刘超-大肠杆菌及其染色体

大肠杆菌及其染色体刘超108080732009-05-20综述与要点大肠杆菌染色体是一种环状的DNA双链分子，在活细胞中，DNA体积进行1000倍压缩，只在其细胞体积中占15％。基因组（染色体）的管理是有规律性的，这有利于染色体维护和操作。新技术的发展，如基因位点的标记与分子水平的遗传位点同步跟踪，（也就是说，随时间的推移，这种分子机制能在活细胞内检测出）。这些研究通过基因定位，对染色体的复制进行可视化，揭示出一个高通量的动态的基因复制和大分子行为。用于染色体相关的显微镜成像方法免疫组织化学方法荧光分子机制荧光原位杂交（FISH）荧光阻遏子-启动子系统(

FROS）ParB–parS系统免疫化学这些方法需要固定的细胞因而样品破坏。此外，抗体相互作用可导致降低效率。

利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量。荧光蛋白在活细胞中，利用含有绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白，彻底让我们直观地观察和理解细胞组织的功能。利用不同的荧光蛋白质，就可以在同一时间追踪多种成分的活体细胞。荧光原位杂交（FISH）

荧光原位杂交（fluorescentinsitu

hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA。人类染色体的原位杂交DNA探针，通常为2-10kb的长度，探针带有标记作用的荧光基团。同时检测多个位点，不要求建造特殊菌株。固定过程和通透性可以干扰染色体原来的序列。阻遏子-启动子的荧光系统(FROS)FROS是第一个在活细胞中直观具体地观察染色体行为的方法。利用了不同的荧光蛋白基因变异型（GFP、YFP、RFP）具有不同的发射光谱，把他们融合到LacI和TetR等不同的抑制子中，在细胞中，这些融合蛋白表达，并与lacO和tetO等特异性位点结合从而插入并结合到染色体中。可以用荧光显微镜观察，使得染色体可视化。但是，这种方法要求利用转座子在染色体中建造一系列随机结合位点（lacO和tetO）需要防止这种抑制作用过度。FROS允许快速摄像和微速摄影，同时可以跟踪两个或三种颜色（激光共聚焦）。(Wang,X.etal.,2006,GenesDev)利用阻遏子-启动子的荧光系统(FROS)来观察大肠杆菌的染色体复制的情况。ParB–parS系统ParB–parS系统也是利用荧光融合蛋白（ParB）和特异性识别位点（parS）特异性结合的方法，在细胞中，使染色体轨迹可视化。EGFPYFPRFPParB环状DNA的拓扑学知识共价闭合的DNA，不足以形成稳定的负超螺旋结构，但是在不同条件下，它可以存在于两个可以互换的形式——绞状螺旋线的环形结构和超螺旋的环形结构。在体外，在生理缓冲液中，绞状螺旋线的螺旋结构通过右手旋线的环形结构构象。环状的DNA能通过某些蛋白，形成稳定的左手螺旋环超环面负超螺旋结构的，这种结构具有更高水平的折叠和压实。具体结构稍后再讲大肠杆菌的染色体复制概述L:把环状DNA“人为平铺打开”后从Ori的左边进行复制的复制轨迹；R:把环状DNA“人为平铺打开”后从Ori的右边进行复制的复制轨迹；ter：L和R复制叉最后“碰面”的在一定区域，复制终止区域。L/R的颜色的强弱表示时间梯度——颜色越强，越靠后，越下游。大肠杆菌的复制“对称”，ori，ter位于菌体“中间”，其他的菌种是不是也是这样的？？=柄杆菌属具有ori-proximalpoleter-proximalpole而大肠杆菌的ori和ter在菌体“中间”位置弧菌属有两个独立环形染色体，独立控制两个Ori复制过程和大肠杆菌基本相同。但是，染色体复制后，被整编和拉长，两个染色体的Ori被一些列的蛋白固定在细胞两极，如：DivIVA,RacA,soj和Spo0J。SpoIII把一个细胞极的挤进到前芽孢中。为不对称分裂。枯草芽孢杆菌其他菌种的复制简介E.coli复制体大肠杆菌DNA的复制需要有20种左右的酶和蛋白质因子参与。整个DNA复制机制被称之为DNAreplicasesystem或replisome（复制体）。E.Coli复制相关的酶Helicase（解旋酶），任何DNA在被复制前都必须解开双链，这个过程是由helicase来完成的，它可在ATP的作用下将DNA母链不断解开形成单链。Topoisomerase（拓扑异构酶），主要功能是消除DNA解链过程中所产生的扭曲力。DNA结合蛋白，使新解链的DNA保持稳定结构。Primases（引物酶），为DNA复制提供RNA引物。DNApolymerases，合成新生DNA链，切除RNA引物。DNALigases，使新生DNA链上的缺口（3'-OH,5'-p）生成磷酸二酯键。1.DNA复制的起始大约20个左右的DnaA蛋白首先与OriC中的4个9碱基重复区相结合；

识别并使3个13碱基串联重复区DNA形成开环结构；

DnaB蛋白在DnaC的帮助下与未解链序列结合。每六个DnaB蛋白形成一组并与一条DNA母链结合，可在不同方向同时起始DNA的复制。当细胞中存在足够的SSB和DNA解旋酶时，DnaB的解链效率非常高。大肠杆菌中的复制起始位点是oriC,全长245bp。该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。2.DNA子链的延伸主要包括两个不同但相互有联系的事件，即前导链和滞后链的合成。由DNAhelicase解开双螺旋，由拓朴异构酶消除DNA链上的扭曲力，SSB结合使DNA单链稳定。前导链的合成：由DnaG（primase，引物酶）在复制起始位点附近合成一个RNA引物，然后由polII把dNTP加到该引物上。滞后链的合成：产生Okazakifragments(冈崎片段)，消除RNA引物并由DNApolI补上这一小段DNA序列，由DNALigase把两个片段相连。L/R双向复制叉3.DNA链的终止当子链延伸达到terminusregion（ter，带有多个20bp序列）时，DNA复制就终止了。Ter有点像一个陷井（trap），使复制叉只能进入，不能出来。Ter的功能主要是由Ter-Tus复合物（terutilizationsubstance）来完成的。我们现在看看整个E.coli在细胞内的复制全过程。从oriC开始双向复制随着复制的进行，两个子oriC分开随着复制的继续进行，形成一种特殊的“图像”复制接近尾声，两个复制叉“碰面”，复制终止复制完成后，得到两个完全相同的大