基于线粒体pcox1分析狼蛔虫种系发育关系

基于线粒体pcox1分析狼蛔虫种系发育关系ANALYSISOFPHYLOGENETICRELATIONSHIPOFASCARISLUMBRICOIDESBASEDONMITOCHONDRIALPCOX1

目录TOC\o"1-3"\h\u9397摘要 127613关键词 122551前言 260581.1犬弓首蛔虫的生活史 2172061.2流行病学研究调查 2237181.3研究目的和意义 337832材料与方法 3176652.1虫体样本 393922.2主要试剂与实验仪器 315372.3样品基因组DNA的制备 427232.3.1虫体裂解 4179052.3.2虫体DNA的提取 4121853扩增引物与PCR扩增 43131841%琼脂糖凝胶电泳检测 5132335cox1序列分析与进化树的构建 5268416扩增结果与分析 6235296.1测序结果及序列同源性分析 6267696.2cox1基因序列系统发育树分析结果 7119197讨论 832555参考文献 92013致谢 11基于线粒体pcox1分析狼蛔虫种系发育关系摘要:为阐明犬弓首蛔虫线粒体中的细胞色素c氧化酶第一亚基部分序列（pcox1）的遗传多态性，以研究犬弓首蛔虫种系发育关系,本研究以湖南省长沙动物园狼蛔虫为研究对象，通过多聚酶链式反应（PCR）对其线粒体部分序列（pcox1）进行扩增并测序。对部分序列进行分析比对以后，结合GenBank上收录的犬弓首蛔虫以及其蛔虫属的序列，共同构建系统进化树，以此分析犬弓首蛔虫种内与种间的种系发育关系。研究结果显示：湖南长沙动物园采集虫体样本的pcox1序列长度约为450bp，两个分离株pcox1基因序列相似性为99.9%，种内差异为0.1%，与犬弓首蛔虫Toxocaracanis的序列相似性最高，为99.1%。进一步系统进化分，与犬弓首蛔虫Toxocaracanis的序列相似性最高，为99.1%。进一步系统进化分析结果显示，本研究中获得的虫株与GenBank中包含的犬弓首蛔虫所在分支距离较近，与其他属蛔虫所属分支距离较远。可以认为，此次试验获得的分离株虫体为犬弓首蛔虫。结实验果显示：犬弓首蛔虫的pcox1序列具有较大的种间变异性，在种内具有保守性，可作为研究寄生虫种间与种内遗传变异的分子标记。本研究为犬弓首蛔虫的分子生物学研究提供了一定的依据。关键词:狼蛔虫；线粒体DNA；cox1基因；种系发育关系ANALSISYOFPHYLOGENETICRELATIONSHIPOFASCARISLUMBRICOIDESBASEDONMITOCHONDRIALPCOX1Abstract:Toelucidatethegeneticpolymorphismofthepartialsequenceofthefirstsubunitofcytochromecoxidase(pcox1)inthemitochondriaofToxococcuscanis,inordertostudythegermlinedevelopmentalrelationshipofAscariscanis,thisstudyusestheAscarislumbricoidesinChangshaZoo,HunanProvinceasanexampleTheresearchobjectwastoamplifyandsequenceitsmitochondrialpartialsequence(pcox1)bypolymerasechainreaction(PCR).Afteranalyzingandaligningsomeofthesequences,thephylogenetictreewasanalyzedbycombiningthesequencesofAscariscanisandAscarisgenuscollectedonGenBanktoanalyzethephylogeneticrelationshipbetweenandwithinthespecies.Theresultsofthestudyshowedthatthelengthofthepcox1sequenceofthewormsamplescollectedbytheChangshaZooinHunanwasabout450bp,thesequencesimilarityofthetwoisolatespcox1genewas99.9%,andtheintraspeciesdifferencewas0.1%,whichwassimilartothatofToxocaracanisThehighestwas99.1%.FurtherphylogeneticanalysisshowedthatithadthehighestsequencesimilaritytoToxocaracanis,99.1%.FurtherphylogeneticanalysisshowedthattheinsectstrainobtainedinthisstudyhadthesamebranchastheisolateofToxocaracanisinGenBank,andwasfarawayfromthebranchofotherisolatesofroundworm.TheresultsshowthatthePCox1sequenceofToxocaracanisisoflargeinterspeciesvariabilityandisconservedwithinthespecies,whichcanbeusedasamolecularmarkertostudythegeneticvariationbetweenandwithinthespeciesofparasites.ThisstudyprovidesacertainbasisforthemolecularbiologyresearchofToxocaracanis.Keywords:Ascarislumbricoides;mitochondrialDNA;cox1gene;germlinedevelopmentrelationship1前言广义的蛔虫是指蛔目的线虫，蛔目寄生线虫隶属3个主要的科，蛔科，禽蛔科，弓蛔科[1-2]。弓首蛔虫是呈世界性分布的线虫,在动物分类上属于蛔目(Ascarididea)弓首科(Toxocaridae)弓首属(Toxocara)[4]。包括犬弓首蛔虫(T.canis)、猫弓首蛔虫(T.cati)、犊弓首蛔虫(T.vitulorum)、马来西亚弓首蛔虫(T.malayasien-sis)、山猫弓首蛔虫(T.lyncus)等[1-2]。犬弓首蛔虫病是由犬弓首蛔虫（Toxocaracanis）寄生于犬和其他动物（包括人）而引起的一种动物源性寄生虫病[3]。犬弓首蛔虫是寄生犬科的蛔虫，与猫科动物的蛔虫都属于弓首属（Toxocara)和弓蛔属（Toxascaris）[3-4]。它的幼虫可以进入非特异性宿主（包括人类）的组织中，引起幼虫移行症，在公共卫生学上具有重要意义[3-4]。蛔虫是一种世界性肠道寄生虫，犬弓首蛔虫是犬常见的一种寄生虫病，呈世界性分布，据调查，犬的感染率在5.5%~64.7%[5]。犬弓首蛔虫不仅寄生于犬，还常见于狐等犬科动物，也可以寄生于猫[6-7]。犬弓首蛔虫可引起肠道黏膜卡他性炎症,出血或溃疡，可能部分或完全阻塞肠道，个别会出现肠穿孔、腹膜炎或胆管阻塞、化脓、破裂、肝脏黄染、变硬等[8-9]。寄生于小肠的成虫可引起大肚皮,导致发育迟缓、被毛粗乱、精神沉郁、消瘦，并偶见拉稀[8-9]。为了有效控制这种人兽共患寄生虫病，对寄生虫进行准确的分类是科学研究的基础，该实验运用分子生物学技术，利用线粒体DNA片段对生物进行分类和种系发育关系的研究。线粒体DNA作为一种核外遗传物质，与核DNA相比，具有分子质量小，结构简单，进化速度快，无组织特异性等特点，是研究寄生虫分子分类，群体遗传，系统进化的一种很好的分子标记[10-13]。本研究提取了采自湖南长沙动物园狼肠道内的蛔虫DNA，并扩增和分析了分离株的cox1基因序列。1.1犬弓首蛔虫的生活史犬弓首蛔虫发育阶段包括虫卵、第二期幼虫、第三期幼虫、第四期幼虫、成虫五个阶段。犬弓首蛔虫生活史简单，虫卵在外环境中经一周发育到感染阶段，感染动物或人后在小肠内孵化，然后钻入小肠壁，进入血管，随血液循环分布于全身，在身体各器官中移行，在终末宿主犬和猫等动物体内幼虫可返回肠腔，经60-90天发育成成虫，但有些幼虫潜伏在组织中，经胎盘可感染胎儿[18]。1.2流行病学研究调查流行病学调查表明，弓首蛔虫病呈世界性分布，以热带、亚热带地区流行情况最为严重[2]。据调查，世界各地的犬弓首蛔虫感染率为5.5%-33.6%[6-7]。弓首蛔虫可以通过胎盘传播，因此幼犬或小猫容易感染[18]。据调查显示，人血清中抗弓首蛔虫抗体阳性率在1.6%~37%之间[18]。弓首蛔虫也可以感染人，引起人的幼虫移行症（VLM），人的VLM常见于5岁以下的儿童，表现为发热，肝脏肿大和坏死，脾肿大，有轻微的呼吸道症状，因此是一种非常重要的人兽共患病病原[18]。犬弓首蛔虫内脏幼虫移行症自1952年首次由Beaver提出，该病在世界各国均有发生和报道，日本曾报道了多例由弓首蛔虫幼虫所导致的视网膜神经胶质瘤病例[19]。据资料介绍，在伦敦，10岁以上的人中弓首蛔虫皮试阳性率为2%，在非洲各城市则高达30%以上[10-19]；血清学调查证实，在美国外观健康的人群中约有2%-3%受过弓首蛔虫的感染[19-23]。1.3研究目的和意义犬弓首蛔虫呈世界性分布,尤其是可以人兽共患，已经引起了世界的关注。狼，作为珍惜保护动物，具有极大的经济和研究价值，寄生虫对其危害巨大。同时，现在养猫养狗已经随处可见，人避免不了的要和它们进行接触，使人感染弓首蛔虫的几率大大的增加，因此对寄生虫的深入研究迫在眉睫，同时此研究也具有一定的学术价值。本研究从湖南动物园狼体内采集的蛔虫为研究对象，对线粒体pcox1序列进行分子生物学水平的分析，分析成果在一定程度上丰富弓首蛔虫的研究内容。为今后狼蛔虫的分类，鉴别诊断，分子流行病学调查奠定基础，同时对野生动物蛔虫病的防治和研究也有着重要的意义。2材料与方法2.1虫体样品从长沙动物园狼体内采集的狼蛔虫，用灭菌生理盐水清洗6次，每次5分钟，并保存于70%的酒精中备用。2.2.主要试剂与实验仪器PCR试剂、DNA提取试剂盒（TIANGEN公司），引物（湖南擎科生物有限公司）。微眼型科手术剪刀、镊子、凝胶电泳仪、高分辨率凝胶成像系统、锥形瓶（250ml）、量筒、玻璃培养皿、微量可调加样器、超净工作台、TGL-16G高速台式离心机、涡旋混匀器、眼科镊、PCR基因扩增仪、电热恒温水浴锅、微波炉、4℃/-20℃冰箱、UV透射仪。2.3样品基因组DNA的制备2.3.1虫体裂解加入100ul的LB2溶液和20ul的蛋白酶K至装有虫体的EP管中，混合均匀后置于56℃水浴锅消化1~2h（每30min进行颠倒混匀），使虫体消化完全，悬浮液中无明显大块不溶物。2.3.2虫体DNA的提取向消化后的虫体混合液中加入200μL的GBBuffer，震荡，于70℃条件下放置10分钟，离心；加（3）取一新的吸附柱，将液体转移至其中，12000rmp离心30秒，将离心得到的液体倒入废液缸；（4）加入缓冲液GD，体积为500μL，在12000rmp条件下离心30秒，将收集管中液体倒入废液缸；（5）加入漂洗液PW，体积为600μL，在12000rmp条件下离心30秒，将收集管中废液倒入废液缸；（6）加入漂洗液PW，体积为600μL，在12000rmp条件下离心30秒，将收集管中废液倒入废液缸；（7）再次12000rmp离心2分钟，将收集管中的液体倒入废液缸；（8）在常温下风干吸附柱；（9）把吸附柱取出放进一新的离心管内，滴加50~200μL洗脱缓冲液TE；在12000（~13400）rmp条件下离心2分钟后所得液体即为抽提出的DNA，放置在-20℃冰箱中保存备用。3扩增引物与PCR扩增扩增引物如下:上游引物:JB3’JJJJJJGGGCATCCTGAGGTTTAT下游引物:JB4.5’TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG进行狼蛔虫cox1基因序列扩增。采用25ul扩增体系，双蒸水9.5ul，Extap酶12.5ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul模板DNA2ul，见表1。反应条件见表2。表1PCR扩增体系Tab.1ThesystemofPCR组分体积PremixTaqTM12.5μlJB3(100pmol/μL)0.5μlJB4.5(100pmol/μL)0.5μlDNA模板2.0μldddH2O9.5μl注：PremixTaqTM中含有Taq酶，MgCl2，dNTP，Buffer表2PCR扩增条件Tab.2TheconditionofPCR条件时间/循环数94℃预变性5min94℃变性30s50℃退火30s72℃延伸30s循环38次72℃再延伸5min41%琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖粉末0.25g和缓冲液25ml一起倒入锥形瓶中。放入微波炉中加热一分钟，当琼脂糖完全溶解时，将其取出，触摸瓶壁感觉不烫手时，加入1μl溴化乙锭（EB）（溴化乙锭有高危险性有致癌作用，使用时避免和皮肤直接接触）,摇匀，倒入胶板冷却至凝固。第一孔中点入5μlMarker，其后的点样孔分别取5μl样品点入。恒定电压下电泳30min。电泳后的凝胶置于紫外透射检测仪中观察并拍照，将出现DNA条带的PCR样品送去测序。5cox1序列分析与进化树的构建用DNAStart（V.5.0）软件对测序结果进行分析。测序所得序列先与NCBI中收录的基因序列进行BLAST相似性对比[6],鉴定所获虫株为犬弓首蛔虫。将分离株序列与GenBank收录其他种属的蛔虫进行相似性比对。利用ClustalX2.0及Mega5.0软件对所获得的犬弓首蛔虫序列进行同源性分析比对和遗传距离计算，并与犬弓首蛔虫（Toxocaracanis，AJ920053.1），狮弓蛔虫（Toxascarisleonina,731-1159），人蛔虫（Ascarislumbricoides,MF358935.1），猪蛔虫（Ascarissuum,HQ704901.1），马来西亚弓首蛔虫（Toxocaramalaysiensis、AJ920058.1），猫弓首蛔虫（Toxocaracati,AJ920057.1），马副蛔虫（Parascariaunivalens,KM067271.1）进行相似性对比和种系发育分析，并用邻接法绘制种系发育树。6扩增结果与分析样品PCR扩增结果，扩增出450bp左右的片段，与预期犬弓首蛔虫cox1的片段大小相符，空白对照为阴性且无特异性条带。6.1测序结果及序列同源性分析所测的虫体样本的cox1序列长度差不多。pcox1相似性高达99.9%，种内差异则很低，为0.1%，与犬弓首蛔虫Toxocaracanis（GenBank登录号：AJ920053.1）的序列相似性最高，为99.1%。因此可确定狼体内的蛔虫为犬弓首蛔虫。与GenBank中收录的其他蛔虫：狮弓蛔虫（Toxascarisleonina,731-1159）、猫弓首蛔虫（Toxocaracati,AJ920057.1）、人蛔虫（Ascarislumbricoides,MF358935.1）、马副蛔虫（Parascariaunivalens,KM067271.1）、马来西亚弓首蛔虫（Toxocaramalaysiensis、AJ920058.1）、猪蛔虫（Ascarissuum,HQ704901.1）进行种间比较，分析结果显示，犬弓首蛔虫pcox1存在一定的种内遗传差异，见图3。图3狼蛔虫与其他蛔虫cox1相似性序列对比Fig3Thecox1sequencesimilaritycomparisonamongWolfroundwormandotherroundworms6.2cox1基因序列系统进化树分析用MEGA5.0，采用NJ（Neighbor-joiningmethod,邻接法）法构建系统发育树，见图4。2个分离株位于同一分支上有高度同源性，与GenBank上收录的国内犬弓首蛔虫Toxocaracanis（AJ920053.1）在相同分支上，且与GenBank上所收录的弓首蛔虫属分支较近，表明cox1基因在研究弓首蛔虫进化关系时，相对保守；两个分离株和其他马副蛔虫，猪蛔虫等所属分支较远。进一步表明，所采集的狼体内蛔虫为犬弓首蛔虫，且种内差异明显低于种间差异，线粒体cox1基因可以作为犬弓首蛔虫的分离鉴定的依据，得到了很好的鉴别。图4基于cox1基因序列所构成的系统发育树Fig4Phylogenetictreebasedoncox1genesequence7讨论犬弓首蛔虫主要寄生在犬、猫等动物体内，也可寄生在狼、狐等犬科动物体内，甚至会传染给人。在体内引起幼虫移行症。具有感染性的虫卵到处传播，易引起大范围的感染，对人和动物均有较大危害。因此，对犬弓首蛔虫的相关研究，对人和动物疾病的诊断和防控有着重要的作用，且有着一定的学术研究价值。尤其是对防治人兽共患寄生虫病具有重要意义。但目前已有报道的内容很少发现和狼有关的寄生虫的报道。狼属于珍惜濒危动物，具有重要的经济和观赏价值。因此，从分子生物学水平上对狼体内寄生虫的研究非常重要。本项研究采集了湖南长沙动物园狼体内蛔虫的DNA,才用常规的序列分析方法对其pcox1基因序列进行了研究分析。电泳结果显示，扩增出的pcox1长度均为450bp。进过分析得知它们的pcox1相似性高达99.9%，种内差异为0.1%。2个分离株在系统进化树的分支相同，且与GenBank上收录的其他弓首蛔虫所属分支距离相近，与其他属蛔虫所属分支距离较远。可以认为，此次试验获得的分离株虫体为犬弓首蛔虫，证明cox1序列有较大的种间变异性，可在种内具有保守性，可以用作寄生虫种间与种内遗传变异的分子标记，丰富了对狼蛔虫的分子生物学水平的研究，并为犬弓首蛔虫的分类鉴定、分子流行病学调查和遗传变异研究奠定了基础。参考文献[1]盛中华.五种野生动物蛔虫核糖体及线粒体DNA多态性的研究[C].吉林农业大学,2012.[2]邱启官,李庆,许英蕾.两种野生动物蛔虫线粒体cox1基因序列差异性研究[J].中国兽医杂志,2018,54(08):43-46.[3]梁轩.益阳市犬弓首蛔虫感染情况调查及ITS、cox1基因的多态性分析[D].湖南农业大学,2015.[4]繁萍,杨卫霞,仁措卓玛等.犬弓首蛔虫卵卵壳裂解方法研究[J].安徽农业科学,2015,43(22):103-105.[5]李明伟,林瑞庆,邹丰才等.弓首蛔虫线粒体cox1基因的多态性研究[J].中国兽医科技,2005(05):386-390.[6]李明伟.犬和猫弓首蛔虫线粒体cox1基因多态性研究[A].中国畜牧兽医学会.中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集（下册）[C].中国畜牧兽医学会:,2004:5.[7]李明伟,朱兴全,曹湛等.寄生于猫的马来西亚弓首蛔虫在我国的发现[J].中国人兽共患病学报,2006(06):530-532[8]

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