首医大临床生物化学实验课件10 alt的测定

血清谷—丙转氨酶活性的测定（改良赖氏法）1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。目的要求血清谷丙转氨酶作用于由丙氨酸及a一酮戊二酸组成的基质。产生丙酮酸及谷氨酸血清加基液保温后产生丙酮酸的多少，即反应出谷丙转氨酶活性的大小。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在酸性溶液中显黄色，在碱性溶液中成醌型显棕红色。实验原理血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：

生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。

尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎协作会议也建议统一使用改良赖氏法。本实验是在碱性条件下，生成醌类化合物的量反应丙酮酸的量，即反应了谷丙转氨酶的活性。求酶活性单位的方法：

1、标准品对照法：检品与标准丙酮酸液同样处理呈色，进行比色，计算出酶活性单位。

2、标准曲线法：取含待测物的一系列标准溶液，作标准曲线，由标准曲线查得活性单位。取干净试管12支，按下表所示标号，要求各S管和U管进行双管平行操作。先做对照管和测定管，在30min保温期间再做空白管和标准管。1.赖氏法测定ALT的标准曲线(即剂量反应曲线)在坐标纸上以上表中An－A0之值为纵坐标，相应的酶活性的卡门氏单位为横坐标作图，即得赖氏法测定ALT的标准曲线实验结果2.标本中ALT活性结果查标准曲线利用测定所得的吸光度结果(AU－AB)，便可从标准曲线上查得标本的ALT结果5-25卡门单位

参考范围⑴常温下标本不宜久置，采血4个小时内应进行测定。⑵严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管。⑶当标本的酶活力超过150K氏单位时，应将血清用0.145mol/L氯化钠液稀释重做，其结果乘以稀释倍数。注意事项⑷α-酮戊二酸，2,4-二硝基苯肼是直接显色物,NaOH的浓度与显色深浅有关,因此它们的浓度必须很准确。操作中加0.4NNaOH液时，需以较慢速度加入，并且边加边摇匀加快时则a一戊酮二酸引起的发色增强。⑸丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。⑹加入2,4-二硝基苯肼溶液后应充分混匀，使反应完全。

⑺保温温度、作用时间、加入试剂的方式方法、速度和时间间隔都应准确掌握。建议将试管架置37℃水浴中操作。从第一管加液混匀后开始计时，以一定时间间隔、加液方式和混匀方式依次向各管加入基质液；当第一管保温达到30min时，即刻以加基质液相同的时间间隔和加液、混匀方式，依次又向各管加入2,4-二硝基苯肼，如是操作，直到做完本实验。⑻每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。【方法评价】ALT活性测定主要有两类。一是卡门氏（Karman）分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理如下：由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。

二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun

法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min，Mohun法和Reiman法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。

King法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下与底物作用60min，生成1μmol丙酮酸称为一个单位。

Mohun法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作用30min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，每分钟1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位=0.4821IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后，新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，产物旁路效应，使赖氏法的重现性较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。

肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。ALT显著增高见于