道，使得肿瘤细胞能够突破基底膜的限制，侵入周围组织，并进一步进入血液循环或淋巴循环，从而发生远处转移。在人肾癌细胞786-O中，MMP-9的高表达与癌细胞的高迁移和侵袭能力密切相关，促进了肾癌的恶性进展。为了探究姜黄素对MMP-9表达的影响，本研究采用蛋白免疫印迹法（WB）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了不同浓度姜黄素处理786-O细胞48小时后，MMP-9在蛋白和mRNA水平的表达变化。实验结果如图10所示：图片10不同浓度姜黄素作用48小时对786-O细胞MMP-9表达的影响描述A图为蛋白免疫印迹法检测MMP-9蛋白表达的蛋白条带图；B图为目的蛋白与内参蛋白β-actin条带灰度值比值的统计分析图；C图为实时荧光定量PCR检测MMP-9mRNA表达水平的柱状图。横坐标为姜黄素浓度（μM），纵坐标为目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值或mRNA相对表达量。由图10可知，随着姜黄素浓度的增加，MMP-9在蛋白和mRNA水平的表达均显著降低。与对照组相比，各姜黄素处理组的MMP-9表达水平差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明姜黄素能够下调MMP-9的表达，从而抑制786-O细胞对细胞外基质的降解能力，减少细胞迁移和侵袭的机会，降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。姜黄素可能通过调节相关信号通路，如NF-κB、MAPK等信号通路，来抑制MMP-9基因的转录和翻译过程，从而降低MMP-9的表达水平。已有研究表明，NF-κB信号通路的激活可以上调MMP-9的表达，而姜黄素能够抑制NF-κB的活性，从而间接抑制MMP-9的表达。本研究结果与其他关于姜黄素对肿瘤细胞MMP-9表达影响的研究报道一致，进一步证实了姜黄素通过抑制MMP-9表达来抑制肾癌细胞迁移和侵袭的作用机制。4.3.2对TIMP-1和TIMP-2表达的影响组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）是一类内源性的MMPs抑制剂，在维持细胞外基质的稳态和调节肿瘤细胞的迁移、侵袭过程中发挥着重要作用。TIMP-1和TIMP-2是TIMPs家族中的重要成员，它们能够与MMPs特异性结合，形成稳定的复合物，从而抑制MMPs的活性。TIMP-1主要与MMP-9结合，TIMP-2则与MMP-2等多种MMPs结合。在正常生理状态下，TIMP-1和TIMP-2的表达与MMPs的表达保持平衡，维持着细胞外基质的正常结构和功能。在肿瘤细胞中，这种平衡常常被打破，MMPs的表达升高，而TIMP-1和TIMP-2的表达相对降低，导致细胞外基质降解增加，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力增强。在人肾癌细胞786-O中，TIMP-1和TIMP-2的低表达使得MMP-9等MMPs的活性得不到有效抑制，促进了癌细胞的迁移和侵袭。为了探讨姜黄素对TIMP-1和TIMP-2表达的影响，本研究采用蛋白免疫印迹法（WB）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了不同浓度姜黄素处理786-O细胞48小时后，TIMP-1和TIMP-2在蛋白和mRNA水平的表达变化。实验结果如图11所示：图片11不同浓度姜黄素作用48小时对786-O细胞TIMP-1和TIMP-2表达的影响描述A图为蛋白免疫印迹法检测TIMP-1和TIMP-2蛋白表达的蛋白条带图；B图为目的蛋白与内参蛋白β-actin条带灰度值比值的统计分析图；C图为实时荧光定量PCR检测TIMP-1和TIMP-2mRNA表达水平的柱状图。横坐标为姜黄素浓度（μM），纵坐标为目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值或mRNA相对表达量。由图11可知，随着姜黄素浓度的增加，TIMP-1和TIMP-2在蛋白和mRNA水平的表达均显著升高。与对照组相比，各姜黄素处理组的TIMP-1和TIMP-2表达水平差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明姜黄素能够上调TIMP-1和TIMP-2的表达，增加它们与MMP-9等MMPs的结合，从而抑制MMPs的活性，减少细胞外基质的降解，抑制786-O细胞的迁移和侵袭。姜黄素可能通过调节相关信号通路，如PI3K/Akt、STAT3等信号通路，来促进TIMP-1和TIMP-2基因的转录和翻译过程，从而提高TIMP-1和TIMP-2的表达水平。已有研究表明，PI3K/Akt信号通路的激活可以抑制TIMP-1和TIMP-2的表达，而姜黄素能够抑制PI3K/Akt信号通路，从而间接上调TIMP-1和TIMP-2的表达。本研究结果与其他关于姜黄素对肿瘤细胞TIMP-1和TIMP-2表达影响的研究报道一致，进一步证实了姜黄素通过调节TIMP-1和TIMP-2表达来抑制肾癌细胞迁移和侵袭的作用机制。五、讨论5.1姜黄素抗肾癌作用的有效性本研究通过一系列实验，深入探讨了姜黄素对人肾癌细胞786-O的体外作用，结果充分证实了姜黄素在抗肾癌方面具有显著的有效性。在细胞生长抑制方面，MTT实验结果清晰地表明，姜黄素对786-O细胞的生长具有强烈的抑制作用，且这种抑制作用呈现出明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。随着姜黄素浓度的不断增加以及作用时间的逐渐延长，786-O细胞的生长抑制率持续上升。在24小时时，低浓度的5μM姜黄素处理组细胞生长抑制率为（10.23±2.15）%，而高浓度的80μM姜黄素处理组细胞生长抑制率则达到了（45.67±3.24）%；到48小时时，5μM姜黄素处理组细胞生长抑制率上升至（18.56±2.56）%，80μM姜黄素处理组更是高达（68.90±4.12）%；72小时时，各浓度姜黄素处理组的细胞生长抑制率进一步显著升高，5μM姜黄素处理组为（25.45±3.01）%，80μM姜黄素处理组达到了（85.32±5.03）%。计算得出姜黄素作用24小时、48小时、72小时的半数抑制浓度（IC50）分别为38.7μmol/L、29.2μmol/L、21.8μmol/L。这一结果与张培波等人在《姜黄素通过上调miR-637抑制肾癌786-O细胞的增殖、迁移和侵袭》中的研究结果一致，该研究也表明姜黄素能够显著抑制肾癌786-O细胞的增殖，且抑制效果与浓度和时间相关。这充分说明姜黄素可以有效阻碍786-O细胞的生长，为其在肾癌治疗中的应用提供了有力的证据。在细胞周期调控方面，流式细胞仪检测结果显示，姜黄素能够将786-O细胞周期阻滞于G2/M期。随着姜黄素浓度的增加，G2/M期细胞比例显著升高，而G1期和S期细胞比例则逐渐降低。当姜黄素浓度为80μM时，G2/M期细胞比例从对照组的（19.12±1.56）%大幅增加到（65.43±2.89）%。细胞周期的正常进行对于细胞的增殖至关重要，而G2/M期是细胞分裂的关键时期，姜黄素将细胞周期阻滞于此期，使得细胞无法顺利进入分裂期，从而从根本上抑制了细胞的增殖。这一作用机制与已有研究中姜黄素对其他肿瘤细胞周期的影响相似，进一步证实了姜黄素通过调控细胞周期来抑制肾癌细胞增殖的有效性。在诱导细胞凋亡方面，AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞仪检测以及细胞形态学观察的结果均表明，姜黄素能够诱导786-O细胞发生凋亡，且诱导凋亡作用呈剂量依赖性。随着姜黄素浓度的增加，凋亡细胞（早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞）的比例显著升高。当姜黄素浓度为80μM时，凋亡细胞比例从对照组的（10.44±2.04）%急剧增加到（76.88±3.93）%。细胞形态学观察发现，对照组细胞形态饱满，贴壁生长良好，而经姜黄素处理后的细胞，随着浓度增加和时间延长，逐渐变圆、悬浮，细胞碎片增多，这些形态学变化与流式细胞仪检测的凋亡结果相互印证。诱导细胞凋亡是肿瘤治疗的重要策略之一，姜黄素能够有效地诱导786-O细胞凋亡，说明其在抑制肾癌细胞生长方面具有重要的作用。在抑制细胞迁移和侵袭方面，姜黄素通过调节MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表达，显著降低了786-O细胞的迁移和侵袭能力。MMP-9能够降解细胞外基质，为肿瘤细胞的迁移和侵袭创造条件，而姜黄素能够下调MMP-9的表达，从而抑制细胞对细胞外基质的降解。TIMP-1和TIMP-2是MMPs的抑制剂，姜黄素上调TIMP-1和TIMP-2的表达，增加了它们与MMP-9等MMPs的结合，进一步抑制了MMPs的活性，减少了细胞外基质的降解，从而有效地抑制了786-O细胞的迁移和侵袭。这一结果与其他关于姜黄素对肿瘤细胞迁移和侵袭影响的研究报道一致，表明姜黄素在抑制肾癌细胞转移方面具有潜在的应用价值。综上所述，姜黄素对人肾癌细胞786-O的生长、周期、凋亡、迁移和侵袭等多个方面都具有显著的抑制作用，充分证明了其抗肾癌作用的有效性，为肾癌的治疗提供了新的潜在策略和药物选择。5.2作用机制的复杂性与多效性姜黄素对人肾癌细胞786-O的作用机制呈现出显著的复杂性与多效性，它并非通过单一途径发挥抗肾癌作用，而是通过多信号通路、多基因和蛋白调节，从多个层面协同作用，共同抑制肿瘤细胞的生长、增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，展现出全面而复杂的抗癌效应。在信号通路调节方面，姜黄素能够同时作用于多个关键信号通路，如PI3K/Akt、STAT3和NF-κB等。PI3K/Akt信号通路在细胞的生长、存活和代谢中起着核心作用，姜黄素通过抑制PI3K的活性，减少PIP3的生成，进而抑制Akt的磷酸化，阻断该信号通路的传导，从而抑制肿瘤细胞的增殖和存活。在STAT3信号通路中，姜黄素抑制STAT3的磷酸化，阻止其形成二聚体并转移至细胞核内，从而下调其下游抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL和细胞周期蛋白CyclinD1的表达，促进细胞凋亡并抑制细胞增殖。对于NF-κB信号通路，姜黄素抑制IKK的活性，减少IκB的降解，阻止NF-κB的核转位，下调相关炎症因子IL-6、IL-8和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、XIAP的表达，抑制肿瘤细胞的存活、增殖以及肿瘤血管生成和侵袭转移。这些信号通路之间并非孤立存在，而是相互交织、相互影响，形成复杂的网络。PI3K/Akt信号通路的激活可能会影响STAT3和NF-κB信号通路的活性，而姜黄素对这些信号通路的同时调节，能够更有效地阻断肿瘤细胞的生长和扩散信号，发挥更强的抗癌作用。在基因和蛋白表达调节方面，姜黄素的作用同样广泛而复杂。它能够下调EGFR和VEGF的表达，EGFR的下调阻断了其相关信号通路的激活，抑制了肿瘤细胞的增殖、存活和迁移；VEGF的下调则减少了肿瘤血管生成，切断了肿瘤细胞的营养供应和转移途径。姜黄素抑制GSK-3β的活性，使β-catenin的磷酸化和降解恢复正常，减少β-catenin在细胞核内的积累，进而下调CyclinD1等与细胞增殖相关基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖。在凋亡相关蛋白的调节上，姜黄素上调Caspase-3、Caspase-9的活性，上调Bax的表达，下调Bcl-2的表达，通过改变Bcl-2家族蛋白的表达平衡，增加线粒体膜的通透性，促使细胞色素c释放，激活Caspase级联反应，诱导细胞凋亡。这些基因和蛋白之间相互关联，共同构成了一个复杂的调控网络。EGFR的表达变化可能会影响下游相关蛋白的表达，进而影响细胞的增殖和凋亡；而凋亡相关蛋白的调节又与细胞的存活和死亡密切相关。姜黄素对这些基因和蛋白表达的综合调节，使得其能够从多个角度影响肿瘤细胞的生物学行为，发挥多效性的抗癌作用。在抑制细胞迁移和侵袭方面，姜黄素通过调节MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表达来实现。MMP-9能够降解细胞外基质，为肿瘤细胞的迁移和侵袭创造条件，姜黄素下调MMP-9的表达，抑制了细胞对细胞外基质的降解能力。TIMP-1和TIMP-2是MMPs的抑制剂，姜黄素上调它们的表达，增加了它们与MMP-9等MMPs的结合，进一步抑制了MMPs的活性，减少了细胞外基质的降解，从而有效地抑制了肿瘤细胞的迁移和侵袭。这一过程中，MMP-9、TIMP-1和TIMP-2之间存在着动态的平衡关系，姜黄素对它们表达的调节打破了肿瘤细胞中这种失衡的状态，恢复了细胞外基质的正常代谢和结构，从而抑制了肿瘤细胞的迁移和侵袭。而细胞迁移和侵袭能力的抑制又与肿瘤的转移密切相关，姜黄素通过这一机制，对肿瘤的恶性进展起到了重要的抑制作用。姜黄素对人肾癌细胞786-O的作用机制涉及多个信号通路、众多基因和蛋白的调节，这些调节作用相互关联、相互影响，形成了一个复杂而精细的网络。这种复杂性与多效性使得姜黄素能够全面地抑制肿瘤细胞的