DB54T 0574-2026 细粒棘球绦虫快速检测方法CRISPR-Cas12a

ICS 65.020.3054CCSB4354西 藏 自 治 区 地 方 标 准DB54/T0574—2026细粒棘球绦虫快速检测方法CRISPR-Cas12a2026-1-4发布 2026-2-5实施西藏自治区市场监督管理局  发布DB54/T0574DB54/T0574—2026PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1仪器材料与试剂 1操作方法 2附录A（资料性）目标扩增序列 4附录B（资料性）引物及浓度 5附录C（规范性）PCR反应体系配置 6附录D（资料性）颜色检测结果判定 7附录E（资料性）荧光值检测结果判定 8前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位：西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所、佛山大学。本文件主要起草人：唐文强、黄福强、石斌、赵霞玲、马弘财、罗润波、孙建春、张明珠。DB54/T0574DB54/T0574—2026PAGEPAGE1细粒棘球绦虫快速检测方法CRISPR-Cas12a范围本文件规定了细粒棘球绦虫CRISPR-Cas12a检测的仪器耗材与试剂、操作方法及结果判定等要求。本文件适用于实验室对细粒棘球绦虫的快速检测。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB19489 实验室生物安全通用要求术语和定义下列术语和定义适用于本文件。CRISPR-Cas12aCRISPR全称为ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，中文翻译为“成簇的规律间隔短回文重复序列”，是细菌的适应性免疫系统。Cas全称为CRISPRassociatednuclease，指CRISPR效应蛋白又称为Cpf1RNA引导的DNA细粒棘球绦虫一种在世界范围内流行的人畜共患慢性寄生虫，属圆叶目（Cyclophyllidea）带科（Taeniidae）棘球属绦虫，可引起囊型棘球蚴病（cysticechinococcosis,CE）。仪器材料与试剂仪器以下仪器用于细粒棘球绦虫样本的保存、灭活和试验处理。实时荧光恒温扩增仪、恒温培养箱等任意一种可以恒温在37℃的仪器；b)微量移液器（1μL～10μL，20μL～200μL，200μL～1000μL）；c)掌上离心机：最高转速不小于8000rpm；d)冷冻式离心机：最高转速不小于15000rpm；e)涡旋震荡仪；f)-80°超低温冰箱；gPCR材料以下材料用于细粒棘球绦虫样本的PCR试验。a)0.2mL透明顶盖PCR反应管；b)离心管（1.5mL）；c)一次性移液器吸头；d)冰盒。试剂粪便基因组DNA提取试剂盒，LbCas12a核酸酶，反应缓冲液CleavageBuffer，荧光探针reporter，RPA试剂盒，阴性质控：ddH2O，阳性质控：含有目标核酸片段的质粒制品，见附录A；crRNA及RPA引物序列及配制的母液浓度见附录B。操作方法生物安全措施检测过程中不得直接接触待检样品，个人防护及废弃物处置应按照GB19489的规定处理。样品采集和处理样品采集和处理应当符合GB19489实验室生物安全通用要求,并遵循以下操作。采集含细粒棘球绦虫组织的病料、细粒棘球绦虫组织/虫卵污染的环境样本或新鲜犬粪200mg～500mg，放入1.5mL离心管中，冷藏运至实验室，-80℃保存,待提取DNA；含细粒棘球绦虫成虫或虫卵的样品提取DNA前应先放置于-80℃超低温冰箱冷冻不少于7天，以灭活病原；使用通用型基因组DNA提取试剂盒提取含棘球绦虫/蚴组织样本全基因组，使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取含棘球绦虫成虫或虫卵的粪便样品全基因组；提取好的全基因组置于4℃保存，若不能当天检测，应放于冰箱冷冻室-20℃保存。检测前准备将所用恒温设备调至37℃预热。若为实时荧光恒温扩增仪或荧光定量PCR仪，将其扩增温度设置为37℃，扩增时间为30min，且每分钟读取一次荧光。检测过程CRISPR-Cas12a法检测核酸的操作方法如下。将CRISPR/Cas12aCleavageBuffer和荧光探针reporter反应液置于室温彻底融化，上下颠倒6次～7次混匀；30μL，体系。按照附录C配制反应体系；配制好反应体系后盖紧离心管，上下颠倒6次～7次，瞬离；d)将反应管置于37℃恒温条件下开始反应。结果判定判定方法法检测细粒棘球绦虫核酸的结果，采用如下方法进行检测。可视法检测：同批反应的阳性对照在蓝/紫光灯照射下能观察到反应溶液变为黄绿色，且阴性对照溶液为无色透明；荧光法检测：使用实时荧光恒温扩增检测仪或荧光定量PCR仪读取结果，同批反应的阴性对照荧光值处于稳定状态，而阳性对照荧光值呈明显上升趋势且荧光值明显大于阴性对照。结果判断CRISPR-Cas12a法检测细粒棘球绦虫核酸的结果，采用如下方法判定。30min后在蓝/PCR内荧光值呈明显上升趋势的样本判定为细粒棘球绦虫核酸阳性；反之，30min无任何上升趋势的样本判定为阴性；若上升趋势不明显，仅略高于阴性荧光值的样品判定为可疑，见附录E。1附 录 A（资料性）>NC_044548.1:3424-4005Echinococcusgranulosusmitochondrion,COX2gene（此序列来源于NCBI的RefSeq数据库中细粒棘球绦虫参考线粒体基因组的COX2基因序列）GTGAAATTGTCGTTGTTATATTATGATATTGTGTGTTATATTGTGGCGGTTTGTGTATTTATTGTTTGTTTTGTGTATGTTTTGTTGTGTTGGAATGTGGTGTTTGGCGTTGGTACTGTTAAATTTGGTAGTGAGAATCAGATTATAGAGTTGGTATGAACTGTTATTCCTACTGTGGTTGTGTTAGTTTTGTGTGCCTTGAAAGTTAAATTTATTACTAGTGATTTAGATTGTTTTTCTTCTGAGACTATTAAGGTGGTTGGTCATCAGTGATATTGGACTTACGAGTATTTTGGCGGTGGCTATGATTCGTTTCCGATTGGGGATTATTTTGTGGTAGATAAGCCTTTGCGGATGGTTTATGGTGTACCATATCATTTGGTTGTAACTTCAAGTGATGTAATTCATTCGTTTTCTGTTCCTTCATTGAATTTGAAGATGGATGCTGTTCCTGGCCGTCTTAATCATTTGTTTTTTTGTCCTTCTCAACATGGGTCTTTTGTTGGTTATTGTGCTGAATTGTGTGGTGTTAATCATAGAGTTATGCCTATTGTTGTGGAGGTTGTTGGGGGTTGTTGTTAG附 录 B（资料性）引物及浓度序列名称核酸序列母液浓度（μM）crRNA5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGAGACUAUUAAGGUGGUUG-3’1RPA-F5’-CCTACTGTGGTTGTGTTAGTTTTGTGTGCC-3’10RPA-R5’-CCCAATCGGAAACGAATCATAGCCACCGCC-3’10DB54/T0574—2026DB54/T0574—2026附 录CPAGEPAGE6（规范性）PCR反应体系成分单个反应RPA试剂盒RPA干粉2/5个ABuffer11.76μLRPA-F0.8μLRPA-R0.8μLBBuffer2μLCRISPR相关试剂10×LbCas12acleavageB