两种制备慢性阻塞性肺病大鼠模型方法的比较

两种制备慢性阻塞性肺病大鼠模型方法的比较摘要：目的探讨一种接近临床慢性阻塞性肺病表现的大鼠模型的制备方法。方法30只SD大鼠随机分为3组，每组10只。=1\*ROMANI组大鼠制备慢性阻塞性肺病模型，用香烟烟雾暴露+气管内滴注脂多糖处理；=2\*ROMANII组大鼠制备慢性阻塞性肺病模型，用香烟烟雾暴露+气管内滴注生理盐水处理；=3\*ROMANIII组大鼠为正常对照组，不做任何处理。3组大鼠分别采集呼吸曲线参数、检测动脉血氧分压、动脉血二氧化碳分压及肺组织含水量，光镜下观察病理形态学改变，透射电镜观察肺组织细胞超微结构。对3组大鼠上述指标对比分析。结果Ⅰ组吸气持续时间低于Ⅱ组、Ⅱ组低于=3\*ROMANIII组，Ⅰ组呼气持续时间高于Ⅱ组、Ⅱ组高于与Ⅲ组；Ⅰ组大鼠动脉血氧分压低于Ⅱ组、Ⅱ组低于Ⅲ组，Ⅰ组大鼠动脉血二氧化碳分压高于Ⅱ组、Ⅱ组高于Ⅲ组；Ⅰ组肺组织含水量高于Ⅱ组、Ⅱ组高于Ⅲ组。上述结果统计学分析后p<0.05具有统计学意义。形态学上Ⅰ组大鼠肺组织呈现慢性炎性损伤的表现，肺泡上皮细胞结构明显破坏。结论香烟烟雾暴露+气管内滴注脂多糖处理的大鼠可以作为一种慢性阻塞性肺病动物模型，这种造模方法是一种可行可靠的慢阻肺动物模型复制方法。关键词：慢性阻塞性肺病；大鼠；香烟烟雾暴露；内毒素；动物模型分类号：R363.2ComparisonbetweentwomethodsforestablishingratmodelsofCOPDLIUYou-cai,SHIShi-qiang,LIXiao-nan,YANWei-zhen,YAOLi-zhi(ExperimentalTeachingCenterofBiologyandBasicMedicine,SanquanCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453000)Abstract:ObjectiveToexploreamethodtoestablisharatmodelwithclinicalmanifestationsofchronicobstructivepulmonarydisease(COPD).Methods30ratsweredividedinto3groupsrandomly,eachwith10rats.GroupIwastheexaminationgroup,preparedforCOPDmodelsandtreatedwithcigarettesmokeexposureplusintratrachealinstillationoflipopolysaccharide(LPS);GroupIIwasthecontrolgroup,establishedforCOPDmodelsbuttreatedwithcigarettesmokeexposureplusintratrachealinstillationofphysiologicalsaline;andGroupIIIwastheblankcontrolgroupwithoutanytreatment.Respiratorycurveparameterswerecollectedinthesesthreegroups,arterialbloodoxygenpartialpressure,arterialcarbondioxidepartialpressureandlungtissuewatercontentweremeasured,pathologicalchangeswereobservedunderlightmicroscope,andtheultrastructureoflungtissuecellswasobservedundertransmissionelectronmicroscope.ResultsThedurationofinhalationinGroupIwaslowerthanthatinGroupII,whichwaslowerthanthatinGroupIII,whilethedurationofexpirationinGroupIwashigherthanthatinGroupII,whichwashigherthanthatinGroupIII;thepartialpressureofarterialbloodoxygeninGroupIwaslowerthanthatinGroupII,whichwaslowerthanthatinGroupIII,whilethepartialpressureofarterialbloodcarbondioxideinGroupⅠwashigherthanthatingroupII,whichwashigherthanthatinGroupIII;andthewatercontentofthelungtissueinGroupIwashigherthanthatinGroupII,whichwashigherthanthatingroupIII.Statisticalanalysisshowedaboveresultswerestatisticallysignificantwithp<0.05.Morphologically,thelungtissueofratsinGroupImanifestedchronicinflammatoryinjury,andthestructureofalveolarepithelialcellswassignificantlydestroyed.ConclusionsRatstreatedwithcigarettesmokeexposureandintratrachealinfusionofLPScanbeusedasananimalmodelofCOPD.Keywords:chronicobstructivepulmonarydisease(COPD);rats;cigarettesmokeexposure;lipopolysaccharide(LPS);animalmodel香烟烟雾、慢性炎性刺激是引起慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)发生发展的主要因素[1,2]，以动物模型为研究对象，探讨COPD的发生发展过程及相关肺功能的变化，是COPD防治的基础环节。本文对两种方法制备的COPD模型[3]大鼠的呼吸曲线参数、动脉血氧分压（arterialpartialpressureofoxygen，PaO2）、动脉血二氧化碳分压（arterialpartialpressureofcarbondioxide，PaCO2）、肺组织含水量、形态学改变及超微结构进行对比，为科研人员选择COPD模型大鼠制备方法提供参考依据。1材料与方法1.1材料BL-420F生物信号采集分析系统（成都泰盟生物仪器有限公司）；I-HITACHIH600透射电镜(日本日立公司)。散花牌过滤嘴香烟（河南中烟工业有限公司），每支含焦油量13mg、尼古丁1.0mg、一氧化碳量14mg。1.2动物分组30只CV(conventional，CV)级健康SD(sprague-dawley，SD)大鼠，体质量(150±10)g，由郑州大学实验动物中心提供。将30只大鼠随机分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，每组10只。1.3实验方法将Ⅰ组大鼠每天置于60cm×40cm×30cm的烟雾暴露箱箱内烟雾暴露2次，每次使用10支香烟，每次30min，持续暴露28天。1天、14天以1mg.Kg-1剂量气管内滴注脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）；Ⅱ组大鼠在第1天、第14天气管内滴注等量的生理盐水，其余操作同=1\*ROMANI组；Ⅲ组大鼠不经烟雾暴露处理、脂多糖处理和生理盐水处理，其余操作同Ⅰ组。29d4%水合氯醛以10ml•Kg-1腹腔注射麻醉，颈部手术行动脉套管插管术，剑突下1cm切口暴露膈肌，两个针式电极挂于膈肌两侧，观察记录实验动物呼吸运动及一般情况的变化，经BL-420F系统记录呼吸曲线30min。注射器取动脉血2ml，备测动脉血氧分压（arterialpartialpressureofoxygen，PaO2）、动脉血二氧化碳分压（arterialpartialpressureofcarbondioxide,PaCO2）。尾静脉空气栓塞法处死大鼠，完整取肺后剪开左右两肺。滤纸吸干左肺表面的血液和水分称其湿重，后将其置于80℃真空干燥箱内48h，充分干燥至恒温后用天平称重，备测左肺组织湿重/干重比值及肺组织含水量。取右肺下叶2份，一份10%中性甲醛固定并修剪为1cm3大小组织块、石蜡包埋、切片、HE染色、光镜下观察肺组织结构，一份4%戊二醛固定液固定并修剪为1mm3大小组织块，切为超薄片，柠檬酸铅和醋酸铀双重染色，备透射电子显微镜观察肺组织细胞超微结构，拍摄照片分析图像。1.4统计学方法所有数据均带入SPSS19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验进行检验；计数资料采用x2检验进行分析。检验水准a=0.05。2结果2.1大鼠呼吸曲线参数的比较对3组大鼠呼吸曲线参数的比较可知：吸气持续时间，Ⅰ组低于Ⅱ组（t=11.053，p=0.000）与Ⅲ组（t=9.814，p=0.000），Ⅱ组低于Ⅲ组（t=12.335，p=0.001）；呼气持续时间，Ⅰ组高于Ⅱ组（t=10.352，p=0.000）、高于Ⅲ组（t=7.621，p=0.000），Ⅱ组高于与Ⅲ组（t=7.513，p=0.000）。见表1。表13组大鼠呼吸曲线参数比较（n=10，±s）组别n吸气持续时间(ms)呼气持续时间(ms)Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组101010293±21326±19347±22514±31461±28415±172.2大鼠PaO2和PaCO2比较大鼠PaO2，Ⅰ组低于Ⅱ组（t=12.163，p=0.000）、低于Ⅲ组（t=15.219，p=0.000），Ⅱ组低于Ⅲ组（t=11.702，p=0.000）；大鼠PaCO2，Ⅰ组高于Ⅱ组（t=11.435，p=0.000）、高于Ⅲ组（t=9.363，p=0.000），Ⅱ组高于Ⅲ组（t=14.352，p=0.001）。见表2。表23组大鼠PaO2及PaCO2的比较（n=10,±s）组别PaO2(mmHg)PaCO2(mmHg)Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组61.45±7.2872.59±10.2684.37±9.5557.39±7.2849.47±9.3545.22±8.522.3大鼠肺组织含水量比较肺组织W/D=组织湿重/干重，肺组织含水量=[（湿重-干重）／湿重]×100%，计算各组大鼠肺组织W/D值及含水量。肺组织W/D值，Ⅰ组高于Ⅱ组（t=13.061，p=0.000）、高于Ⅲ组（t=8.513，p=0.000），Ⅱ组高于Ⅲ组（t=11.381，p=0.001）；肺组织含水量，Ⅰ组高于Ⅱ组（t=14.372，p=0.001）、高于Ⅲ组（t=10.254，p=0.000），Ⅱ组高于Ⅲ组（t=9.261，p=0.001）。见表3。表33组大鼠肺组织W/D值比较（n=10，±s）组别肺组织W/D值肺组织含水量Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组5.24±0.415.16±0.294.73±0.2283.24±2.5280.14±2.3775.46±1.222.4大鼠一般状态比较Ⅰ组大鼠进食减少，反应迟缓，体重减少，皮毛稀疏黄涩无光泽；活动量从8天开始减少，21天后活动基本消失；呼吸道分泌物从8天出现并逐渐增加，21天表现出流涎、喘息。Ⅱ组大鼠上述状态较Ⅰ组大鼠轻，在13天出现的呼吸道分泌物和流涎且逐渐增多，28天表现出流涎、喘息。Ⅲ组大鼠上述状态未曾出现。2.5大鼠肺组织大体观比较Ⅰ组大鼠肺体积增大，边缘圆钝，部分纹理消失，颜色灰白或褐色，压痕不易消褪。Ⅱ组大鼠肺体积增大，边缘圆钝，部分肺纹理减少、颜色灰白或褐色，压痕不易消褪。Ⅲ组大鼠肺组织纹理清晰，颜色粉红，压痕可迅速消褪。2.6大鼠肺组织HE染色结果比较Ⅰ组大鼠细支气管管腔狭窄，管壁增厚，粘液腺增生，白细胞浸润，上皮细胞变性坏死，肺泡间隔断裂，肺泡腔扩大，出现肺大泡。Ⅱ组大鼠肺组织病理学改变同实验组大鼠，但程度较轻，未出现肺大泡、气管管腔狭窄程度较轻、管壁增厚程度较轻。Ⅲ组大鼠支气管、肺组织结构正常。见图1。50μm50μm50μmⅢ组.Ⅱ组Ⅰ组50μm50μm50μmⅢ组.Ⅱ组Ⅰ组图13组大鼠右肺下叶组织HE染色结果（HE，×400）2.7大鼠肺组织超微结构比较Ⅰ组大鼠组肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞内质网扩张、线粒体及微绒毛消失。Ⅱ组大鼠组肺泡Ⅱ型上皮细胞内质网扩张，线粒体肿胀板层体空泡化，微绒毛消失。Ⅲ组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细板层小体结构清晰，微绒毛排列整齐，结构完整，数量多，内质网结构正常，线粒体结构正常。见图2。Ⅲ组Ⅱ组Ⅰ组Ⅲ组Ⅱ组Ⅰ组图2三组大鼠右肺下叶组织透射电镜超微结构（TEM，×7000）3讨论COPD动物模型是COPD基础研究的必要条件，一个符合临床实际的COPD动物模型的标准包括四点，即致伤因素与临床COPD常见诱因基本一致[5]，有气流阻塞存在、小气道阻力增高、肺动态顺应性下降，存在气道重塑及伴有气道反应性增高[6,7]。吸烟和反复呼吸道感染是人类COPD发生、发展及演变过程中的主要诱因[8,9]。在本研究采用香烟烟雾暴露、香烟烟雾暴露+内毒素气管滴注两种方法模拟吸烟、吸烟并感染的COPD危险因素，做为复制实验组动物模型的方法。结果表明香烟烟雾暴露+内毒素气管滴注的大鼠的呼气持续时间、吸气持续时间高于烟雾暴露大鼠和正常大鼠，烟雾暴露大鼠上述呼吸参数均高于正常大鼠，提示经气管滴注内毒素且烟雾暴露后的大鼠出现了气道狭窄、气流受限所致的通气障碍并且较单纯香烟烟雾暴露的大鼠通气障碍显著。PaO2可以反映肺通气功能，PaCO2可以反映肺换气功能。结果中，香烟烟雾暴露+内毒素气管滴注的大鼠的PaO2较烟雾暴露大鼠和正常大鼠低、烟雾暴露大鼠较正常大鼠低，香烟烟雾暴露+内毒素气管滴注的大鼠的PaCO2较烟雾暴露大鼠和正常大鼠高、烟雾暴露大鼠较正常大鼠高，提示香烟烟雾暴露+内毒素气管滴注大鼠和烟雾暴露大鼠的肺通气功能和肺换气功能均减退，不仅有气道狭窄气流受限通气障碍，还出现了呼吸膜受损血气交换障碍，而且香烟烟雾暴露+内毒素大鼠的上述结果更显著。此现象与临床中重度COPD患者的吸气、呼气均困难的临床表现一致。在对3组大鼠肺组织形态学的比较可知，香烟烟雾暴露+内毒素大鼠和烟雾暴露大鼠呈现典型的COPD慢性炎症损伤的病理表现，且香烟烟雾暴露+内毒素大鼠损伤程度较重；在超微结构的比较中可知，香烟烟雾暴露+内毒素大鼠和烟雾暴露大鼠肺泡上皮结构破坏、细胞器结构损毁，烟雾暴露大鼠肺泡上皮超微结构[10]破坏较为轻微，这些从形态学上证实了香烟烟雾暴露+内毒素大鼠肺存在炎性损伤。总之，本研究验以香烟烟雾暴露+内毒素气管滴注模拟临床COPD患者的吸烟和炎症感染的危险因素，在实验结果中从呼吸功能、血气指标和形态学上证实香烟烟雾暴露+气管滴注内毒素处理的大鼠出现了典型的COPD肺病理改变、肺通气功能和肺换气功能，表现出气道狭窄气流受限的通气障碍，明确了香烟烟雾暴露+气管滴注内毒素造模方法是一种可行可靠COPD造模方法。参考文献：[1]华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组．慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)[J].中华结核和呼吸杂志,2013,36(4):255-265.[2]ArnsonY,ShoenfeldY,AmitalH.Effectsoftobaccosmokeonimmunity,inflammationandautoimmunity.[J].JournalofAutoimmunity,2010,34(3):J258-J265.[3]ChenX,LiY,HuaC,etal.Establishmentofrapidriskassessmentmodelforcigarettesmokeextractexposureinchronicobstructivepulmonarydisease[J].ToxicologyLetters,2019,316:10-19.[4]TangYM,LiuXN,ZhangQJ,etal.Chronicobstructivepulmonarydiseasedeaths,disability-adjustedlifeyears,andriskfactorsinHubeiprovinceofmid-China,1990–2015:theGlobalBurdenofDiseaseStudy2015[J].PublicHealth,2018,161:12-19.[5]张莉,李金田,刘永琦,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型病变特点的研究[J].四川动物,2010(02):131-133.[6]WrightJL,CosioM