白介素-6免疫测定试剂盒操作规程详解

白介素-6免疫测定试剂盒操作规程详解一、前言白介素-6（IL-6）作为多功能细胞因子，在炎症反应、免疫调节及疾病进程中发挥核心作用，其水平异常与感染、自身免疫病、肿瘤等密切相关。白介素-6免疫测定试剂盒（多基于酶联免疫吸附原理）通过抗原-抗体特异性结合定量检测样本中IL-6浓度，为临床诊断、病情监测提供关键依据。规范的操作流程是保障检测准确性的核心前提，本文结合临床实践与通用要求，对操作全流程进行深度解析。二、试剂准备与管理（一）试剂盒组成（以典型ELISA试剂盒为例）包含包被IL-6单克隆抗体的固相反应板（酶标板）、IL-6标准品（含梯度浓度）、酶标记IL-6多克隆抗体（酶标试剂）、浓缩洗涤液、底物显色液（如TMB）、终止液（如稀硫酸），部分试剂盒含样本稀释液、封板膜等。（二）储存与平衡试剂盒需严格按说明书要求储存（通常2~8℃避光），避免冷冻或高温。实验前将所有试剂（除复溶后标准品）室温（20~25℃）平衡30分钟，减少温度差异对反应的影响。（三）试剂检查与处理外观检查：酶标板孔底洁净无杂质，标准品、酶标试剂无浑浊/沉淀，显色底物无色（TMB类若呈深蓝则失效）。洗涤液配制：浓缩洗涤液按比例（如1:25）用蒸馏水稀释，充分混匀后备用。标准品复溶：用指定稀释液复溶标准品，轻柔涡旋助溶，复溶后短暂离心（3×10³rpm，1分钟），避免泡沫，复溶后2~8℃可保存24小时。三、样本采集与处理（一）样本类型与采集临床常用血清或EDTA抗凝血浆（避免肝素抗凝，或干扰免疫反应）。血清样本采集后室温静置30~60分钟待凝固，3×10³rpm离心10分钟分离；血浆样本采集后立即颠倒混匀抗凝剂，同速离心分离。（二）样本质量控制避免溶血（血红蛋白非特异性吸附干扰）、脂血（高脂样本需高速离心/脱脂处理）、细菌污染。浑浊/沉淀样本需再次离心（1.2×10⁴rpm，5分钟）取上清。（三）样本保存与稀释新鲜样本4小时内检测；短期（≤24小时）4℃保存，长期-20℃/-80℃冻存，冻融≤3次。预期浓度过高（超标准品范围）时，用样本稀释液按比例（如1:2、1:5）稀释，记录倍数用于结果计算。四、实验操作流程（一）实验前准备环境与仪器：实验室温度20~25℃、湿度40%~60%，避光。酶标仪提前预热30分钟，校准波长（检测波长450nm、参考波长630nm）；移液器定期校准，枪头无酶/热源。试剂与耗材：酶标板按需拆封（剩余板条密封后2~8℃保存），避免受潮/污染。（二）加样与孵育1.标准品梯度稀释：按说明书制备梯度（如0、5、10、20、40pg/ml），采用“倍比稀释法”，轻柔吹打混匀，避免气泡。2.样本与标准品加样：每孔加标准品/样本50μl（或说明书体积），枪头垂直悬空，避免触碰孔壁/底。复孔需保证体积一致。3.加酶标试剂：每孔加酶标试剂50μl（或指定体积），封板后37℃孵育60分钟（依说明书，不可随意调整时间）。（三）洗涤步骤孵育结束后弃去孔内液体，每孔加稀释后洗涤液300μl，静置30秒后弃去，重复洗涤5次（依说明书）。最后一次洗涤后倒扣酶标板，拍干孔内残留液体（避免影响后续反应）。（四）显色与终止1.加底物显色：每孔加底物显色液100μl（TMB类需避光），封板后37℃避光孵育15分钟（观察显色梯度，避免过度）。2.加终止液：每孔加终止液50μl（如稀硫酸），加样顺序与底物一致，终止反应（显色液从蓝变黄，若仍为蓝色需检查试剂/时间）。（五）结果读取加终止液后15分钟内，以空白孔（加稀释液、酶标试剂、底物、终止液）为参比，在450nm波长下读取吸光度（OD值），参考波长630nm校正孔间差异。五、质量控制要点（一）标准曲线质量以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标，采用四参数逻辑拟合（或线性拟合）绘制曲线，要求相关系数R²≥0.99，斜率、截距符合说明书范围。R²＜0.99时需重新实验。（二）室内质控同步检测定值质控品（高、中、低浓度），结果需在靶值±2SD范围内。失控时分析原因（试剂失效、操作误差、仪器故障），排除后重测。（三）重复性验证同一浓度标准品/样本的复孔OD值变异系数（CV）≤10%（依说明书），CV＞10%时检查加样准确性、洗涤效果或孵育一致性。六、注意事项与常见问题处理（一）试剂相关酶标试剂避免长时间室温暴露，使用后立即冷藏；底物显色液避光保存/操作，显色异常时检查孵育时间、试剂浓度或样本浓度。（二）操作相关加样枪头更换，避免交叉污染；洗涤时确保液体完全弃去，拍干力度适中；孵育温度稳定（±0.5℃），使用恒温箱/水浴锅，避免温度波动。（三）样本相关溶血/脂血样本预处理（重新采集、脱脂离心）；冻存样本复融后充分混匀；浓度超范围时重新稀释，结果乘以稀释倍数。（四）安全防护佩戴手套、口罩，生物安全柜内操作，避免接触终止液（强腐蚀），废弃物按医疗废物处理。七、结果解读与报告（一）浓度计算根据标准曲线方程（或酶标仪程序）计算浓度，稀释样本需乘以稀释倍数。（二）参考范围与临床意义不同试剂盒、人群（健康人、儿童、孕妇）参考范围差异（健康人血清IL-6多＜10pg/ml）。结果需结合临床：感染、自身免疫病活动期、肿瘤等常伴IL-6升高。（三）异常结果处理结果与临床不符时，复查样本（排除操作/污染），必要时换试剂盒/方法验证。结语白介素-6免疫测定的准确性依赖规范操作