槲皮素对H2O2作用PIEC细胞增殖的影响

槲皮素对H2O2作用PIEC细胞增殖的影响IDENTIFICATIONOFPIECANDEFFECTOFQUERCETINONPROLIFERATIONOFPIECINDUCEDBYH2O2目录摘要………………1关键词……………11前言……………21.1槲皮素的相关研究…………21.1.1槲皮素的药理研究...……………21.2其他研究进展……………32材料与方法……………………42.1试验材料…………………42.2PIEC鉴定…………………42.3不同浓度的QCT对PIEC增殖的影响……………42.4统计分析………………53结果与分析…………………53.1细胞形态学与免疫荧光染色鉴定………………53.2不同浓度QCT对PIEC活力的影响…………63.3不同浓度的QCT对H2O2作用的PIEC活力的影响……………64讨论…..…………….…75结论…..……………7参考文献……………………8致谢………………………10槲皮素对H2O2作用PIEC细胞增殖的影响摘要：为探讨不同浓度的槲皮素（quercetin,QCT）对H2O2作用的猪髋动脉血管内皮细胞（porcineiliacarteryendothelialcells,PIEC）增殖的影响，采用人第Ⅷ因子免疫荧光抗体检查法鉴定所购买的细胞系并体外培养，将细胞分为空白对照组、H2O2干预组、QCT组（5、10、10μM），于倒置相差显微镜下观察细胞形态，并用MTT法测定PIEC相对活力。结果显示，细胞呈典型的鹅卵石或铺路石状镶嵌排列，经人第Ⅷ因子免疫荧光抗体检查法鉴定为PIEC；QCT明显提高H2O2作用的PIEC活力，且存在剂量依赖关系。关键词：槲皮素；猪髋动脉血管内皮细胞；鉴定；MTT；增殖IDENTIFICATIONOFPIECANDEFFECTOFQUERCETINONPROLIFERATIONOFPIECINDUCEDBYH2O2Abstract：InordertoinvestigatetheeffectofstannicchlorideonimmuneinjuryofchicksBursaofFabricius.120chickswererandomlydividedinto4groups.Theexperime-ntgroupadded400mg/kg,800mg/kgand1200mg/kgstannouschloride(SnCl2)tothedietrespectively.Onthe7th,14th,21st,28th,35thand42nddaysofthetestrespectively,5animalswererandomlyselectedfromtheexperimentalgroupandthecontrolgroup.AftertheBursaofFabriciusistakenoutandhomogenized,thecontentsofIgA,IgMandIgGintheBursaofFabriciusofchicksineachgroupofdifferentagesofdayweremeasuredbyELISA.Theresultsshowthatwhenthecontentofstannouschloride(SnCl2)inthetestgroupexceeds400mg/kg,thecontentsofIgMandIgGintheBursaofFabriciusofchicksweresignificantlyreduces,causingtoxiceffectsonchicks,However,thedecreaseofimmunolob-ulinandlymphocytesecretionisthedirectcauseoftheimpairmentofimmunefunctionofBursaofFabriciusKeywords:SnCl2;ImmuneinjuryofBursaofFabricius;ELISA;immunologicfunction1前言槲皮素(Quercetin;3,3',4',5',5,7-Pentahydroxyflavone),异名栎精、槲皮黄素,化学名3，3，，4，，5，7-五羟黄酮，分子式C15H10O7,相对分子质量302.24。为黄色粉末(甲醇)，其二水合物为黄色针状结晶。[1]槲皮素可以通过酸水解得到，它是一种天然植物源性膳食黄酮，存在于花卉、树叶、茶叶、浆果、苹果等多种植物的常见食物中，主要以糖苷形式存在，如芦丁、槲皮素、金丝桃苷等。[2-3]许多中药，如槐米、侧柏、冬花、桑寄生、三七、银杏等，都含有这种成分；尤其是荞麦叶、沙棘、山楂、洋葱的含量较高。[4]本世纪初至今，国内外学者对槲皮素的提取、纯制备、结构测定、理化性质、合成衍生物、药理及临床应用等方面进行了大量的研究。血管内皮细胞是血液与血管壁之间的屏障。内皮细胞具有细胞通透性、选择性屏障和抑制作用血液、抗凝、纤维蛋白溶解、血液运输、血管活性物质代谢、血管舒缩力调节、生长因子的产生、纤维基质的增殖等;参与炎症反应[5]，影响血管生成、血管通透性和体液平衡等。血管内皮细胞是覆盖血管腔表面的连续单层扁平细胞，正常成人血管内皮细胞约1×1012个。血管内皮的主要功能是屏障功能。同时，血管内皮具有重要的内分泌功能，可以从内皮合成和释放多种血管激活因子，具有多种生理功能。1.1槲皮素的相关研究1.1.1槲皮素的药理作用大多数研究表明槲皮素不会致癌，而且槲皮素在人类中具有良好的耐受性。它作为一种潜在的化学抗癌药物，能抑制许多肿瘤细胞的生长，其作用机制主要有：细胞周期的阻断、抑癌基因表达调控、诱使细胞凋亡、浸润转移等；槲皮素能抑制淋巴细胞增殖来发挥免疫调节的作用；槲皮素具有较好的止咳、化痰、平喘功效，对血压血脂的降低、毛细血管脆性的减少、毛细血管阻力的增强、冠状动脉扩张、冠脉血流量增加等作用；槲皮素还具有显著的抗氧化作用，主要通过直接消耗活性氧自由基、清除自由基、鳌合金属离子以及抑制低密度脂蛋白氧化损伤，进而在内皮细胞氧化损伤过程中发挥保护作用。但是到目前为止，把槲皮素作为主要的成分来制药，并且投入临床使用的药物少之又少，尽管现在对槲皮素作用的研究越来越广泛，但是都处于临床前阶段，所以尽管槲皮素有许多的药理作用，但是却没有得到很好的临床应用，因此在这一块的研究也十分的重要。槲皮素来源广泛而且容易得到，很多的体外实验和动物实验都表明它具有广阔的应用前景，有希望能够在抗击癌症，抗氧化纤维化，抗炎症，以及心血管的保护等临床上扮演重要的角色，在未来的实验研究中，

进一步的开展大规模样本的临床研究和论证，就助于增快槲皮素的利用，新成分药物的发明是一项大规模任务，需要进一步的研究它的药代动力学，毒性等方面，才能确保临床用药的安全有效，在不久的将来，以槲皮素为主要成分的保健食品与新药物，将会为各种病的康复和治疗发挥大作用，能更加丰富和完备人类的医学资源宝库。研究者们多以人内皮细胞[6-8]探究槲皮素对其增殖影响和氧化损伤的保护作用，而对于猪等内皮细胞研究较少。但氧化应激是动物出现心血管疾病、代谢相关疾病以及神经紊乱等综合病症的主要原因之一，对畜牧业的发展危害极大，本文从畜牧养殖方面考虑，以猪髋动脉血管内皮细胞（porcineiliacarteryendothelialcells,PIEC）为试验材料，通过对PIEC鉴定、不同浓度的槲皮素对PIEC增殖的影响统计分析[9,10]，利用PIEC经免疫荧光染色后，观察细胞核和接触抑制情况[9]。通过不同浓度的槲皮素对H2O2作用的PIEC活力的影响，探究槲皮素对H2O2作用的PIEC增殖的影响，以便为后续槲皮素用作PIEC氧化损伤保护的研究提供参考。1.2其它研究进展杨翠霞等采用细胞计数，流式细胞仪等方法，检测o-H-A在内皮细胞中的作用。对Scr激酶，丝裂素A，蛋白激酶M激酶(ErK-1/2)磷酸化的激活和细胞周期蛋白D1到rSC-MAPK信号通路的表达水平参与透明质酸寡糖诱导PIEC细胞增殖进行了研究[13]；河南大学刘红亮、胡磊采用MTT比色法检测槲皮素对PC12细胞增殖的影响。建立H2O2诱导PC12细胞氧化损伤模型,分析槲皮素对PC12细胞H2O2损伤的保护作用；比较分析槲皮素保护组和对照组PC12细胞的活性氧水平和丙二醛含量，检测其抗氧化作用。对槲皮素超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的比较分析及抗氧化机制的初步研究[14]；重庆医科大学的安昌勇致力于探索槲皮素对结肠癌LOVO细胞增殖能力的影响。他通过细胞培养、细胞增殖活性测定和细胞克隆，分析了槲皮素对LOVO细胞系增殖的影响，为槲皮素潜在的抗结肠癌作用提供了理论依据[15]；邓晓慧用不同浓度的槲皮素治疗卵巢癌SKOV3细胞，采用MTT法检测细胞增殖抑制情况，并计算抑制率。利用免疫化学染色检测细胞凋亡、流式细胞术检测细胞周期和凋亡；得出结论——槲皮素在体外可抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖，阻止细胞从S期向G2期迁移，促进细胞凋亡，为卵巢癌的临床治疗提供依据[16]；山西中医学院附属医院孙怡,顾君为了研究槲皮素对乳腺癌细胞MDA-MB-231转移的影响及其作用机制，通过划痕实验和Transwell分析，考察了槲皮素对mdamb-231级电机性能的影响。采用Westernblotting研究槲皮素对mda-mb-231细胞中整合素3,1、基质金属蛋白酶-2(mmp-2)和mmp-9蛋白表达的影响。槲皮素和整合素通过虚拟对接技术进行体外评价。得出结果:槲皮素能抑制丙二醛-甲基溴-231细胞的增殖，且呈剂量依赖性。在Woundhealing实验和Transwell细胞迁移实验中，MDA-MB-231的迁移数随着槲皮素浓度的增加而减少。随着槲皮素浓度的增加，乳腺癌细胞的侵袭能力呈下降趋势。槲皮素能抑制整合素β3蛋白的表达，呈剂量依赖性，但对整合素β1的表达不明显。此外，槲皮素能显著抑制基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的蛋白表达。计算机虚拟对接结果显示槲皮素与整合素β3的结合能力较低，表明槲皮素与整合素β3具有良好的亲和力[17]。2材料与方法2.1实验材料PIEC（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。胎牛血清（上海依科赛生物制品有限公司）；0.25%-EDTA胰蛋白酶（美国Hyclone生物公司）；1640培养基（武汉普诺赛生物科技有限公司）；兔抗人第Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体、羊抗兔IgG-Cy3抗体（武汉博士德生物科技有限公司）；青霉素和链霉素混合液（双抗）（上海碧云天生物技术有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）；MTT试剂盒、DMSO（长沙维尔生物科技有限公司）；QCT（上海源叶生物科技有限公司）。倒置相差显微镜（AE2000，Motic）；荧光显微镜（OLYMPUS）；酶联检测仪（ELx800，Bio-Tek）。2.2PIEC鉴定于超净工作台配置完全培养基(10%胎牛血清+1%青-链霉素+1640培养基)，将购回的PIEC用0.25%-EDTA胰蛋白酶消化1-2min，终止消化，1000rpm，4℃离心5min，接种于完全培养基中，在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。根据细胞增殖情况及生长状态酌情换液、传代，取第4-7代PIEC用于实验。将PIEC接种至24孔板，待细胞生长至达80%左右时，弃掉原培养基，PBS缓冲液清洗2-3次后，以4%多聚甲醛于室温条件下固定15-30min，PBS缓冲液再清洗3次，5min/次；在37℃下加入0.1%tritonx-100PBS，膜破裂10分钟，然后用PBS缓冲液洗涤2次。30%H2O2与纯甲醇以1:50的比例混合，在室温下放置30min以灭活内源性酶，蒸馏水清洗，每次3min，重复3次；蛋白酶K进行修复，反应40s后，进行6min的PBS缓冲液清洗，3min/次；正常山羊血清在37℃下封闭30min左右。加入抗人VIII因子相关抗原兔多克隆抗体，在4℃孵育过夜；静置30min，用PBS缓冲液清洗，3min/次，清洗3次；加入羊抗兔IgG-Cy3抗体，避光条件下，37℃孵育40min，PBS缓冲液清洗，5min/次，清洗3次；荧光显微镜下观察并拍照。2.3不同浓度的QCT对PIEC增殖的影响取对数生长的第6代PIEC，以5×103/孔接种于96孔板内，培养基体积为100μL。将贴壁细胞分组：（1）空白对照组：培养基+PIEC；（2）模型组：H2O2（150μM）+PIEC（3）试验组：不同浓度PIEC+QCT（5μM、10μM、20μM）+H2O2（150μM）。每组设4个复孔，每孔加入含相应QCT浓度的培养液100μL（QCT溶解于DMSO中，CDMSO≤0.1%[18]）预处理2h，H2O2干预3h。除去原液后，每孔加入20μLMTT溶液及100μL培养基，在37℃下、5%CO2恒温培养箱中继续孵育4h。吸去所有液体（培养基+MTT），每孔加入150μL甲瓒（Formazan）溶剂，在室温下面，轻缓摇晃10min，然后充分混匀，在490nm波长处测定细胞吸光度值（OD）。细胞相对活力（%）=各组OD/空白组OD×100%2.4统计分析采用SPSS21统计软件将数据与均数分析进行比较，结果以“均数标准差(S)”表示。独立样本T检验两组之间,显著水平α=0.05,p<0.05有统计学意义。3结果与分析3.1细胞形态学与免疫荧光染色鉴定PIEC在基于CO2的培养箱(37℃，5%CO2)中培养，完全培养，并在约4小时后逐渐粘附到壁上。贴壁细胞以多边方式向外呈小三角形增殖，呈长椭圆形或长梭形，边界清晰，相互间无重复叠加。18h显微拍照，细胞形态见图1。48h可以单层平铺的形式铺满培养瓶底，呈铺路石或鹅卵石状镶嵌排列[19-20]。PIEC经免疫荧光染色后，明视野下，可见内皮细胞呈三角形发散生长，形态正常，可以观察到细胞核，接触抑制也明显易见[19]。在黑暗的视野中，可以看到明亮的红色荧光，并且核区域是最明亮的。荧光显微镜下观察结果如图2。经鉴定，该细胞为髋动脉血管内皮细胞。图1PIEC形态（100×）图2PIEC免疫荧光染色鉴定（200×）Fig.1ThemorphologyofPIECFig.2IdentificationofPIECbyimmunofluorescencestaining3.2不同浓度QCT对PIEC活力的影响图3不同浓度的QCT对PIEC增殖的影响Fig.3EffectofdifferentconcentrationsofQCTonproliferationofPIEC注：与对照组（0μM）比较，*：P﹤0.05；**：P﹤0.01。以不同浓度的QCT作用24h，结果显示，与对照组相比，5、10、20μM的QCT对PIEC无明显毒性作用（p＞0.05）。5、10、20μM为QCT的安全作用浓度，并以此作为干预试验的剂量。3.3不同浓度的QCT对H2O2作用的PIEC活力的影响图4不同浓度的QCT对H2O2作用的PIEC增殖的影响Fig.4EffectofdifferentconcentrationsofQCTonproliferationofPIECinducedbyH2O2注：*：P﹤0.05；＃＃/**：P﹤0.01。由图4分析得出，与正常组比较，150μM的H2O2作用3h显著抑制PIEC的增殖（P﹤0.01）。与H2O2模型组比较，QCT预处理2h后，呈剂量依赖性地显著促进PIEC的增殖，说明QCT可显著缓解H2O2作用的PIEC增殖抑制。4讨论在细胞培养过程中，所用的完整培养基在复苏、换液和传代前应在37℃水浴中预热，以免培养液取出冰箱后温度过低对细胞造成一定影响，细胞数量的增加将导致细胞间的接触抑制，经过几次传代后，细胞增殖的速度、状态和活力也会提高，在倒置相差显微镜下观察细胞状态，为了使拍摄的照片更加美观和立体，从多个角度调整培养瓶，并计算白平衡，根据放大率调节相位对比板，发现在培养瓶角落拍摄的细胞照片是最美丽和立体的。第VIII因子相关抗原抗体作为一种糖蛋白，广泛存在于血管内皮、淋巴管内皮细胞等，用于血管内皮细胞的鉴定。研究人员在对小鼠、猪和人的[19-21]血管内皮细胞等进行形态学鉴定时，都选择了第VIII因子作为关键指标，从而PIEC的鉴定结果保证了实验材料和MTT试验的可靠性。四甲基吡唑蓝(MTT)主要用于检测细胞存活率，活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将外源性MTT还原为蓝紫色晶体A，并沉积于细胞内，而死细胞不具有此功能。酶阅读器可以测量细胞的吸光度，以反映细胞的生长情况。用MTT法可以直接检测细胞的生长活性，间接反映细胞的生存状态[22]。QCT的浓度用无血清培养基稀释，稀释溶液中二甲基亚砜（DMSO）的浓度控制在0.1%以下。初步试验表明，二甲基亚砜（DMSO）浓度过高，明显抑制细胞生长。实验结果表明，当QCT单独作用于PIEC时，对照组和PIEC组的细胞活力无显著差异，表明QCT在5-20存活率范围内对血管内皮细胞增殖无明显影响[23]。不同内皮细胞对QCT的敏感性也不同；QCT作用于人脐静脉内皮细胞系ecv30448h后，可显著抑制其增殖，呈剂量依赖性作用性；QCT可以促进H2O2活化的PIEC的增殖，整体效果呈剂量依赖性，说明QCT可以保护H2O2活化的PIEC的损伤。QCT是一种天然黄酮类物质，具有免疫调节、抗癌、抗氧化等多种药理活性。近年来，对QCT的研究越来越多，内容也越来越广泛，如QCT含量测定法[24]、促进肿瘤细胞凋亡[25]、抑制与内皮功能障碍相关的动脉粥样硬化[26]、抗阿尔茨海默病[27]等。本文初步探讨了QCT对PIEC扩散的影响,但是对于QCT对H2O2诱导的PIEC效应的保护机制有待进一步的实验研究。5结论如目前的研究相似，5-10um浓度的槲皮素（QCT）对猪髋动脉血管内皮细胞（PIEC）无明显的毒素作用，槲皮素（QCT）可以显著缓解H2O2作用的PIEC增殖抑制。

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