巴氏染色原理

巴氏染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。苏木素染液，细胞核内的染色质

主要是去氧核糖核酸（DNA）,DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带

负电荷，呈酸性，很简单与带正电荷的苏木素精碱性染料以离子或氢键结合而被

染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。分化：苏木素染

色之后，用水洗去未结合在细胞上的染液，但是在细胞核中结合过多的染料和细

胞浆中吸附的染料必需用分化液现盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞奘染

色的分明，把这个过程称为染色的分化作用。因酸能破坏苏木素的酿型结构，使

色素与组织解离，分化不行过度。蓝化：分化之后苏木素在酸性条件下处于红色

离子状态，在碱性条件下处于蓝色离子状态，而呈蓝色，所以分化之后用水洗去

酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈蓝色，称蓝化作用，一

般多用自来水浸洗即可变蓝，也可用温水（50度温水最佳）变蓝。EA50染液的

酸碱度对于巴氏染色的胜利起着关键作用，EA50染液由伊纤、亮绿、等染料配

成。伊红、亮绿、橘黄等属于酸性染料，在溶解媒中其发色团是负离子部分，发

色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而是胞浆显蓝色、绿色、橘黄色或纥色,

但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的PH值而变更的，在偏碱环境中，蛋白

质的竣基游离增多（带负电），在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电），

磷锯酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力，同时磷钙酸与碳酸

锂还是一对弱酸弱碱，事熨上是一对缓冲剂，可中和分化与蓝化时可能留下狗少

量酸或碱，保证染色达到志向效果，其适用于上皮细胞与间皮组织的标本，是阴

道脱落细胞检查中最常用的染色方法，该染色法不但具有显示细胞核结构清楚、

分色明显、透亮度好、胞浆受色艳丽等特点。

巴氏染色法将胞核染为深蓝色；鳞状上皮底层、中层与表层角化前

细胞胞质染绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色，完全角化细胞胞质呈

桔黄色；细菌：灰色；滴虫：淡蓝灰色；黏液：淡蓝色或粉红色；中性粒

细胞和淋巴细胞、吞噬细胞胞质均为蓝色；红细胞染粉红色；高分化鳞癌

细胞可染成粉红色或桔黄色；腺癌胞质呈灰蓝色。

巴氏染色的操作方法与留意事项

染色有4个步骤：1、固定；2、核染色；3、胞浆染色；4、透亮。

主要达到以下要求：1、核的结构清楚；2、透亮度高；3、分色

恰当。

一、固定

固定的目的细胞制片的快速固定是制片过程中关键的一步，否则

会影响细胞学诊断的精确性。对于不同的标本须要不同的固定方法。

最为常用的固定方法是95%酒精作为固定液的湿固定法。酒精作为一

种脱水剂能够防止细胞内的酶捋蛋白质分解而自容，并凝固细胞内的

物质如蛋白质、脂肪和糖类等，使其保持与组织生活相仿的成分，从

而使细胞各部分，尤其核染色质易于着色。对于巴氏染色来说，酒精

固定最为重要的。假如酒精浓度不足引起的固定不佳，可造成细胞的

人为变更，并可导致假阳性或假阴性的诊断。

1、固定方法湿固定法：作为用95%酒精固定液固定的细胞学标

本肯定运用湿固定法。制片制备完后，趁标本簇新而又潮湿时，马上

放入盛有95%酒精的固定缸内。制片在固定液内至少保持

15-30mino固定时间通常不超过1周。这种制片染色后，颜色艳丽,

结构清楚。假如细胞制片须要送至另一试验室或邮寄他处染色时，可

以固定15min后，把制片取出后马上密封的容器中或者运用甘油防

止制片干燥。因为无论固定前或固定后的制片，假如发生干燥后都会

影响染色的效果。

2、固定留意事项固定液的过滤：为了防止细胞污染，凡是运用

过的固定液，必需过滤后才能再运用。运用过长的固定液，必需用酒

精相对密度计测定，酒精浓度低于9。%时应当与时更换新液。湿固定

的重要性：标本再簇新时与时固定时保证染色效果的重要因素。如苏

木素对细胞核的染色，巴氏染色中胞浆的特别着色作用，均可因标本

干燥后固定而大受影响。制片标本的邮寄：标本再固定15min后取

出，马上加甘油数滴于制片上，装入密封的小盒中。试验室在收到标

本后，先浸入95%酒精中，使甘油溶去，再进行染色。

二、核染色

1、苏木素液浸染时间一般在3・5min,但是必需随气温柔燃料

状况而酌情变更。夏季或放置较久的苏木素染液简单着色，时间要缩

短；冬季或新配制的苏木素染液和应用已久较稀释的苏木素液不易着

色，时间要延长。在运用苏木素染色时，一般有2种方法：

1）过染法：首先有意识地进行深染，然后通过盐酸酸化过程使

核染色趋于合适。这种方法能够在酸化过程中把胞浆内黏附多余的苏

木素染料去掉，使胞浆染色更为艳丽、清楚、多用于黏液多的标本。

2）淡染法：在核染色过程中，严格驾驭染色时间，使核染色相

宜而不用盐酸酸化，但是胞浆中少量的苏木素会影响EA染色的质量。

主要用于黏液少的标本，避开在酸化和自来水冲洗的过程中使细胞成

片地脱落。在运用苏木素染色时，肯定要每日进行过滤，否则苏木素

结晶会影响染色的质量。一般苏木素染液可以运用较长时间，所以每

日增加少量簇新染液即可。

2、碱化碱化亦称返蓝过程，可以运用饱和碳酸锂或3%氨水碱化,

目的使苏木素与早显色，时间约数秒。更重要的是流水冲洗，可使蓝

色显的更艳丽。碱性溶液亦须要充分漂清才不会阻碍下一步的胞浆着

色与标本制成后的颜色保存。分化和碱化溶液至少每天更换新液。

三、胞浆染色

胞浆染色在巴氏方法中亦称为OG—EA染色，它包括橘黄G

(OG)和EA两部分染色。由于橘黄G是一种小分子染料，能够很

快地作用于胞浆，一般染色时间不宜过长，通常对于宫颈、

阴道上皮中非正常角化细胞和角化型鳞癌细胞的胞浆中都可以出现艳

丽的橘黄色。

四、封固制片

封固制片对于避开空气干燥的影响，制片经长期存放不褪色是特

别重耍的。一般运用24mmX50mm或24mmX60mm的盖玻片,

用二甲苯调配的中性树胶进行封固。

五、透亮

染色的最终一步是透亮，使细胞的色度与细胞的重叠不致影响镜

下检查。这是在脱水与制片封固之间的一项重要步骤。最常用的透亮

溶剂使二甲苯，二甲苯的折射率在1.494,载玻片的折射率在1.515,

两者较为匹配。假如二甲苯溶液出现颜色或变得浑浊，肯定要更换新

液。巴氏染色操作流程95%乙醇固定(15min)f清水冲洗多次一

苏木素染液(3-5min)一清水冲洗三次->蓝化->95%乙醇漂洗一橙

黄染液(l・10s)-95%乙醉漂洗->95%乙醉漂洗100%乙醉漂洗

-EA50(3-5m)-95%乙醉漂洗f95%乙醉漂洗->无水乙醉漂洗

f无水乙醇(2min)一二甲苯(2min)-►中性树胶封片

染色留意事项

1、细胞核着色不佳

(1)细胞核着色过浅：

1)盐酸分化时间过长或苏木素染液时间过长。须要缩短分化时

间或延长碱化时间；每日加入少量簇新苏木素染液或重新配制苏木素

液。

2)在固定之前制片干燥。所以对巴氏染色的制片须要严格遵守

湿固定的原则。

3)自来水的PH值偏酸性。运用碱性溶液。

(2)细胞核着色过深：

1)盐酸溶液浓度不够。适当加入几滴盐酸以增加浓度。

2)制片用高于95%以上浓度的酒精固定后可以出现染色过深。

应用95%酒精固定。

2、细胞浆着色不佳

(1)假如全片内胞浆都淡染，则须要延长染色时间或更换新液。

(2)假如胞浆不分色，均为浅红色。制片在固定前干燥或制片

被有大量球菌样细菌影响胞浆染色。此状况可以适当增加染色时间能

够部分订正不分色状况。

(3)胞浆染成灰色或紫色，是由于苏木素染色时间过长或盐酸

分化不佳。经过褪色后重新苏木素可以订正。

(4)由于标本的不同，同样配方的EA染液可造成偏蓝、偏绿和

偏红，对不同的标本应当运用不同的EA染液。一般认为，EA36和

EA50用于妇科标本，而E