土壤生物采集实验手册

土壤生物采集实验手册土壤生物是陆地生态系统的重要组成部分，涵盖微生物、线虫、节肢动物、环节动物等多个类群，其群落结构与功能直接反映土壤健康状况。为规范土壤生物采集流程，确保样本代表性与数据准确性，本手册基于野外调查与实验室操作经验，系统阐述从前期准备到样本处理的全流程操作要点。一、实验前准备（一）工具与试剂配备1.基础采集工具：需根据目标生物类群选择适配工具。微生物采集需无菌不锈钢土钻（直径5cm，长度30cm）、无菌铝盒（50mL）、一次性无菌手套（无粉丁腈材质）；线虫采集常用小型取土铲（宽10cm，厚2mm）、塑料自封袋（25×35cm，厚0.08mm）；中小型节肢动物（如螨类、跳虫）需Tullgren干漏斗装置（包括40目筛网、25W白炽灯、500mL玻璃收集瓶）；大型土壤动物（如蚯蚓、马陆）需尖头铁锹（刃宽20cm）、软毛刷（毛长1.5cm）、塑料托盘（50×30cm）。所有金属工具使用前需用75%乙醇擦拭3遍，微生物采样工具需额外经121℃高压蒸汽灭菌20分钟。2.保存与固定试剂：微生物样本需临时保存于4℃冰盒（内置蓝冰，容量2L）；线虫固定液为4%福尔马林溶液（甲醛:水=1:24），或用70%乙醇（含5%甘油防干缩）；中小型节肢动物保存液为75%乙醇（含2%甘油），大型动物可用5%福尔马林溶液（需提前用碳酸氢钠中和至pH7.0）。所有试剂需提前分装于50mL离心管（微生物）、250mL广口瓶（线虫）、500mL细口瓶（节肢动物），标注名称与配制日期。3.辅助工具：包括GPS定位仪（精度±1m）、土壤湿度计（测量范围0-100%）、pH试纸（范围4.0-9.0）、卷尺（5m）、记录板（防水材质）、油性记号笔（耐酒精）、标签纸（防水防油）。（二）采样点规划采样点选择需兼顾代表性与均匀性。若为区域生态调查，应覆盖不同植被类型（如森林、草地、农田）、土壤类型（如红壤、黑土、褐土）及地形（平地、坡地、洼地）；若为污染监测，需在污染区（核心区、过渡区）与对照区（距离污染源500m外）设置样点。每个样地至少设置5个重复样点，样点间距≥10m（避免重叠干扰）。采样前需用GPS记录样点经纬度（精确至秒），测量海拔（±5m）、坡度（量角器测量）、坡向（罗盘确定），记录优势植物种类（如草本为狗尾草、灌木为荆条）及覆盖度（目测法分5级：0-20%、20-40%…80-100%）。二、现场采集操作（一）微生物采集1.分层采样：微生物主要分布于0-20cm土层，需按0-10cm（表层）、10-20cm（亚表层）分层采集。清除地表凋落物（厚度＞2cm时用毛刷轻扫），用无菌土钻垂直插入土壤至目标深度，旋转取出土芯（避免挤压），剔除石块、根系等杂物，迅速装入无菌铝盒（装至8分满，预留膨胀空间）。每个样点采集3个土芯（间距50cm），混合后取20g作为该层样本，重复3次。2.避免交叉污染：每采集完一个样点，土钻需用75%乙醇擦拭，待酒精挥发后再用于下一样点。铝盒密封前需用记号笔标注样点编号（如S1-0-10，S代表土壤，1为样点号，0-10为深度）、时间（精确至分钟）、采集人。样本需立即放入冰盒（温度保持4±1℃），24小时内送实验室处理。（二）线虫采集1.土样获取：线虫多分布于0-30cm土层，以10-20cm最密集。用取土铲挖取20×20×30cm的土坑，从坑壁分层（0-10cm、10-20cm、20-30cm）取土，每层取500g（约一捧），装入自封袋（排出空气后密封）。注意避免土壤过干（湿度＜10%时线虫活性低）或过湿（＞60%时易黏连），若遇雨天需等待地表干燥24小时后再采样。2.临时保存：自封袋外标注样点编号（如N1-10-20，N代表线虫）、深度、时间，置于阴凉处（温度≤25℃），4小时内送至实验室。若需长途运输，可加入湿润滤纸（保持湿度80%），避免阳光直射。（三）中小型节肢动物采集（螨类、跳虫）1.Tullgren干漏斗法：适用于干燥或半干燥土壤。采集时取500g原状土（保留土壤结构），剔除直径＞2cm的石块，放入漏斗筛网（筛孔2mm），漏斗下接收集瓶（内装75%乙醇）。开启白炽灯（距土样20cm），调节温度至35±2℃（用温度计监测），持续48小时。节肢动物因趋湿避光向下移动，落入收集瓶保存。2.Baermann湿漏斗法：适用于湿润土壤（如沼泽、稻田）。将土样包裹于纱布（100目），放入漏斗（内装蒸馏水至浸没土样2/3），漏斗下接离心管（内装少量水）。静置24小时，线虫、缓步动物等因重力下沉至离心管，取出离心管后低速离心（1000r/min，5分钟），上清液弃去，沉淀用固定液保存。（四）大型土壤动物采集（蚯蚓、马陆）1.手捡法：在样点内挖取50×50×30cm的土坑，将土壤分层（0-10cm、10-20cm、20-30cm）倒在塑料托盘上，用软毛刷轻拨土壤，挑出可见动物（体长＞2mm）。注意动作轻柔，避免损伤蚯蚓体壁（易断裂）。2.甲醛诱导法：若手捡法遗漏率高（如蚯蚓钻入深层），可在样点表面均匀喷洒0.5%甲醛溶液（每平方米2L），5-10分钟后蚯蚓因刺激爬出地表，用镊子夹取（避免直接用手，防止黏液污染）。采集后立即用清水冲洗（30秒），去除体表甲醛。三、样本处理与保存1.微生物：实验室需在48小时内处理，称取1g土样加入9mL无菌水，震荡10分钟（200r/min），梯度稀释（10⁻¹至10⁻⁶）后涂布平板（牛肉膏蛋白胨培养基），30℃培养48小时，计数菌落形成单位（CFU）。2.线虫：将500g土样加入2000mL水，搅拌后静置30秒（粗颗粒下沉），将上层悬浮液过200目筛（孔径75μm），再用500目筛（孔径30μm）收集线虫。收集物经离心（2000r/min，10分钟）后，用4%福尔马林固定，保存于10mL离心管（标注编号、日期）。3.节肢动物：Tullgren漏斗收集液需在72小时内更换新鲜75%乙醇（避免挥发导致样本干燥），用体视显微镜（10-40倍）分类计数，记录类群（如甲螨、跳虫）及数量。4.大型动物：用5%福尔马林固定24小时后，转移至70%乙醇长期保存（福尔马林易使标本变硬）。蚯蚓需舒展身体（用玻棒轻拨），避免卷曲影响形态观察；马陆需保持附肢完整（用细镊子整理）。四、数据记录与注意事项（一）记录要求需建立标准化记录表，包含以下内容：-样点信息：编号、经纬度、海拔、地形（平地/坡地）、坡度（°）、坡向（东/南/西/北）；-环境参数：日期（年/月/日）、时间（时:分）、天气（晴/阴/雨）、气温（℃）、土壤湿度（%）、pH值；-植被信息：优势种（如杨树、小麦）、覆盖度（%）、凋落物厚度（cm）；-采集信息：深度（cm）、工具（土钻/铁锹）、样本量（g）、保存方法（冰盒/乙醇）；-生物记录：类群（细菌/线虫/跳虫）、数量（个/g或个/m²）、异常情况（如样本污染、动物死亡）。（二）关键注意事项1.生态保护：采集后需将土坑回填（分层归位），恢复地表植被（如覆盖原凋落物），避免破坏生境。每个样地采集面积不超过总面积的1%（如100m²样地采集＜1m²）。2.安全操作：接触福尔马林时需佩戴防毒面具（滤毒盒类型：有机气体），在通风橱内操作；使用酒精时远离火源（实验室需备灭火器）；野外采样需穿高帮防水