WB实验详细操作步骤及注意事项

WB实验详细操作步骤及注意事项蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）是分子生物学与细胞生物学研究中检测特定蛋白表达、修饰的核心技术。其原理基于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的蛋白分离、转膜后的抗原-抗体特异性结合，最终通过化学发光或显色反应可视化目标蛋白。以下从样本制备到结果分析，详述WB实验的关键操作与实操要点。一、样本制备：从组织/细胞到蛋白提取物（一）组织/细胞样本处理组织样本：新鲜组织离体后，立即用预冷的PBS冲洗残留血液，液氮速冻（<5min）后转移至-80℃保存（延缓蛋白降解）。提取时，按“组织重量:裂解液体积=1:10~1:20”的比例，加入含蛋白酶抑制剂（如1mMPMSF、蛋白酶抑制剂鸡尾酒）和磷酸酶抑制剂（如Na₃VO₄、NaF，研究磷酸化蛋白时需加）的RIPA或NP-40裂解液，冰上匀浆（手动或电动匀浆器）或超声破碎（功率200~300W，每次5s，间隔10s，重复5~10次）。4℃、____rpm离心15min，取上清（总蛋白提取物），-80℃分装保存（避免反复冻融）。细胞样本：贴壁细胞弃培养基后，预冷PBS洗2次，加裂解液（同组织）后冰上裂解15~30min（期间轻摇培养皿），后续处理同组织样本；悬浮细胞直接离心（3000rpm、5min）收集，PBS洗后加裂解液处理。（二）蛋白浓度定量（以BCA法为例）1.标准品配制：用PBS稀释BSA至0、25、50、100、200μg/ml（根据预期蛋白浓度调整范围）。2.加样与反应：96孔板中每孔加20μl标准品或样品，随后加200μlBCA工作液（A液:B液=50:1，现配现用），37℃孵育30min。3.检测与计算：酶标仪测562nm吸光度，以标准品浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，代入样品吸光度计算浓度。注意：样品需稀释至标准曲线线性范围内（如吸光度<2.0）；加样时枪头避免挂壁，保证体积准确；BCA工作液需充分混匀，避免局部浓度不均。二、SDS-PAGE电泳：蛋白的“分子筛”分离（一）凝胶制备（以垂直板胶为例）1.分离胶（如10%，分子量30~200kD蛋白适用）按比例混合：分离胶缓冲液（Tris-HCl，pH8.8）3.9ml、acrylamide（30%）3.3ml、水4.8ml、10%APS100μl、TEMED10μl。快速混匀后，沿玻璃板间隙缓慢灌胶（预留积层胶空间，约距梳子齿1cm），立即加无水乙醇封层（促进胶面平整），室温静置30min至胶凝固（胶与乙醇分层，胶面透明）。2.积层胶（5%）倒去乙醇，滤纸吸干残留液体，按比例混合：积层胶缓冲液（Tris-HCl，pH6.8）0.5ml、acrylamide0.33ml、水2.17ml、10%APS50μl、TEMED5μl。混匀后灌胶至玻璃板顶部，插入梳子（避免气泡），室温静置30min待胶凝固。注意：acrylamide具神经毒性，操作时戴手套、口罩，通风橱内操作；APS现配现用（4℃保存不超过1周），TEMED易挥发，需密封避光保存。（二）上样与电泳1.样品处理：根据蛋白浓度，取适量样品与5×上样缓冲液（含β-巯基乙醇，还原蛋白二硫键）按4:1体积比混合，100℃煮5~10min（或70℃10min，磷酸化蛋白可缩短时间），瞬时离心后备用。2.上样：小心拔出梳子，用1×电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液）冲洗加样孔（去除残留胶块）。按预定上样量（20~50μg）加样，空白孔加等量上样缓冲液（维持电场均匀）。3.电泳：接通电源，积层胶阶段（溴酚蓝在积层胶中）用低电压（50~80V），待溴酚蓝进入分离胶后，调至高电压（100~120V），电泳至溴酚蓝到达胶底部（约1~2h）。注意：上样时避免样品溢出或产生气泡；电泳过程中胶板若发热（尤其是高电压时），可冰浴降温（防止蛋白降解、电泳不均）；不同分子量蛋白需调整胶浓度（如30kD以下用15%胶，200kD以上用5%~8%胶）。三、转膜：蛋白从胶到膜的“转移”（一）膜的选择与预处理PVDF膜：结合力强，需用甲醇预激活（浸泡30s，激活疏水基团），立即转移至预冷的转膜缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液+20%甲醇）中平衡10min。NC膜：结合力稍弱，可直接用转膜缓冲液平衡10min。（二）转膜装置组装在预冷的转膜缓冲液浸湿的海绵上，按“滤纸（厚）-胶-膜-滤纸（厚）”顺序组装，确保胶与膜完全贴合（用玻璃棒滚动排除气泡，气泡会导致局部转膜失败）。膜的蛋白面（与胶接触的一面）需标记（如用笔轻划一角）。（三）转膜条件恒压转膜：200mA，30~60min（小分子蛋白30min，大分子如>200kD可延长至90min或4℃、100V过夜）。恒流转膜：0.8mA/cm²膜面积（如8×10cm膜，电流64mA）。注意：转膜产热明显，需冰浴（转膜槽置于冰盒上）；转膜缓冲液需预冷，且含甲醇（维持蛋白疏水性，防止蛋白在胶中扩散）；转膜后可丽春红染色（或直接孵育内参抗体）验证转膜效果（条带清晰、无空白区域为成功）。四、封闭与抗体孵育：抗原-抗体的“特异性结合”（一）封闭将转膜后的膜放入封闭液（5%脱脂牛奶或BSA，磷酸化蛋白用BSA，避免牛奶中内源性蛋白干扰）中，室温摇床封闭1~2h，或4℃封闭过夜（更充分）。封闭液需完全覆盖膜，摇床转速适中（避免膜漂浮或摩擦损伤）。（二）一抗孵育用含0.1%Tween-20的封闭液（TBST）稀释一抗（按说明书，通常1:500~1:2000），将膜放入一抗溶液中，4℃摇床孵育过夜（或室温2h，抗体亲和力高时可缩短）。注意：一抗现用现配，避免反复冻融；孵育容器密封（防止液体蒸发）；稀有抗体可提高浓度（如1:200）或延长孵育时间（如室温4h），但需梯度验证最佳条件。（三）二抗孵育选择与一抗种属对应的二抗（如兔抗一抗用goatanti-rabbit），TBST稀释（1:5000~1:____），室温摇床孵育1h。孵育后用TBST洗膜3次，每次10min（彻底去除未结合二抗，减少背景）。五、显影与结果分析：蛋白的“可视化”（一）化学发光显影（以ECL为例）1.底物孵育：显影液（A液:B液=1:1，现配现用）平衡至室温，滴加适量于膜的蛋白面，避光孵育1~5min（根据蛋白丰度调整时间）。2.曝光与显影：用滤纸吸干膜上多余液体（勿摩擦），放入曝光盒，依次用X胶片（暗室中，先短时间曝光如10s，显影后若条带弱则延长至30s、1min）或化学发光成像仪（自动曝光，可调整时间）曝光。（二）结果分析用ImageJ等软件定量条带灰度值，需满足：内参（如GAPDH、β-actin）条带清晰、灰度值差异<20%（保证上样量均一）；目标条带与内参条带的比值为相对表达量，需重复实验（n≥3）减少误差。六、关键注意事项总结1.防降解与污染：全程戴手套，样本处理、试剂配制在冰上或4℃进行；蛋白酶/磷酸酶抑制剂现用现加，避免蛋白降解。2.胶与膜的完整性：灌胶时避免气泡，转膜时排除气泡；膜的预处理（PVDF膜甲醇激活）不可省略，否则蛋白结合力弱。3.抗体特异性：一抗需验证种属、交叉反应（如用阴性对照组织）；二抗避免与封闭液蛋白的抗体交叉（如牛奶封闭时，二抗不可为抗牛蛋白抗体）。