CN108823328B 野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用 （云南省农业科学院经济作物研究所）

(10)授权公告号CN108823328B(22)申请日2018.05.30(65)同一申请的已公布的文献号申请公布号CN108823328A(43)申请公布日2018.11.16(73)专利权人云南省农业科学院经济作物研究所地址650000云南省昆明市盘龙区北京路2238号(72)发明人郭蓉郭鸿彦陈璇杨明张庆滢郭孟璧许艳萍吕品(74)专利代理机构云南凌云律师事务所53207代理人康珉cultivatedCannabis.《BIOSCIENCE,82卷(第11期),第1902-1910页.transcriptomeofCannabis.《GenomeBiology》.2011,第12卷第1-17页.15/11(2006.01)野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用本发明公开了野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用。其作为内参基因的是基因PP2A或基因EF1α,基因PP2A或基在野生大麻和栽培大麻始果期不同部位中表达稳定性最高，解决了野生大麻和栽培大麻基因表达研究中没有内参基因的现状，为下一步研究不21.扩增基因PP2A作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的引物的扩增基因PP2A作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的引物为PP2A引物，所述PP2A引物由引物PP2A-F和引物PP2A-R组成：所述引物PP2A-F的碱基序列如核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示；所述大麻为野生大麻或栽培大麻。2.基因PP2A作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的应用，所述内参基因PP2A的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述植株不同部位为大麻植株的根、茎、3.根据权利要求2所述的基因PP2A作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的应用，其特征在于：所述大麻为野生大麻或栽培大麻。3野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用技术领域[0001]本发明涉及植物分子生物学领域，具体是指用于野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用。背景技术食品和制药等领域。大麻主要起源于中亚地区，现全世界均有分布(栽培种或野生种)。我国西和安徽等地。野生大麻和栽培大麻在株高、分枝数、千粒重和大麻素含量等生物学性状和农艺性状方面具有显著差异。通常野生大麻植株矮小，茎秆质地较硬，种子落粒性强，大麻素含量低，且具有栽培大麻所不具备的部分优良特性如抗寒、抗病和抗盐碱等，是育种工作者开展品种选育和遗传改良的优异资源和材料。因此，明确这两种不同类型大麻在上述生物学性状和农艺性状的基因表达差异就显得尤为关键。[0003]实时荧光定量PCR技术是一项快速准确、灵敏度高和特异性强的定量分析技术，现已广泛应用于植物领域中基因表达分析和研究。该项技术的准确性和可靠性受诸多实验因的数据，需要选择合适的内参基因进行校正和标准化。而理想化的内参基因应该在各种类型的细胞、组织和各种外界因素下都恒定表达。然而，近年来大量研究结果表明，并没有表达绝对稳定的内参基因，任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实已不乏内参基因的筛选和验证的报道，而在野生大麻和栽培大麻中开展与大麻素合成相关基因的表达分析时尚没有合适的内参基因可供选择。本发明根据7个候选基因在野生大麻和栽培大麻始果期(此时期大麻素含量最高)不同部位的表达情况，筛选出适用于研究这两种不同类型大麻基因表达分析的内参基因。发明内容[0004]为解决目前还没有适用于野生大麻和栽培大麻基因表达研究的内参基因的技术问题，本发明提供了作为野生大麻和栽培大麻实时荧光定量分析的内参基因及其引物的应[0005]为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：[0006]1.用于大麻基因表达研究的内参基因，其特征在于：所述内参基因为内参基因PP2A或内参基因EF1α,所述内参基因PP2A的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示，所述内参基因EF1α的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。[0007]2.大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR内参基因，其特征在于：所述内参基4因为内参基因PP2A或内参基因EF1α,所述内参基因PP2A的核苷酸序列如序列表中SEQID[0008]3.根据技术方案2所述的大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR内参基因，其[0009]4.技术方案1所述的用于大麻基因表达研究的内参基因或权利要求2或3所述的大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR内参基因，其特征在于：所述大麻为野生大麻或栽培大麻。[0010]5.扩增基因PP2A或基因EF1α作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内[0011]扩增基因PP2A作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的引物为PP2A引物，所述PP2A引物由引物PP2A-F和引物PP2A-R组成：所述引物PP2A-F的碱基序列的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示；[0012]扩增基因EF1α作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因的引物为EF1α引物：所述EF1α引物由引物EF1α-F和引物EF1α-R组成：所述引物EF1α-F的碱基序列[0013]所述大麻为野生大麻或栽培大麻。[0014]6.基因PP2A或基因EF1α作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因，所述内参基因PP2A的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述内参基因EF1α的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。[0015]7.根据技术方案6所述的基因PP2A或基因EF1α作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因，其特征在于：所述植株不同[0016]8.根据技术方案6或7所述的基因PP2A或基因EF1α作为大麻始果期植株不同部位实时荧光定量PCR的内参基因，其特征在于：所述大麻为野生大麻或栽培大麻。[0017]本发明的有益效果：[0018]1、本发明首次筛选出在野生大麻和栽培大麻始果期植株不同部位中表达最稳定[0019]2、筛选出的内参基因适用于野生和栽培两种不同类型大麻同一时期不同部位中与大麻素合成相关基因或其他功能基因的表达分析，能显著提高所得数据的准确性，其操作相对简单，成本较低，灵敏度高，精确度高，解决了野生大麻和栽培大麻基因表达研究中没有内参基因的现状，为下一步开展不同基因型大麻中基因表达研究提供了有力的支持。[0020]3、本发明设计的用于作为在野生大麻和栽培大麻始果期植株不同部位中表达最[0021]综上所述，本发明首次筛选出在野生大麻和栽培大麻始果期植株不同部位中表达最稳定的内参基因，筛选出的内参基因适用于野生和栽培两种不同类型大麻同一时期植株不同部位中与大麻素合成相关基因或其他功能基因的表达分析，能显著提高所得数据的准5[0022]序列表中SEQIDNO.1所示的是内参基因PP2A的核苷酸序列，基因PP2A的GeneBankAccessionNo.:JP470792.1。[0023]序列表中SEQIDNO.2所示的是内参基因EF1α的核苷酸序列，基因EF1α的GeneBankAccessionNo.:JP452083.1。[0024]序列表中SEQIDN0.3所示的是基因ACT2的核苷酸序列，基因ACT2的GeneBankAccessionNo.:JP451309.1。[0025]序列表中SEQIDNO.4所示的是基因18SrRNA的核苷酸序列，18SrRNA基因的GeneBankAccessionNo.:JP477000.1。AccessionNo.:JP451550.1。[0027]序列表中SEQIDNO.6所示的是基因UBQ的核苷酸序列，基因UBQ的GeneBankAccessionNo.:JP465573.1。[0028]序列表中SEQIDNO.7所示的是基因TUB的核苷酸序列，基因TUB的GeneBankAccessionNo.:JP475803.1。[0029]序列表中SEQIDNO:8所示的是引物PP2A-F的碱基序列。[0030]序列表中SEQIDNO:9所示的是引物PP2A-R的碱基序列。[0031]序列表中SEQIDNO:10所示的是引物EF1α-F的碱基序列。[0032]序列表中SEQIDNO:11所示的是引物EF1α-R的碱基序列。[0033]序列表中SEQIDNO:12所示的是引物ACT2-F的碱基序列。[0034]序列表中SEQIDNO:13所示的是引物ACT2-R的碱基序列。[0035]序列表中SEQIDNO:14所示的是引物18SrRNA-F的碱基序列。[0036]序列表中SEQIDNO:15所示的是引物18SrRNA-R的碱基序列。[0037]序列表中SEQIDNO:16所示的是引物UBQ-F的碱基序列。[0038]序列表中SEQIDNO:1[0039]序列表中SEQIDNO:18所示的是引物TUB-[0041]序列表中SEQIDNO:20所示的是引物GAPDH-F的碱基序列。[0042]序列表中SEQIDNO:21所示的是引物GAPDH-R的碱基序列。附图说明[0043]图1是实施例中7个候选内参基因和2个目的基因的琼脂糖凝胶电泳图。图1中，M为TransDNAMarker,泳道1为EF1α,泳道2为UBQ,泳道3为PP2A,泳道4为ACT2,泳道5为18S[0044]图2是实施例中通过GeNorm软件比较每个候选内参基因表达稳定度M值排序图。图2中，横坐标表示内参基因，纵坐标表示每个内参基因对应的内参基因表达稳定值M,M值越大稳定性越低，最右侧两个内参基因PP2A和EF1α的M值最小，是GeNorm分析中最稳定的两个[0045]图3是根据GeNorm软件通过成对变异系数(Vn/Vn+1)确定最适合的内参基因的数6[0046]图4为实施例中目的基因MDS和OLS在栽培大麻中以EF1α内参基因计算的表达情[0047]图5为实施例中目的基因MDS和OLS在栽培大麻中以PP2A为内参基因计算的表达情[0048]图6为实施例中目的基因MDS和OLS在栽培大麻中以GAPDH为内参基因计算的表达具体实施方式[0049]以下用实施例对本发明作进一步的说明，实施例中无特殊说明的为常规方法。[0050]实施例1[0051]野生大麻和栽培大麻始果期植株不同部位中表达最稳定的内参基因的筛选和稳[0052]1、实验材料取样：分别用野生大麻CF1(采集于内蒙古赤峰市)和栽培大麻YM7共30个样品。所有样品离体后速冻于液氮中，然后置于-80℃保存。-80℃保存的野生大麻[0054]3、cDNA的第一链的合成：采用cDNA反转试剂盒(EvoscriptUniversalcDNAMaster,Roche)按照说明书将步骤2获得的总RNA反转录成cDNA,作为荧光定量PCR模板。[0055]4、根据大麻基因组注释结果选取7个候选内参基因，利用PrimerExpressv3.0软件，遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计引物，其扩增片段为100-150bp,实时荧光定量PCR特异引物序列如表1所示，引物特异性扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测显示，所有候选内参基因均只有一个条带(见图1)。所有引物由擎科生物科技(昆明)有限公司合成(PAGE纯化法)。所述候选的7个内参基因如下：[0056]蛋白磷酸酶2基因(PP2A),其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，转录延伸因子基因(EF1a),其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，肌动蛋白2基因(ACT2),其核苷酸序列如SEQID酸-脱氢酶基因(GAPDH),其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，泛素蛋白基因(UBQ),其核苷酸[0057]对步骤3中获得的cDNA样品用一对跨内含子设计的引物来进行PCR,然后对DNA去[0058]5、引物设计：根据上述候选内参基因序列通过PrimerExpressv3.0设计该基因相应的特异性引物(其特异性根据熔解曲线和琼脂糖凝胶电泳进行判断)。各内参基因的扩增引物等信息详见表1。TimePCR(Illumina,USA)仪中进行扩增，获得各个候选内参基因的表达数据Ct值。[0060]7、根据所得Ct值通过GeNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对各候选内参基因的稳定性进行分析，筛选出表达最稳定的内参基因并确定最优内参基因数目。7[0061]表1七个候选内参基因的基因名基因名引物序列扩增长度率引物ACT2-F的碱基序列如SEQID列如SEQIDNO:13所示。引物18SrRNA-F的碱基序列如SEQ引物UBQ-F的碱基序列如SEQID列如SEQIDNO:17所示。引物TUB-F的碱基序列如SEQID列如SEQIDNO:19所示。引物GAPDH-F的碱基序列如SEQIDNO:20所示，引物GAPDH-R的碱基序列如SEQIDNO:21所示。引物EFla-F的碱基序列如SEQID列如SEQIDNO:11所示引物PP2A-F的碱基序列如SEQIDNO:8所示，引物PP2A-R的碱基基[0063]8、利用两步法来进行实时荧光定量PCR,在EcoReal-TimePCR(Illumina,USA)仪运行。所用反应体系和程序参考Roche公司的FaststartEssentialDNAGreenMaster试剂盒的说明书。PCR反应体系为10μ1,其中模板cDNA1μ1,上下游定量引物10μM各0.5μ1,采用两步法，即在95℃酶激活10min之后，先运行40个循环的95℃10s,60℃30s,再运行熔解曲线阶段的95℃15s,55℃15s,95℃15s。通过观察PCR反应后生成的熔解曲线为单一峰判定所用引物无非特异扩增；实验得到Ct平均值见表2。[0064]表2野生大麻和栽培大麻始果期不同部位内参基因Ct值8栽培大麻根根茎叶花根根茎叶花重复1重复1重复1重复1重复1重复1重复1重复1重复1重复1[0066]9、采用GeNorm软件分析7个候选的内参基因表达的稳定性：利用步骤8中获得的Ct值(表2),用GeNorm软件计算选出7个内参基因表达的稳定性M值(图2),M值越大，表明稳定部位荧光定量稳定表达的内参基因为PP2A和EF1α,而相对最不稳定的是GAPDH。表明需选择n个以上的基因组合作为量化标准；Vn/n+1<0.15,表明只需选择n个内参基因作为量化标准。由图3可以看出，V₂/₃值小于0.15,表明在这些样品中进行基因表达分析所需的最小内参基因数目n=2,即PP2A和EF1α。[0068]11、使用NormFinder软件对候选内参基因进行分析：NormFinder软件通过计算Ct值组内方差与组间方差来确定候选内参基因的稳定值(Stabilityvalue,SV),稳定值越小，内参基因表达就越稳定；反之不稳定。根据NormFi值(Stabilityvalue,SV)最低，为0.092,其次是PP2A和EF1α,均为0.104,18SrRNA的稳定值为0.287,UBQ的稳定值为0.353,TUB的稳定值为1.262,而GAPDH的SV值最高(3.561),表明它最不稳定，这和GeNorm软件分析的结果一致。7个候选内参基因的稳定性从高到低排序依9[0069]12、采用BestKeeper软件对候选内参基因进行分析：BestKeeper软件直接根据各候选内参基因原始Ct值的标准差(standarddeviation,SD)、变异系数(coefficientofvariation,CV)和相关系数(coefficientofcorrelation,r)筛选出最适内参基因。其中，标准差和变异系数越小，相关系数越大，表示稳定性越高，反之则稳软件分析结果可知(见表3),除TUB外，其余候选内参基因Ct值的标准差都小于1,表明所有稳定性相对最高，而内参基因TUB对应的标准差最高(1.57),这表明该内参基因相对不稳[0070]表3BestKeeper软件分析结果[0072]13、利用内参基因对大麻素合成相关基因MDS和OLS进行表达验证[0073]基因MDS(2-C-甲基-D-赤藓醇2:4-环二磷酸合酶)是MEP途径中的一个关键酶，MEP途径最终合成GPP,参与大麻素的合成。基因OLS(聚酮合酶)是大麻素合成途径中的一个关键催化酶，通过催化乙酰辅酶A生成OLA(大麻素合成的关键底物)。材料，以茎为对照，实时荧光定量PCR检测目的基因MDS和OLS在栽培大麻不同部位的表达情况。荧光定量体系和反应程序参照步骤8,荧光定量内参基因和目的基因均设3个重复孔，每Ct内参期因。各处理间差异采用Excel进行统计分析。和根中表达量依次降低。料，以茎为对照，实时荧光定量PCR检测目的基因MDS和OLS在栽培大麻不同部位的表达情和根中表达量依次降低。材料，以茎为对照，实时荧光定量PCR检测目的基因MDS和OLS在栽培大麻不同部位的表达情[0079]结果如图6所示，两个目的基因均以茎为对照，基因MDS在根中表达量最大，其次为和叶中表达量依次降低。CN108823328B序列表1/8页11序列表<110>云南省农业科学院经济作物研究所<120>野生大麻和栽培大麻荧光定量分析的内参基因及其应用taaaactacaaatcccactcgctctcatcgcctttctccccaactcccattcttcttcgttccactctttttcgaggactgatctcccagcttgggtggtttagttattctggtgcatattcacgaaggagagggtggtagcgagcgagcgagatgggcatgaacaagccactctccgagcaacaggttagagccctatgtgacggatgaaagcaacgttcagcccgtgcagtttcatgatcttgctgaactttttcgaattggagggtttgtttatgggagactatgtggaccgtggatattattctgttgaaactgtgacgcttctggtggccttaaaagtgcgtttcgtcagattactcaagtttatgggttcaatgtctggaagacttttacaatcggaaattttttgtctgcatggtggtttgtacgtaattttgatcgtgttcaagaggttccgtctgacccagatgatcgatgtggttggggtggccaggatatttctgaacaatttaatcatactaacagcttcatcagttggtcatggatggatacaactgggcacatgagcaaaaggtagtgcacccaattattgctaccgttgtggcaacatggcctctctgcaagaaccacaccttactactggttccactcacgttctggtggttgctacaattctaccttctgatgcatttttgaataagctgcctactgatttgtcttacacttgaacatcgcttgccaaaagctgattgttttagtctgtttctaatatcttctccattagtggatatttgccctcttttttcagtaatttacatgatcagcagcgttctggttgttatttttgactctcatatcatgatagacagacagtacagttacaaacgtcttcttctactgttcttggtggaaaaccctgctgtgttcttgtattcaCN108823328B序列表2<213>大麻(CannabissativaL.)tgctccgatttctcattctttgatttcttctgcgaattggcatgccagagctggacgaacaattatttgagctcatacatatgcctcggaaaattaataccggagttgattattacgacgactatgaatatgactatgatggagaagaagagaatgttgaagttgtgcagtagtagaaggcccgagacatggagttgctcaatatgcacgtatgataatgaagagaacgcatgtgatatatgtggggttcttcgcaaccctttgcccaaaaaagcaagtttgaaagtccatctcctgatgatttggtttcaattggattgcgttcatccaagtttgaaagccaatgttgataatttaaagaatacaacttctcgtaatgaacgaagtgctaacatttcggatgtctcatctgattctgggggaggcgagttacaaaaccagtgatactgcttatgcagaatcgcttattcagaaccaaaaggcagacagagtaataagggcaagccagaaagtctctggaaagtcaaacaatgttaaatctaaattggtcatgttgattccgggaaatcaactccctttgcttatgcttgggcattagatgaaagtgacggtggctgtggcatatttcgattcgaccgggcacaaagattttgttcccaacatgattctcgtaatagatgcctcccttggggcataaacacgagagcatgcacaatgaacaagatggatatcatagtcgggacatttctccgcgttgtgtcatggaaaatcaaaatttggttgcagctcctgcctgtggtaaattggaacttctggagagataggaaccgtgcgatccttagagcgcaagagctggagataatgttctggtggggtgctatgtcatcccgattttcagattctcgtcttggatgtgacaactccaatattacaccacgtaaaggaagtggcgagagtcgtaaagatagtacgggcaaggtagcaaagaaggctcctcgttgtcttactgcaggttgttttgcacggatcagtttgcgttgacgggtgtttctgagagcattaggacgaactgtagcggtagtagagtaccatttttgatgtatttttacttcaattCN108823328B序列表3/8页ttattagtatactaatcttggttttattttcactc<213>大麻(CannabissativaL.)caaggctgggtttgctggagatgatgctcctcctcgtcacactggtgtaatggttggaatgggccggcacaatccaagcgaggtatcttaactcaactgggatgacatggaaaagatctggcatcacactttccctgaggaacaccccgttcttcgaaaatgacccagatcatgtttgagacctttaacactcctgctatagccgttctttctctgtatgccagtggtcgtggtgtaagccatactgtccccatatacgatcttgatcttgctggtcgtgatcttacatactccttcaccaccactgctgaacgggaaattgtgagggacctacatagctcttgactttgagcaggagatggagaagagttatgagttgccagacgggcaagtcatcaccattggttcctgaagttcttttccaaccttcattggtttgtcctgtctggtggttcaaccatgttcccaggcatctctgctcttgcaccaagctctatgaatgcaaaagcagagtacgatatgtgagaattagaactaagaaaagtgttgtttgctgaagtgacttcggaaggccaggagttaattatttttgttattacaacttctttgattatcattattattattttttcatgagataaaacctttattttatgaatca<213>大麻(CannabissativaL.)caacgcagaggcctagttacgggggagaa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