巨噬细胞：肝脏肿瘤起始细胞存活与肝癌发生的核心纽带

巨噬细胞：肝脏肿瘤起始细胞存活与肝癌发生的核心纽带一、引言1.1研究背景与意义1.1.1肝癌的现状与危害肝癌作为一种常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类的生命健康，给全球公共卫生带来了沉重负担。据世界卫生组织（WHO）数据显示，2020年全球肝癌新发病例数约为90.5万例，死亡病例数约为83万例，肝癌在全球范围内是第六大常见癌症，也是第四大癌症死亡原因。在中国，肝癌的形势更为严峻，2020年新发病例数约为41.1万例，死亡病例数约为39.1万例，是第三大常见癌症和第二大癌症死亡原因。肝癌具有起病隐匿、恶性程度高、进展迅速等特点，多数患者在确诊时已处于中晚期，失去了手术根治的机会。而且，肝癌对放化疗不敏感，预后较差，5年生存率仅为7%左右。肝癌的高发病率和高死亡率不仅对患者的生命造成巨大威胁，也给患者家庭和社会带来了沉重的经济负担和精神压力。因此，深入研究肝癌的发病机制，寻找有效的防治策略，已成为当前医学领域亟待解决的重要问题。1.1.2巨噬细胞在肿瘤研究中的重要地位巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分，在肿瘤微环境中扮演着关键角色。巨噬细胞具有高度的可塑性和异质性，在不同的微环境信号刺激下，可极化为不同的表型，发挥截然不同的功能。在肿瘤微环境中，巨噬细胞主要分为经典活化的M1型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞具有强大的抗肿瘤活性，能够分泌多种促炎细胞因子和趋化因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等，激活T细胞等免疫细胞，增强机体的抗肿瘤免疫反应；同时，M1型巨噬细胞还可通过直接吞噬和杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长和转移。而M2型巨噬细胞则表现出促进肿瘤生长、转移和免疫抑制的作用。M2型巨噬细胞能够分泌血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子-β（TGF-β）等细胞因子，促进肿瘤血管生成、上皮-间质转化（EMT）和肿瘤细胞的迁移、侵袭；此外，M2型巨噬细胞还可通过分泌免疫抑制因子，如白细胞介素-10（IL-10）等，抑制T细胞等免疫细胞的活性，帮助肿瘤细胞逃避机体的免疫监视。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在肿瘤组织中大量浸润，其表型和功能状态与肿瘤的发生、发展、预后密切相关。因此，深入研究巨噬细胞在肿瘤微环境中的作用机制，对于揭示肿瘤的发病机制、开发新的肿瘤治疗策略具有重要意义。1.1.3研究肝脏肿瘤起始细胞存活的意义肝脏肿瘤起始细胞（hTICs），也被称为肝癌干细胞，是肝癌组织中一小部分具有自我更新、多向分化潜能和高致瘤性的细胞群体。hTICs被认为是肝癌发生、发展、复发和转移的根源。研究表明，hTICs能够抵抗常规的放化疗，在治疗后存活下来并重新启动肿瘤的生长，导致肝癌的复发和转移。因此，深入研究hTICs的存活机制，对于揭示肝癌的发病机制、提高肝癌的早期诊断和治疗水平具有关键意义。了解hTICs的存活机制，有助于发现新的肝癌治疗靶点。通过针对hTICs存活相关的信号通路、分子靶点进行干预，有望开发出更加有效的肝癌治疗药物，从根源上抑制肝癌的发生和发展。研究hTICs的存活机制还可为肝癌的早期诊断提供新的标志物。通过检测hTICs相关标志物的表达水平，能够实现对肝癌的早期预警和诊断，提高肝癌的早期发现率，为患者争取更多的治疗时机。1.2国内外研究现状在肝癌研究领域，巨噬细胞与肝脏肿瘤起始细胞存活以及肝癌发生的关系一直是研究的热点。国内外众多学者从不同角度、运用多种技术手段对此展开了深入研究，取得了一系列有价值的成果。国外方面，一些研究聚焦于巨噬细胞对肝脏肿瘤起始细胞存活的影响机制。有学者发现，肿瘤微环境中的巨噬细胞能够分泌多种细胞因子和生长因子，如肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）等，这些因子可以激活肝脏肿瘤起始细胞中的相关信号通路，如PI3K/Akt、MAPK等，从而促进其存活和增殖。在对小鼠肝癌模型的研究中，通过阻断巨噬细胞分泌的HGF，发现肝脏肿瘤起始细胞的存活数量明显减少，肿瘤的生长也受到了抑制。另有研究表明，巨噬细胞表面的某些受体与肝脏肿瘤起始细胞表面的配体相互作用，也在调控肝脏肿瘤起始细胞存活中发挥关键作用。例如，巨噬细胞表面的CD44受体与肝脏肿瘤起始细胞表面的透明质酸结合后，能够增强肝脏肿瘤起始细胞的抗凋亡能力，促进其存活。在巨噬细胞与肝癌发生关系的研究上，国外也有重要进展。有研究通过单细胞测序技术，对肝癌组织中的巨噬细胞进行了详细的分型和功能分析，发现肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中的特定亚群，如M2型巨噬细胞，在肝癌的发生过程中起到了促进作用。M2型巨噬细胞能够分泌血管内皮生长因子（VEGF），促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞提供充足的营养和氧气，从而推动肝癌的发生和发展。还有研究表明，巨噬细胞可以通过调节肿瘤微环境中的免疫平衡，影响肝癌的发生。巨噬细胞分泌的免疫抑制因子，如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等，能够抑制T细胞、NK细胞等免疫细胞的活性，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，进而促进肝癌的发生。国内的研究在巨噬细胞与肝脏肿瘤起始细胞存活、肝癌发生关系方面也取得了显著成果。有学者利用基因编辑技术，构建了巨噬细胞相关基因敲除的小鼠模型，研究其对肝脏肿瘤起始细胞存活和肝癌发生的影响。结果发现，敲除巨噬细胞中与炎症相关的基因后，肝脏肿瘤起始细胞的存活受到抑制，肝癌的发生率明显降低。这表明巨噬细胞介导的炎症反应在肝脏肿瘤起始细胞存活和肝癌发生中起着重要作用。国内也有研究关注巨噬细胞与肝脏肿瘤起始细胞之间的代谢交互作用。通过代谢组学分析发现，巨噬细胞可以通过调节肿瘤微环境中的代谢产物，如乳酸、脂肪酸等，影响肝脏肿瘤起始细胞的代谢重编程，进而影响其存活和肝癌的发生。然而，当前研究仍存在一些不足与空白。在巨噬细胞对肝脏肿瘤起始细胞存活的调控机制方面，虽然已经发现了一些关键的细胞因子、信号通路和受体-配体相互作用，但这些调控机制之间的相互关系和网络调控仍有待进一步深入研究。巨噬细胞分泌的多种细胞因子之间是否存在协同或拮抗作用，以及它们如何共同调节肝脏肿瘤起始细胞的存活，目前还不完全清楚。在巨噬细胞与肝癌发生的研究中，虽然对TAMs的亚群和功能有了一定的认识，但对于TAMs在肝癌发生不同阶段的动态变化及其作用机制，还缺乏系统的研究。在肝癌发生的早期阶段，TAMs是如何被招募到肿瘤微环境中的，以及它们如何启动肝癌的发生过程，仍需要更多的研究来阐明。目前针对巨噬细胞的肝癌治疗策略，如巨噬细胞靶向药物的研发，还处于起步阶段，存在药物疗效不理想、副作用大等问题，需要进一步探索更加有效的治疗方法和药物靶点。1.3研究目的与创新点1.3.1研究目的本研究旨在深入揭示巨噬细胞在肝脏肿瘤起始细胞存活和肝癌发生中的作用及机制，为肝癌的防治提供新的理论依据和潜在治疗靶点。具体而言，通过体内外实验，全面探究巨噬细胞与肝脏肿瘤起始细胞之间的相互作用关系，明确巨噬细胞影响肝脏肿瘤起始细胞存活的具体信号通路和分子机制。运用细胞生物学、分子生物学、免疫学等多学科技术手段，分析巨噬细胞在肝癌发生不同阶段的功能变化及其对肝癌细胞生物学行为的影响。通过对临床肝癌样本的分析，验证实验结果的临床相关性，为肝癌的早期诊断、预后评估和靶向治疗提供新的标志物和治疗策略。1.3.2创新点在研究方法上，本研究创新性地运用单细胞测序技术和空间转录组技术，对肝癌组织中的巨噬细胞和肝脏肿瘤起始细胞进行深度分析。单细胞测序技术能够精确解析巨噬细胞和肝脏肿瘤起始细胞的异质性，揭示不同亚群的细胞特征和功能差异；空间转录组技术则可以在组织原位层面，分析巨噬细胞与肝脏肿瘤起始细胞之间的空间位置关系和相互作用，弥补传统研究方法只能从整体水平分析细胞群体的不足，为深入理解二者的相互作用机制提供更加全面、准确的信息。在研究角度上，本研究首次关注巨噬细胞代谢重编程对肝脏肿瘤起始细胞存活和肝癌发生的影响。以往研究多集中于巨噬细胞分泌的细胞因子、趋化因子等对肿瘤细胞的作用，而对巨噬细胞自身代谢状态的改变及其对肿瘤细胞的影响研究较少。本研究通过代谢组学、蛋白质组学等技术手段，深入探究巨噬细胞代谢重编程的关键代谢通路和代谢产物，以及这些代谢变化如何通过旁分泌或细胞间直接接触等方式影响肝脏肿瘤起始细胞的存活和肝癌的发生发展，为肝癌的研究提供了全新的视角。在研究内容上，本研究致力于探索巨噬细胞表面新的分子靶点及其在调控肝脏肿瘤起始细胞存活和肝癌发生中的作用机制。通过高通量筛选技术和生物信息学分析，发现巨噬细胞表面可能存在一些尚未被报道的分子靶点，这些靶点与肝脏肿瘤起始细胞表面的配体相互作用，在调控肝脏肿瘤起始细胞存活和肝癌发生中发挥重要作用。深入研究这些新分子靶点的功能和作用机制，有望为肝癌的靶向治疗提供新的药物靶点和治疗策略，填补该领域在这方面的研究空白。二、巨噬细胞与肝脏肿瘤起始细胞的关联2.1巨噬细胞的特性与功能2.1.1巨噬细胞的分类与表型巨噬细胞是一种高度异质性和可塑性的免疫细胞，根据其活化状态和功能特性，主要可分为M1型和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞，也被称为经典活化的巨噬细胞，通常在脂多糖（LPS）、干扰素-γ（IFN-γ）等刺激下被激活。M1型巨噬细胞具有典型的促炎表型，其表面高表达主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）、CD86等共刺激分子，这些分子对于抗原呈递和激活T细胞免疫反应至关重要。在细胞因子分泌方面，M1型巨噬细胞能够大量分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-12（IL-12）等促炎细胞因子。TNF-α可以直接杀伤肿瘤细胞，同时还能激活其他免疫细胞，增强机体的免疫防御能力；IL-1和IL-6参与炎症反应的启动和放大，促进免疫细胞的活化和募集；IL-12则主要诱导T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）向Th1型细胞分化，增强细胞免疫应答，发挥强大的抗肿瘤作用。在精氨酸代谢途径中，M1型巨噬细胞以精氨酸为原料，通过诱导型一氧化氮合酶（iNOS）合成一氧化氮（NO）。NO具有细胞毒性，能够杀伤病原体和肿瘤细胞，进一步体现了M1型巨噬细胞的抗肿瘤活性。M2型巨噬细胞，即替代活化的巨噬细胞，主要在白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-13（IL-13）等Th2型细胞因子的刺激下分化而来。M2型巨噬细胞呈现出抗炎和免疫调节的表型特征。其表面甘露糖受体CD206和清道夫受体CD163表达上调，这些受体参与巨噬细胞对病原体、凋亡细胞和异物的吞噬清除过程。M2型巨噬细胞分泌的细胞因子以抗炎和促进组织修复为主，如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等。IL-10是一种重要的免疫抑制因子，它可以抑制M1型巨噬细胞的活化和促炎细胞因子的分泌，从而减轻炎症反应；TGF-β则在组织修复、细胞外基质合成和免疫调节等方面发挥关键作用，它能够促进成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成，有助于受损组织的修复，但同时也可能抑制免疫细胞的活性，为肿瘤细胞的生长和存活提供有利环境。在精氨酸代谢方面，M2型巨噬细胞高表达精氨酸酶（Arg-1），使精氨酸代谢为鸟氨酸，而不是合成一氧化氮。鸟氨酸参与多胺和脯氨酸的合成，多胺对于细胞增殖和生长具有重要作用，脯氨酸则是胶原蛋白的重要组成部分，这进一步说明了M2型巨噬细胞在促进组织修复和细胞增殖方面的功能。除了M1型和M2型巨噬细胞这两种主要类型外，M2型巨噬细胞还可根据诱导刺激物的不同，进一步细分为M2a、M2b、M2c和M2d等亚型。M2a型巨噬细胞由IL-4或IL-13诱导产生，具有抗炎和修复作用，能够分泌TGF-β、IL-10、血管内皮生长因子（VEGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）等，促进细胞增殖和组织损伤修复。M2b型巨噬细胞由免疫复合物、Toll样受体（TLR）配体和IL-1β活化，其功能较为复杂，既能分泌促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6，又能分泌抗炎细胞因子IL-10，在免疫反应和炎症调节中发挥作用。M2c型巨噬细胞由糖皮质激素、IL-10和TGF-β等抗炎刺激诱导产生，高效表达抗炎因子IL-10、促纤维化因子TGF-β以及Mer受体酪氨酸激酶（MerTK）等，MerTK能促进凋亡细胞吞噬，M2c型巨噬细胞在免疫调节、基质沉积和组织重塑中发挥重要作用。M2d型巨噬细胞由TLR拮抗剂、IL-6和腺苷活化，腺苷促进IL-10和VEGF的表达，该亚型巨噬细胞在血管生成和肿瘤进展中起重要作用。不同表型的巨噬细胞在肿瘤微环境中相互作用，共同影响肿瘤的发生、发展和转归。M1型巨噬细胞通常被认为具有抗肿瘤作用，能够杀伤肿瘤细胞，激活机体的抗肿瘤免疫反应；而M2型巨噬细胞及其亚型则更多地表现出促进肿瘤生长、转移和免疫抑制的作用。在肿瘤的不同发展阶段，巨噬细胞的表型和功能会发生动态变化。在肿瘤早期，M1型巨噬细胞可能占主导地位，试图抑制肿瘤的发生；但随着肿瘤的进展，肿瘤微环境中的各种因素，如肿瘤细胞分泌的细胞因子、代谢产物等，会诱导巨噬细胞向M2型极化，从而促进肿瘤的生长和转移。深入了解巨噬细胞的分类与表型特征，对于揭示其在肿瘤微环境中的作用机制具有重要意义。2.1.2巨噬细胞在免疫反应中的作用巨噬细胞在免疫反应中扮演着至关重要的角色，广泛参与免疫防御、免疫监视和免疫调节等多个方面，是维持机体免疫平衡和健康的关键因素。免疫防御：巨噬细胞作为机体抵御病原体入侵的重要防线，具有强大的吞噬和杀伤功能。当病原体如细菌、病毒、真菌等侵入机体时，巨噬细胞能够通过表面的模式识别受体（PRRs），如Toll样受体（TLRs）、甘露糖受体等，识别病原体表面的病原体相关分子模式（PAMPs）。一旦识别，巨噬细胞迅速伸出伪足，将病原体包裹并摄入细胞内，形成吞噬体。吞噬体随后与溶酶体融合，形成吞噬溶酶体，在溶酶体各种酶的作用下，病原体被降解和消化。巨噬细胞在吞噬过程中，还会将病原体分解成小片段，并通过抗原呈递细胞表面的主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）将抗原递呈给T淋巴细胞，从而激活T细胞介导的特异性免疫应答，进一步增强机体对病原体的防御能力。巨噬细胞在吞噬细菌后，会分泌多种细胞因子，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等，这些细胞因子可以激活T细胞，使其分化为效应T细胞，从而对病原体进行特异性杀伤。免疫监视：巨噬细胞在免疫监视中发挥着重要作用，能够及时识别和清除体内发生恶变的肿瘤细胞。巨噬细胞可以通过多种方式识别肿瘤细胞，一方面，肿瘤细胞表面会表达一些异常的分子，如肿瘤相关抗原（TAAs），巨噬细胞可以通过表面的受体识别这些异常分子，从而识别肿瘤细胞；另一方面，肿瘤细胞会释放一些细胞因子和趋化因子，吸引巨噬细胞到肿瘤部位。一旦识别到肿瘤细胞，M1型巨噬细胞会通过直接接触和分泌细胞毒性物质，如一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，对肿瘤细胞进行杀伤。巨噬细胞还可以激活其他免疫细胞，如T细胞、NK细胞等，共同参与抗肿瘤免疫反应，防止肿瘤的发生和发展。免疫调节：巨噬细胞在免疫调节中起着关键的平衡作用，能够调节免疫反应的强度和持续时间，维持机体的免疫稳态。在免疫反应初期，巨噬细胞通过分泌促炎细胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α等，激活T细胞和B细胞等免疫细胞，启动免疫应答。随着免疫反应的进行，巨噬细胞会分泌抗炎细胞因子，如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等，抑制免疫细胞的过度活化，防止免疫反应对机体造成损伤。巨噬细胞还可以通过与其他免疫细胞的直接接触，如与T细胞表面的共刺激分子相互作用，调节T细胞的活化和分化。巨噬细胞表面的CD80和CD86等共刺激分子可以与T细胞表面的CD28分子结合，提供T细胞活化所需的第二信号，促进T细胞的活化和增殖；而当免疫反应结束后，巨噬细胞表面的程序性死亡配体1（PD-L1）可以与T细胞表面的程序性死亡受体1（PD-1）结合，抑制T细胞的活性，使免疫反应逐渐消退。2.2肝脏肿瘤起始细胞的特征2.2.1肝脏肿瘤起始细胞的定义与鉴定肝脏肿瘤起始细胞（hTICs），又被称为肝癌干细胞，是肝癌组织中具有独特生物学特性的一小部分细胞群体。它们被定义为具有自我更新能力、多向分化潜能和高致瘤性的细胞，能够在体内外重建肿瘤的生长，被认为是肝癌发生、发展、复发和转移的根源。目前，鉴定肝脏肿瘤起始细胞主要通过多种方法和标志物来实现。从细胞表面标志物角度来看，常用的标志物包括CD133、CD90、EpCAM、CD44等。CD133是一种五跨膜糖蛋白，在多种肿瘤干细胞中均有表达。研究发现，在肝癌组织中，CD133阳性的细胞亚群相较于CD133阴性细胞，具有更强的自我更新能力和致瘤性。将CD133阳性的肝癌细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，能够形成肿瘤，且肿瘤的形态和生物学特性与原发肿瘤相似，而CD133阴性细胞则难以成瘤。CD90，也称为Thy-1，是一种细胞表面糖蛋白。有研究报道，CD90阳性的肝癌细胞在体外能够形成肿瘤球，表现出更强的克隆形成能力；在体内实验中，少量CD90阳性细胞即可在小鼠体内引发肿瘤，说明其具有高致瘤性。EpCAM（上皮细胞黏附分子）在肝脏肿瘤起始细胞的鉴定中也具有重要作用。EpCAM阳性的肝癌细胞具有较高的干性，能够分化为多种肝癌细胞亚型，并且在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥关键作用。CD44是一种细胞表面受体，参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互作用。CD44阳性的肝癌细胞对化疗药物具有更强的耐药性，能够在化疗后存活并重新启动肿瘤生长，与肝癌的复发密切相关。除了细胞表面标志物，功能性检测也是鉴定肝脏肿瘤起始细胞的重要手段。肿瘤球形成实验是常用的功能性检测方法之一。在无血清、添加生长因子的培养基中，肝脏肿瘤起始细胞能够形成悬浮的肿瘤球，而普通肝癌细胞则难以形成。肿瘤球中的细胞具有自我更新和分化能力，将肿瘤球打散后，单个细胞仍能再次形成肿瘤球，并且可以分化为不同类型的肝癌细胞。软琼脂克隆形成实验也可用于鉴定肝脏肿瘤起始细胞。肝脏肿瘤起始细胞在软琼脂中能够形成克隆，而普通肝癌细胞在软琼脂中的克隆形成能力较弱。这是因为肝脏肿瘤起始细胞具有更强的增殖能力和抗凋亡能力，能够在软琼脂这种半固体环境中生长和分裂。体内致瘤实验是鉴定肝脏肿瘤起始细胞的金标准。将疑似肝脏肿瘤起始细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，如果细胞能够在小鼠体内形成肿瘤，且肿瘤具有与原发肿瘤相似的组织学特征和生物学行为，则可证明这些细胞具有肝脏肿瘤起始细胞的特性。通常，肝脏肿瘤起始细胞在低细胞数（如100-1000个细胞）的情况下即可在小鼠体内致瘤，而普通肝癌细胞则需要更高的细胞数量才可能成瘤。2.2.2肝脏肿瘤起始细胞的自我更新与分化能力肝脏肿瘤起始细胞具有强大的自我更新能力，这是其维持肿瘤细胞群体稳定和持续增殖的关键特性。自我更新是指细胞能够产生与自身相同的子代细胞，从而保持干细胞群体的数量和特性。肝脏肿瘤起始细胞通过对称分裂和不对称分裂两种方式实现自我更新。在对称分裂中，一个肝脏肿瘤起始细胞分裂产生两个完全相同的子代细胞，这两个子代细胞都具有与亲代细胞相同的自我更新和分化能力，使得肝脏肿瘤起始细胞群体数量迅速增加。在肝癌细胞系的培养中，部分肝脏肿瘤起始细胞会发生对称分裂，导致肿瘤球的体积和数量不断增大。不对称分裂则是一个肝脏肿瘤起始细胞分裂产生一个与亲代细胞相同的子代细胞和一个分化程度更高的子代细胞。这种分裂方式既能维持肝脏肿瘤起始细胞群体的稳定，又能为肿瘤的生长和发展提供不同分化阶段的细胞。在肿瘤组织中，通过追踪肝脏肿瘤起始细胞的分裂过程，可以观察到不对称分裂的现象，其中一个子代细胞继续保持干细胞特性，另一个子代细胞则开始向不同的细胞类型分化。肝脏肿瘤起始细胞的自我更新能力受到多种信号通路的调控。Wnt/β-catenin信号通路在肝脏肿瘤起始细胞的自我更新中发挥着核心作用。在正常情况下，β-catenin在细胞质中与多种蛋白形成复合物，并被磷酸化，随后被泛素化降解。当Wnt信号通路激活时，Wnt蛋白与细胞膜上的受体结合，抑制β-catenin的磷酸化和降解，使得β-catenin在细胞质中积累并进入细胞核。在细胞核内，β-catenin与转录因子TCF/LEF结合，激活一系列与细胞增殖、自我更新相关的基因表达，如c-Myc、CyclinD1等。研究表明，在肝脏肿瘤起始细胞中，Wnt/β-catenin信号通路处于持续激活状态，通过敲低β-catenin或抑制Wnt信号通路的关键分子，可以显著抑制肝脏肿瘤起始细胞的自我更新能力，减少肿瘤球的形成和致瘤性。Notch信号通路也参与肝脏肿瘤起始细胞自我更新的调控。Notch信号通路的激活依赖于细胞间的相互作用，当Notch受体与相邻细胞表面的配体结合后，Notch受体被切割，释放出胞内结构域（NICD）。NICD进入细胞核，与转录因子RBP-Jκ结合，激活下游靶基因的表达，如Hes1、Hey1等。这些靶基因参与细胞的增殖、分化和自我更新过程。在肝脏肿瘤起始细胞中，Notch信号通路的激活能够促进其自我更新，维持干细胞特性；而抑制Notch信号通路则会导致肝脏肿瘤起始细胞的分化和自我更新能力下降。肝脏肿瘤起始细胞还具有多向分化潜能，能够分化为多种不同类型的肝癌细胞。这种分化能力使得肿瘤组织具有高度的异质性，增加了肿瘤治疗的难度。肝脏肿瘤起始细胞可以分化为肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞。在体外诱导分化实验中，通过添加特定的细胞因子和生长因子，如肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等，可以促使肝脏肿瘤起始细胞向肝细胞样细胞分化，表现为细胞形态改变，表达肝细胞特异性标志物，如白蛋白（Albumin）、细胞色素P450等。当添加不同的诱导因子，如转化生长因子-β（TGF-β）、骨形态发生蛋白（BMP）等时，肝脏肿瘤起始细胞则可以向胆管细胞样细胞分化，表达胆管细胞特异性标志物，如细胞角蛋白19（CK19）、上皮细胞膜抗原（EMA）等。肝脏肿瘤起始细胞还可能分化为具有间质细胞特性的细胞，参与肿瘤的侵袭和转移过程。在肿瘤微环境中，肝脏肿瘤起始细胞受到多种信号的刺激，发生上皮-间质转化（EMT），获得间质细胞的特性，如表达波形蛋白（Vimentin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）等，同时失去上皮细胞的标志物，如E-钙黏蛋白（E-cadherin）。这些具有间质细胞特性的分化细胞具有更强的迁移和侵袭能力，能够突破基底膜，进入血液循环，从而导致肿瘤的远处转移。2.3巨噬细胞与肝脏肿瘤起始细胞的相互作用2.3.1巨噬细胞对肝脏肿瘤起始细胞存活的影响机制巨噬细胞在肝脏肿瘤起始细胞（hTICs）的存活过程中扮演着至关重要的角色，其作用机制涉及多个层面，通过分泌细胞因子、调节免疫微环境以及与hTICs的直接接触等方式，对hTICs的存活产生深远影响。巨噬细胞分泌的多种细胞因子在调控hTICs存活中发挥关键作用。肝细胞生长因子（HGF）是巨噬细胞分泌的重要细胞因子之一。在肝癌微环境中，巨噬细胞来源的HGF能够与hTICs表面的c-Met受体特异性结合，激活下游的PI3K/Akt和MAPK信号通路。PI3K/Akt信号通路的激活可以抑制hTICs的凋亡，促进其存活。研究表明，通过阻断HGF与c-Met受体的结合，或抑制PI3K/Akt信号通路的活性，能够显著降低hTICs的存活数量，抑制肿瘤的生长。MAPK信号通路的激活则可以促进hTICs的增殖，增强其自我更新能力。巨噬细胞分泌的胰岛素样生长因子-1（IGF-1）也能促进hTICs的存活。IGF-1与hTICs表面的IGF-1R结合后，激活下游的一系列信号分子，如AKT、ERK等，这些信号分子参与调节细胞的增殖、存活和代谢过程。有研究发现，在肝癌细胞系中，添加IGF-1可以显著提高hTICs的存活率和克隆形成能力，而使用IGF-1R抑制剂则可以抑制hTICs的生长和存活。巨噬细胞对肿瘤微环境中免疫细胞的调节作用间接影响hTICs的存活。肿瘤微环境中存在着复杂的免疫细胞网络，巨噬细胞作为其中的关键成员，能够调节T细胞、NK细胞等免疫细胞的活性。M2型巨噬细胞分泌的白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）等免疫抑制因子，可以抑制T细胞和NK细胞的功能，使其无法有效地杀伤hTICs。IL-10能够抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌，降低T细胞对hTICs的识别和杀伤能力。TGF-β则可以抑制NK细胞的活化和细胞毒性，使hTICs逃避NK细胞的免疫监视。巨噬细胞还可以通过分泌趋化因子，如CCL2、CCL5等，招募调节性T细胞（Tregs）到肿瘤微环境中。Tregs具有免疫抑制功能，能够抑制效应T细胞的活性，保护hTICs免受免疫攻击。研究表明，在肝癌患者的肿瘤组织中，Tregs的浸润数量与M2型巨噬细胞的数量呈正相关，且与患者的预后不良相关。巨噬细胞与hTICs之间的直接接触也对hTICs的存活产生影响。巨噬细胞表面的某些受体与hTICs表面的配体相互作用，激活hTICs内的存活信号通路。巨噬细胞表面的CD44受体与hTICs表面的透明质酸结合后，能够激活hTICs内的NF-κB信号通路。NF-κB是一种重要的转录因子，它可以调节一系列与细胞存活、增殖和抗凋亡相关的基因表达。激活的NF-κB信号通路可以促进hTICs的存活和增殖，增强其对化疗药物的耐药性。巨噬细胞与hTICs之间还可以通过间隙连接进行直接的物质交换和信号传递。间隙连接是由连接蛋白组成的通道，允许小分子物质如离子、代谢产物和信号分子在细胞之间传递。通过间隙连接，巨噬细胞可以向hTICs传递生存信号和营养物质，支持hTICs的存活和生长。2.3.2肝脏肿瘤起始细胞对巨噬细胞的招募与极化肝脏肿瘤起始细胞（hTICs）能够主动招募巨噬细胞并使其极化，这一过程在肝癌的发生发展中起着关键作用。hTICs通过分泌多种趋化因子和细胞因子，吸引巨噬细胞向肿瘤微环境聚集，并诱导巨噬细胞发生极化，转化为具有不同功能的表型，进而影响肿瘤的进程。hTICs分泌的趋化因子是招募巨噬细胞的重要信号分子。研究表明，hTICs高表达CCL2、CCL5、CSF1等趋化因子。CCL2，也称为单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），能够与巨噬细胞表面的CCR2受体结合，引导巨噬细胞向hTICs所在部位迁移。在肝癌小鼠模型中，敲低hTICs中CCL2的表达，显著减少了肿瘤组织中巨噬细胞的浸润数量。CCL5可以与巨噬细胞表面的CCR5受体相互作用，促进巨噬细胞的趋化运动。CSF1，即集落刺激因子1，能够特异性地刺激单核-巨噬细胞的增殖、分化和存活，hTICs分泌的CSF1可以吸引骨髓中的单核细胞进入肿瘤组织，并分化为巨噬细胞。通过在肝癌细胞系中过表达或敲低CSF1，发现CSF1的表达水平与肿瘤组织中巨噬细胞的数量呈正相关。这些趋化因子的协同作用，使得巨噬细胞能够有效地被招募到hTICs周围，形成肿瘤微环境的重要组成部分。一旦巨噬细胞被招募到肿瘤微环境，hTICs分泌的细胞因子和其他信号分子会诱导巨噬细胞发生极化。hTICs分泌的白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-13（IL-13）等细胞因子可以诱导巨噬细胞向M2型极化。IL-4和IL-13与巨噬细胞表面的相应受体结合后，激活JAK-STAT6信号通路，促使巨噬细胞表达M2型巨噬细胞的标志物，如CD206、精氨酸酶-1（Arg-1）等，并分泌抗炎和免疫抑制因子，如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等。hTICs分泌的前列腺素E2（PGE2）也能促进巨噬细胞向M2型极化。PGE2通过与巨噬细胞表面的EP受体结合，激活细胞内的cAMP信号通路，调节巨噬细胞的基因表达和功能。研究发现，在肝癌组织中，PGE2的水平与M2型巨噬细胞的数量呈正相关，抑制PGE2的合成或阻断其信号通路，可以减少M2型巨噬细胞的比例，抑制肿瘤的生长和转移。极化后的M2型巨噬细胞对hTICs产生反馈作用，进一步促进肿瘤的发展。M2型巨噬细胞分泌的VEGF可以促进肿瘤血管生成，为hTICs提供充足的营养和氧气，支持其存活和增殖。TGF-β可以促进hTICs的上皮-间质转化（EMT），增强其迁移和侵袭能力，从而促进肿瘤的转移。M2型巨噬细胞还可以通过分泌IL-10等免疫抑制因子，抑制T细胞、NK细胞等免疫细胞的活性，帮助hTICs逃避机体的免疫监视。M2型巨噬细胞与hTICs之间存在着复杂的相互作用网络，它们相互促进，形成了一个有利于肿瘤生长和转移的微环境。三、巨噬细胞影响肝脏肿瘤起始细胞存活的机制3.1免疫逃逸机制3.1.1巨噬细胞抑制T细胞免疫监视巨噬细胞在肿瘤微环境中可通过多种方式抑制T细胞的免疫监视功能，从而帮助肝脏肿瘤起始细胞逃脱免疫清除。浙江大学生命科学研究院赵斌课题组在相关研究中取得了重要发现。该课题组建立了全新的肝癌起始动物模型，以此深入探究肿瘤起始阶段的免疫逃逸机制。研究发现，在单个肿瘤起始细胞阶段，肿瘤起始细胞能够通过激活Hippo信号通路中的关键转录辅激活因子YAP，诱导CCL2和CSF1两个趋化因子的表达。这两种趋化因子的表达增加，强烈地募集巨噬细胞到肿瘤起始细胞周围。进一步研究表明，被招募的巨噬细胞为2型巨噬细胞（M2型巨噬细胞）。M2型巨噬细胞具有免疫抑制特性，它们能够对T细胞产生抑制作用。M2型巨噬细胞表面表达高水平的程序性死亡配体1（PD-L1），PD-L1与T细胞表面的程序性死亡受体1（PD-1）结合，传递抑制信号，抑制T细胞的活化和增殖，使其无法有效地识别和杀伤肿瘤起始细胞。M2型巨噬细胞还能分泌细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4），CTLA-4与T细胞表面的CD28分子竞争结合抗原呈递细胞表面的B7分子，阻断T细胞活化所需的共刺激信号，从而抑制T细胞的免疫功能。在该研究的动物实验中，通过敲减肿瘤起始细胞中YAP对CCL2和CSF1的诱导表达，成功阻止了巨噬细胞的招募。结果显示，T细胞的免疫监视功能得到恢复，肿瘤起始细胞被有效清除，肝肿瘤的形成也被阻止。这充分证明了巨噬细胞在肿瘤起始细胞阶段对T细胞免疫监视的抑制作用，以及这种抑制作用对肝脏肿瘤起始细胞存活和肝癌发生的关键影响。巨噬细胞对T细胞免疫监视的抑制还可能涉及其他机制。巨噬细胞可以分泌吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO），IDO能够催化色氨酸代谢，导致肿瘤微环境中色氨酸水平降低，犬尿氨酸水平升高。色氨酸是T细胞增殖和活化所必需的氨基酸，其缺乏会抑制T细胞的功能；而犬尿氨酸及其代谢产物可以激活芳烃受体（AhR），诱导T细胞凋亡，进一步削弱T细胞的免疫监视能力。巨噬细胞还可以通过与T细胞直接接触，释放一些抑制性细胞因子，如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等，抑制T细胞的活性。IL-10能够抑制T细胞分泌细胞因子，降低T细胞的增殖能力；TGF-β则可以抑制T细胞的分化和活化，使T细胞处于免疫抑制状态。3.1.2巨噬细胞介导的免疫抑制因子分泌巨噬细胞分泌的免疫抑制因子在肝脏肿瘤起始细胞的免疫逃逸过程中发挥着重要作用。白细胞介素-10（IL-10）是巨噬细胞分泌的一种关键免疫抑制因子。IL-10主要由M2型巨噬细胞产生，它可以通过多种途径抑制免疫反应，帮助肝脏肿瘤起始细胞逃避机体的免疫监视。IL-10能够直接抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌。研究表明，在肝癌微环境中，IL-10与T细胞表面的IL-10受体结合，激活下游的信号通路，抑制T细胞中与增殖和活化相关的基因表达，如白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子的基因。IL-2是T细胞增殖和活化所必需的细胞因子，其表达受到抑制会导致T细胞的增殖能力下降，无法有效地杀伤肿瘤细胞。IFN-γ则具有激活巨噬细胞、增强其抗肿瘤活性的作用，IL-10抑制IFN-γ的分泌，削弱了巨噬细胞的抗肿瘤功能，间接为肝脏肿瘤起始细胞的存活提供了有利条件。转化生长因子-β（TGF-β）也是巨噬细胞分泌的重要免疫抑制因子。TGF-β在肿瘤微环境中具有多种生物学功能，对肝脏肿瘤起始细胞的免疫逃逸产生深远影响。TGF-β可以抑制T细胞和NK细胞的活性。它能够抑制T细胞的增殖和分化，使T细胞无法有效地识别和杀伤肿瘤细胞。在肝癌患者的肿瘤组织中，TGF-β的表达水平与T细胞的活性呈负相关，高表达的TGF-β会导致T细胞的功能受损，无法发挥正常的免疫监视作用。TGF-β还能抑制NK细胞的活化和细胞毒性，NK细胞是机体天然免疫的重要组成部分，具有直接杀伤肿瘤细胞的能力。TGF-β通过抑制NK细胞表面活化受体的表达，降低NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，帮助肝脏肿瘤起始细胞逃避NK细胞的攻击。TGF-β可以促进调节性T细胞（Tregs）的分化和增殖。Tregs是一类具有免疫抑制功能的T细胞亚群，能够抑制效应T细胞的活性。在肝癌微环境中，巨噬细胞分泌的TGF-β诱导Tregs的分化，增加Tregs在肿瘤组织中的浸润数量。Tregs通过分泌IL-10、TGF-β等免疫抑制因子，以及与效应T细胞直接接触等方式，抑制效应T细胞的活化和增殖，保护肝脏肿瘤起始细胞免受免疫攻击。巨噬细胞分泌的其他免疫抑制因子，如前列腺素E2（PGE2）等，也在肝脏肿瘤起始细胞的免疫逃逸中发挥作用。PGE2可以通过与免疫细胞表面的EP受体结合，激活细胞内的cAMP信号通路，调节免疫细胞的功能。在肝癌微环境中，PGE2能够抑制T细胞的活性，促进M2型巨噬细胞的极化，进一步增强肿瘤微环境的免疫抑制状态，有利于肝脏肿瘤起始细胞的存活和免疫逃逸。3.2细胞因子与信号通路3.2.1关键细胞因子的作用CCL2、CSF1等趋化因子在巨噬细胞与肝脏肿瘤起始细胞的相互作用中扮演着不可或缺的角色。CCL2，又名单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），是一种重要的趋化因子。在肝癌微环境中，肝脏肿瘤起始细胞能够分泌CCL2，其通过与巨噬细胞表面的CCR2受体特异性结合，如同精确的导航信号，引导巨噬细胞向肿瘤部位迁移。西安交大二附院李宗芳团队的研究发现，肿瘤细胞经血循环进入肝脏毛细血管后，细胞核受到机械力作用会发生核变形和核内DNA渗漏，进而使肿瘤细胞cGAS-STING通路活化，促使CCL2等趋化因子分泌增多。增多的CCL2作为单核细胞的关键趋化因子，诱导脾脏单核/巨噬细胞向肝脏浸润，这一过程极大地增强了受损伤肿瘤细胞在肝组织中的存活、定植和增殖能力，最终加剧了肿瘤肝转移。南方医科大学的研究表明，ASH1L作为一种H3K4甲基转移酶，在活化的肝星状细胞和肝癌细胞中水平较高，其介导的H3K4me3修饰能够增加CCL2和CSF1的表达，从而募集和极化M2样促肿瘤巨噬细胞。M2型巨噬细胞进一步促进肿瘤细胞增殖，抑制CD8⁺T细胞活化。CSF1，即集落刺激因子1，同样在这一过程中发挥关键作用。肝脏肿瘤起始细胞分泌的CSF1可以特异性地刺激单核-巨噬细胞的增殖、分化和存活。它能够吸引骨髓中的单核细胞进入肿瘤组织，并促使其分化为巨噬细胞。在肝癌细胞系的实验中，过表达CSF1会导致肿瘤组织中巨噬细胞的数量显著增加；而敲低CSF1的表达，则会使巨噬细胞的浸润数量明显减少。这充分证明了CSF1在招募巨噬细胞到肿瘤微环境中的重要作用。除了趋化因子，多种生长因子也在巨噬细胞与肝脏肿瘤起始细胞的相互作用中发挥重要影响，对肿瘤起始细胞的存活和增殖产生深远作用。肝细胞生长因子（HGF）是其中的典型代表。巨噬细胞分泌的HGF能够与肝脏肿瘤起始细胞表面的c-Met受体紧密结合，进而激活下游的PI3K/Akt和MAPK信号通路。PI3K/Akt信号通路的激活是调控细胞存活的关键环节，它可以抑制肝脏肿瘤起始细胞的凋亡，为其存活提供有力保障。在肝癌细胞的培养实验中，加入HGF能够显著提高肝脏肿瘤起始细胞的存活率，而阻断HGF与c-Met受体的结合，或者抑制PI3K/Akt信号通路的活性，都会导致肝脏肿瘤起始细胞的凋亡增加，存活数量明显减少。MAPK信号通路的激活则主要促进肝脏肿瘤起始细胞的增殖，增强其自我更新能力。激活后的MAPK信号通路会促使细胞周期相关蛋白的表达上调，加速细胞的分裂和增殖。在肝癌动物模型中，激活MAPK信号通路可以观察到肝脏肿瘤起始细胞的数量明显增多，肿瘤生长速度加快。胰岛素样生长因子-1（IGF-1）也在这一过程中发挥着重要作用。IGF-1与肝脏肿瘤起始细胞表面的IGF-1R结合后，会激活下游一系列信号分子，如AKT、ERK等。这些信号分子参与调节细胞的增殖、存活和代谢过程。研究发现，在肝癌细胞系中，添加IGF-1可以显著提高肝脏肿瘤起始细胞的存活率和克隆形成能力，使其在体外培养中能够形成更多的肿瘤球，并且肿瘤球的体积也更大。而使用IGF-1R抑制剂则可以有效抑制肝脏肿瘤起始细胞的生长和存活，降低其克隆形成能力。3.2.2相关信号通路的激活以Hippo信号通路为例，其在巨噬细胞招募和肝脏肿瘤起始细胞存活中发挥着至关重要的作用。Hippo信号通路是一条近年来被发现的调控器官大小发育的细胞信号转导通路。在小鼠肝脏内，Hippo信号通路关键激酶Mst1/2的敲除或被其抑制的转录辅激活因子YAP的转基因表达，都会导致肝脏的迅速增大，继而引发肝脏肿瘤。在人类肝癌样品中，也发现YAP被大量激活。浙江大学生命科学研究院赵斌课题组的研究表明，在肝细胞中激活YAP能够强烈地募集巨噬细胞到肿瘤起始细胞周围。通过趋化因子芯片分析和其他实验证实，YAP的激活能够诱导CCL2和CSF1两个趋化因子的表达。当在激活YAP的同时敲减这两个因子，就能够有效阻止巨噬细胞的招募。这充分说明肿瘤起始细胞中YAP对CCL2和CSF1的诱导表达是招募巨噬细胞的关键原因。更为重要的是，敲减CCL2和CSF1还能够阻止YAP诱导的肝肿瘤形成。进一步的研究表明，被招募的巨噬细胞为2型巨噬细胞（M2型巨噬细胞）。M2型巨噬细胞通过对T细胞的抑制作用，使得肿瘤起始细胞能够成功逃逸免疫监视，避免被清除。在小鼠肝脏内，一些人类的肝癌致病基因也能够通过激活YAP导致巨噬细胞的招募，并且在人类的肝癌前病变样品中也存在YAP激活与巨噬细胞招募的相关性。除了Hippo信号通路，还有其他多条信号通路可能参与巨噬细胞与肝脏肿瘤起始细胞的相互作用过程。Wnt/β-catenin信号通路在肝脏肿瘤起始细胞的自我更新和存活中发挥着重要作用。在正常生理状态下，β-catenin在细胞质中与多种蛋白形成复合物，并被磷酸化，随后被泛素化降解。然而，当Wnt信号通路被激活时，Wnt蛋白与细胞膜上的受体结合，抑制β-catenin的磷酸化和降解，使得β-catenin在细胞质中大量积累并进入细胞核。在细胞核内，β-catenin与转录因子TCF/LEF结合，激活一系列与细胞增殖、自我更新相关的基因表达，如c-Myc、CyclinD1等。在肝脏肿瘤起始细胞中，Wnt/β-catenin信号通路常常处于持续激活状态，这为肿瘤起始细胞的存活和增殖提供了重要的信号支持。通过敲低β-catenin或抑制Wnt信号通路的关键分子，可以显著抑制肝脏肿瘤起始细胞的自我更新能力和存活数量。Notch信号通路也与巨噬细胞和肝脏肿瘤起始细胞的相互作用密切相关。Notch信号通路的激活依赖于细胞间的相互作用，当Notch受体与相邻细胞表面的配体结合后，Notch受体被切割，释放出胞内结构域（NICD）。NICD进入细胞核，与转录因子RBP-Jκ结合，激活下游靶基因的表达，如Hes1、Hey1等。这些靶基因参与细胞的增殖、分化和自我更新过程。在巨噬细胞与肝脏肿瘤起始细胞的相互作用中，Notch信号通路的激活可能影响巨噬细胞的极化和功能，同时也对肝脏肿瘤起始细胞的存活和增殖产生影响。研究发现，抑制Notch信号通路会导致巨噬细胞向M1型极化增强，同时降低肝脏肿瘤起始细胞的存活和增殖能力。而激活Notch信号通路则会促进巨噬细胞向M2型极化，有利于肝脏肿瘤起始细胞的存活和肿瘤的发生发展。3.3代谢微环境的调节3.3.1巨噬细胞对肿瘤代谢的影响巨噬细胞在肿瘤微环境中对代谢物质的调节对肝脏肿瘤起始细胞的存活和代谢产生着深远影响。在葡萄糖代谢方面，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表现出独特的代谢模式。在结直肠癌等肿瘤中，TAMs是微环境中单细胞水平的最大葡萄糖消耗者。它们偏好糖酵解而非氧化磷酸化（OXPHOS），即使在氧充足条件下仍以糖酵解为主。这一过程通过上调己糖激酶II（HK2）、丙酮酸激酶M2（PKM2）和乳酸脱氢酶A（LDHA）等酶的表达来实现。在肝癌微环境中，TAMs的这种糖酵解代谢模式会导致葡萄糖的大量消耗，使得肿瘤微环境中葡萄糖含量降低。而肝脏肿瘤起始细胞的存活和增殖高度依赖葡萄糖，葡萄糖供应不足会影响其能量代谢和生物合成过程。研究发现，当肿瘤微环境中葡萄糖水平降低时，肝脏肿瘤起始细胞的增殖能力明显下降，自我更新能力也受到抑制。TAMs糖酵解产生的乳酸也对肝脏肿瘤起始细胞的代谢和存活产生重要影响。肿瘤细胞及TAMs产生的乳酸通过多种机制稳定缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），上调血管内皮生长因子（VEGF）和精氨酸酶1（ARG1），促进肿瘤进展和免疫抑制。在肝癌中，乳酸可以作为肝脏肿瘤起始细胞的能量来源，通过单羧酸转运体进入肝脏肿瘤起始细胞，参与其代谢过程。乳酸还可以调节肝脏肿瘤起始细胞的微环境，促进肿瘤血管生成，为肝脏肿瘤起始细胞提供更多的营养和氧气，从而支持其存活和增殖。在脂质代谢方面，TAMs通过多种机制影响肿瘤微环境中的脂质水平，进而影响肝脏肿瘤起始细胞的存活和代谢。TAMs通过CD36受体大量摄取肿瘤释放的游离脂肪酸（FFA），进行β-氧化（FAO）供能，维持抗炎表型。这一过程会导致肿瘤微环境中游离脂肪酸水平降低。肝脏肿瘤起始细胞的膜合成和信号传导等过程依赖于脂肪酸，游离脂肪酸水平的降低会影响肝脏肿瘤起始细胞的生物学功能。研究表明，当肿瘤微环境中游离脂肪酸水平下降时，肝脏肿瘤起始细胞的细胞膜流动性降低，细胞表面受体的功能也受到影响，从而抑制其增殖和存活。TAMs摄取的脂肪酸可以在细胞内积累形成脂滴，这一过程受到TREM2等受体的调节。脂滴的形成与TAMs的免疫抑制表型有关。脂滴中的脂肪酸可以在需要时被释放出来，为TAMs提供能量。在肝癌微环境中，TAMs脂滴中的脂肪酸也可能通过旁分泌的方式影响肝脏肿瘤起始细胞的代谢。TAMs脂滴中的脂肪酸可以被代谢为前列腺素等生物活性物质，这些物质可以调节肝脏肿瘤起始细胞的增殖、凋亡和迁移等过程。研究发现，前列腺素E2（PGE2）可以促进肝脏肿瘤起始细胞的增殖和迁移，增强其对化疗药物的耐药性。3.3.2代谢产物对巨噬细胞功能的反作用肝脏肿瘤起始细胞产生的代谢产物对巨噬细胞的功能和表型有着显著影响，这种反作用进一步影响着肿瘤的发生发展。肝脏肿瘤起始细胞在代谢过程中会产生大量的乳酸，乳酸作为一种重要的代谢产物，对巨噬细胞的功能和表型产生多方面的影响。在肝癌微环境中，高浓度的乳酸可以促使巨噬细胞向M2型极化。乳酸通过与巨噬细胞表面的受体结合，激活细胞内的信号通路，调节巨噬细胞的基因表达。研究表明，乳酸可以激活巨噬细胞内的NF-κB信号通路，促进M2型巨噬细胞标志物如CD206、精氨酸酶-1（Arg-1）等的表达，同时抑制M1型巨噬细胞标志物如iNOS、IL-12等的表达。极化后的M2型巨噬细胞分泌更多的免疫抑制因子，如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等，进一步抑制机体的抗肿瘤免疫反应，为肝脏肿瘤起始细胞的存活和增殖提供有利的微环境。肝脏肿瘤起始细胞产生的其他代谢产物，如酮体、脂肪酸等，也对巨噬细胞的功能和表型产生影响。酮体是肝脏肿瘤起始细胞在脂肪酸β-氧化过程中产生的代谢产物。在肝癌微环境中，酮体可以被巨噬细胞摄取利用，作为能量来源。研究发现，酮体的摄取可以改变巨噬细胞的代谢状态，影响其功能。酮体可以抑制巨噬细胞的糖酵解，促进其脂肪酸氧化，从而影响巨噬细胞的炎症反应和免疫调节功能。脂肪酸也是肝脏肿瘤起始细胞产生的重要代谢产物之一。肝脏肿瘤起始细胞产生的脂肪酸可以通过与巨噬细胞表面的脂肪酸受体结合，调节巨噬细胞的功能。脂肪酸可以促进巨噬细胞分泌细胞因子和趋化因子，如CCL2、CCL5等，这些因子可以招募更多的巨噬细胞和其他免疫细胞到肿瘤微环境中，进一步改变肿瘤微环境的免疫状态。脂肪酸还可以影响巨噬细胞的吞噬功能和抗原呈递能力，从而影响机体的抗肿瘤免疫反应。四、巨噬细胞在肝癌发生发展不同阶段的作用4.1肝癌起始阶段4.1.1巨噬细胞促进肿瘤起始细胞的定植与扩增在肝癌起始阶段，巨噬细胞对肝脏肿瘤起始细胞（hTICs）的定植与扩增起着至关重要的作用。巨噬细胞通过多种机制为hTICs提供适宜的微环境，助力其在肝脏中成功定植并实现早期扩增。巨噬细胞分泌的细胞因子在这一过程中发挥着关键作用。肝细胞生长因子（HGF）是巨噬细胞分泌的重要细胞因子之一。在肝癌起始阶段，巨噬细胞来源的HGF能够与hTICs表面的c-Met受体特异性结合，激活下游的PI3K/Akt和MAPK信号通路。PI3K/Akt信号通路的激活可以抑制hTICs的凋亡，为其存活提供有力保障。有研究表明，在肝癌起始的小鼠模型中，阻断HGF与c-Met受体的结合，会导致hTICs的凋亡率显著增加，肿瘤的起始和发展受到明显抑制。MAPK信号通路的激活则能够促进hTICs的增殖，增强其自我更新能力。激活后的MAPK信号通路会促使细胞周期相关蛋白的表达上调，加速细胞的分裂和增殖。在体外实验中，使用MAPK信号通路激活剂处理hTICs，能够观察到hTICs的增殖速度明显加快，克隆形成能力增强。巨噬细胞还能通过调节细胞外基质（ECM）来促进hTICs的定植与扩增。巨噬细胞可以分泌多种蛋白酶，如基质金属蛋白酶（MMPs）等，这些蛋白酶能够降解ECM中的成分，为hTICs的迁移和定植创造空间。MMP-2和MMP-9可以降解ECM中的胶原蛋白和层粘连蛋白，使hTICs更容易穿透基底膜，进入肝脏组织中定植。巨噬细胞分泌的细胞因子还可以调节ECM的合成和重塑，为hTICs提供一个有利于其生长和扩增的微环境。转化生长因子-β（TGF-β）可以促进成纤维细胞合成胶原蛋白，增加ECM的硬度和稳定性，为hTICs的附着和生长提供支持。巨噬细胞与hTICs之间的直接接触也是促进hTICs定植与扩增的重要因素。巨噬细胞表面的某些受体与hTICs表面的配体相互作用，激活hTICs内的存活和增殖信号通路。巨噬细胞表面的CD44受体与hTICs表面的透明质酸结合后，能够激活hTICs内的NF-κB信号通路。NF-κB是一种重要的转录因子，它可以调节一系列与细胞存活、增殖和抗凋亡相关的基因表达。激活的NF-κB信号通路可以促进hTICs的存活和增殖，增强其对化疗药物的耐药性。巨噬细胞与hTICs之间还可以通过间隙连接进行直接的物质交换和信号传递。间隙连接是由连接蛋白组成的通道，允许小分子物质如离子、代谢产物和信号分子在细胞之间传递。通过间隙连接，巨噬细胞可以向hTICs传递生存信号和营养物质，支持hTICs的存活和生长。在肝癌起始阶段的体内实验中，观察到巨噬细胞与hTICs紧密相邻，通过间隙连接进行物质交换和信号传递，促进了hTICs的定植和早期扩增。4.1.2早期免疫微环境的形成与影响在肝癌起始阶段，巨噬细胞参与形成的免疫微环境对肿瘤细胞的命运和肿瘤的后续发展产生着深远影响。巨噬细胞在这一阶段通过多种方式塑造免疫微环境，使其朝着有利于肿瘤起始细胞存活和肿瘤发生的方向发展。巨噬细胞在肝癌起始阶段的免疫微环境中，主要通过调节免疫细胞的活性来影响肿瘤细胞。M2型巨噬细胞在这一过程中发挥着重要作用。M2型巨噬细胞能够分泌白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等免疫抑制因子，抑制T细胞和NK细胞的功能。IL-10可以抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌，降低T细胞对肿瘤起始细胞的识别和杀伤能力。在肝癌起始阶段的小鼠模型中，敲除M2型巨噬细胞分泌IL-10的基因，会导致T细胞的活性增强，肿瘤起始细胞的清除效率提高，肿瘤的发生率降低。TGF-β则可以抑制NK细胞的活化和细胞毒性，使肿瘤起始细胞逃避NK细胞的免疫监视。研究表明，在肝癌起始阶段，TGF-β能够抑制NK细胞表面活化受体的表达，降低NK细胞对肿瘤起始细胞的杀伤活性。巨噬细胞还可以通过分泌趋化因子，招募调节性T细胞（Tregs）到肿瘤微环境中。Tregs具有免疫抑制功能，能够抑制效应T细胞的活性，保护肿瘤起始细胞免受免疫攻击。在肝癌起始阶段，巨噬细胞分泌的CCL2、CCL5等趋化因子可以吸引Tregs到肿瘤部位。这些趋化因子与Tregs表面的相应受体结合，引导Tregs向肿瘤微环境迁移。研究发现，在肝癌起始阶段，肿瘤微环境中Tregs的数量与巨噬细胞分泌的趋化因子水平呈正相关，且Tregs的浸润能够抑制效应T细胞对肿瘤起始细胞的杀伤作用，促进肿瘤的起始和发展。巨噬细胞参与形成的早期免疫微环境还会影响肿瘤细胞的生物学特性。在免疫抑制的微环境中，肿瘤起始细胞的干性维持和自我更新能力增强。肿瘤起始细胞表面的一些干性标志物，如CD133、CD90等的表达上调，使其具有更强的自我更新和分化能力。研究表明，在肝癌起始阶段，免疫抑制微环境中的细胞因子和信号分子可以激活肿瘤起始细胞内的干性相关信号通路，如Wnt/β-catenin、Notch等信号通路，维持其干性和自我更新能力。这种免疫微环境还会促进肿瘤起始细胞的上皮-间质转化（EMT），增强其迁移和侵袭能力。巨噬细胞分泌的TGF-β等细胞因子可以诱导肿瘤起始细胞发生EMT，使其获得间质细胞的特性，如表达波形蛋白（Vimentin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）等，同时失去上皮细胞的标志物，如E-钙黏蛋白（E-cadherin）。这些具有间质细胞特性的肿瘤起始细胞具有更强的迁移和侵袭能力，能够突破基底膜，进入血液循环，为肿瘤的远处转移奠定基础。4.2肝癌进展阶段4.2.1巨噬细胞对肿瘤细胞增殖与侵袭的促进在肝癌进展阶段，巨噬细胞对肿瘤细胞的增殖与侵袭发挥着显著的促进作用，这一过程涉及多种细胞因子、蛋白酶以及信号通路的协同作用。巨噬细胞分泌的细胞因子在促进肝癌细胞增殖方面扮演着关键角色。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是巨噬细胞分泌的重要细胞因子之一。在肝癌进展过程中，TNF-α可以通过与肝癌细胞表面的TNFR1受体结合，激活下游的NF-κB信号通路。NF-κB作为一种重要的转录因子，能够调节一系列与细胞增殖和抗凋亡相关的基因表达。激活后的NF-κB信号通路会促使c-Myc、CyclinD1等基因的表达上调，c-Myc是一种原癌基因，能够促进细胞的增殖和代谢；CyclinD1则是细胞周期蛋白，参与细胞周期的调控，其表达上调会加速细胞从G1期进入S期，从而促进肝癌细胞的增殖。研究表明，在肝癌细胞系中，添加TNF-α可以显著提高肝癌细胞的增殖速率，而使用TNF-α抑制剂则能够抑制肝癌细胞的增殖。巨噬细胞分泌的白细胞介素-6（IL-6）也能促进肝癌细胞的增殖。IL-6与肝癌细胞表面的IL-6R受体结合后，激活JAK-STAT3信号通路。STAT3进入细胞核后，能够调节相关基因的表达，促进肝癌细胞的增殖和存活。在肝癌患者的肿瘤组织中，IL-6的表达水平与肝癌细胞的增殖活性呈正相关。通过阻断IL-6/IL-6R信号轴，可以抑制肝癌细胞的增殖和肿瘤的生长。巨噬细胞分泌的蛋白酶在促进肝癌细胞侵袭和转移方面发挥着重要作用。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌离子依赖的内肽酶，能够降解细胞外基质（ECM）的成分。巨噬细胞分泌的MMP-2和MMP-9可以降解ECM中的胶原蛋白、层粘连蛋白等成分，破坏肿瘤细胞周围的基质屏障，为肝癌细胞的侵袭和转移创造条件。研究发现，在肝癌组织中，MMP-2和MMP-9的表达水平与肝癌细胞的侵袭能力呈正相关。通过抑制MMP-2和MMP-9的活性，可以显著降低肝癌细胞的侵袭和转移能力。巨噬细胞分泌的组织蛋白酶B（CathepsinB）也参与肝癌细胞的侵袭和转移过程。CathepsinB是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，能够降解ECM中的多种成分，还可以激活其他蛋白酶，如MMPs等。在肝癌细胞中，CathepsinB的表达水平升高，能够促进肝癌细胞的侵袭和转移。通过敲低CathepsinB的表达，可以抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力。巨噬细胞与肝癌细胞之间的相互作用还可以通过旁分泌信号通路促进肝癌细胞的增殖与侵袭。巨噬细胞分泌的血管内皮生长因子（VEGF）不仅能够促进肿瘤血管生成，还可以直接作用于肝癌细胞，促进其增殖和侵袭。VEGF与肝癌细胞表面的VEGFR受体结合后，激活下游的PI3K/Akt和MAPK信号通路。PI3K/Akt信号通路的激活可以抑制肝癌细胞的凋亡，促进其存活；MAPK信号通路的激活则可以促进肝癌细胞的增殖和迁移。研究表明，在肝癌细胞系中，添加VEGF可以显著提高肝癌细胞的增殖和侵袭能力，而使用VEGFR抑制剂则能够抑制肝癌细胞的这些生物学行为。巨噬细胞分泌的其他细胞因子，如血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）等，也可以通过与肝癌细胞表面的相应受体结合，激活相关信号通路，促进肝癌细胞的增殖与侵袭。4.2.2肿瘤血管生成与巨噬细胞的关系肿瘤血管生成在肝癌进展过程中起着关键作用，而巨噬细胞在这一过程中扮演着不可或缺的角色。中山大学肿瘤防治中心郑利民教授课题组的研究成果深入揭示了巨噬细胞促进肿瘤血管生成的机制。该课题组通过对肝癌组织的研究发现，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）能够分泌多种促血管生成因子，其中血管内皮生长因子（VEGF）是最为关键的因子之一。TAMs分泌的VEGF可以与血管内皮细胞表面的VEGFR受体结合，激活下游的信号通路，促进血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。在肝癌小鼠模型中，阻断TAMs分泌的VEGF，能够显著抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤的血液供应，从而抑制肿瘤的生长和转移。TAMs还可以通过分泌其他细胞因子和趋化因子，间接促进肿瘤血管生成。TAMs分泌的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能够刺激血管内皮细胞的增殖和迁移，促进血管新生。bFGF与血管内皮细胞表面的FGFR受体结合，激活下游的信号通路，调节细胞的增殖和分化。TAMs分泌的血小板衍生生长因子（PDGF）可以促进周细胞的募集和血管平滑肌细胞的增殖，增强血管的稳定性。PDGF与周细胞和血管平滑肌细胞表面的PDGFR受体结合，促进这些细胞的增殖和迁移，使其围绕在血管内皮细胞周围，形成稳定的血管结构。巨噬细胞还可以通过与血管内皮细胞的直接接触，促进肿瘤血管生成。巨噬细胞表面表达的一些黏附分子，如整合素等，能够与血管内皮细胞表面的相应配体结合，促进巨噬细胞与血管内皮细胞的相互作用。这种直接接触可以传递信号，促进血管内皮细胞的增殖和迁移。巨噬细胞还可以通过分泌一些细胞外囊泡，如外泌体等，将其中携带的蛋白质、核酸等生物活性物质传递给血管内皮细胞，调节其功能，促进肿瘤血管生成。肿瘤血管生成不仅为肿瘤细胞提供了充足的营养和氧气，还为肿瘤细胞的转移提供了途径。肿瘤细胞可以通过新生的血管进入血液循环，从而发生远处转移。巨噬细胞促进的肿瘤血管生成，使得肿瘤细胞更容易进入血液循环，增加了肝癌转移的风险。在肝癌患者中，肿瘤血管生成的程度与肿瘤的转移和预后密切相关。血管生成丰富的肝癌患者，其肿瘤更容易发生转移，预后也更差。4.3肝癌转移阶段4.3.1巨噬细胞协助肿瘤细胞的转移巨噬细胞在肝癌转移阶段与肿瘤细胞紧密协作，通过一系列复杂的机制协助肿瘤细胞突破基底膜、进入血液循环并在远处器官定植，这些过程涉及多种细胞因子、蛋白酶以及细胞间的相互作用。在肿瘤细胞突破基底膜的过程中，巨噬细胞分泌的蛋白酶发挥着关键作用。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类能够降解细胞外基质（ECM）成分的酶，巨噬细胞分泌的MMP-2和MMP-9可以特异性地降解基底膜中的胶原蛋白、层粘连蛋白等成分。这些成分的降解破坏了基底膜的完整性，为肿瘤细胞的迁移开辟了通道。在肝癌细胞系与巨噬细胞的共培养实验中，当巨噬细胞分泌的MMP-2和MMP-9活性被抑制时，肝癌细胞突破人工基底膜的能力显著下降。巨噬细胞还可以通过分泌组织蛋白酶B等其他蛋白酶，进一步降解ECM，增强对基底膜的破坏作用。组织蛋白酶B能够降解多种ECM成分，还可以激活MMPs，从而协同促进基底膜的降解。巨噬细胞与肿瘤细胞之间的直接接触也有助于肿瘤细胞突破基底膜。巨噬细胞表面表达的整合素等黏附分子，可以与肿瘤细胞表面的相应配体结合，形成细胞间的连接。这种连接不仅增强了巨噬细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，还为肿瘤细胞提供了迁移的支撑。巨噬细胞通过伸出伪足，与肿瘤细胞相互配合，帮助肿瘤细胞穿越被降解的基底膜。在肝癌组织的切片观察中，可以发现巨噬细胞与肿瘤细胞紧密相连，共同突破基底膜的现象。进入血液循环后，肿瘤细胞面临着免疫系统的攻击和血流的剪切力等挑战。巨噬细胞通过分泌细胞因子和趋化因子，帮助肿瘤细胞在血液循环中存活并逃避免疫监视。巨噬细胞分泌的白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）等免疫抑制因子，可以抑制T细胞和NK细胞等免疫细胞的活性。IL-10能够抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌，降低T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力；TGF-β则可以抑制NK细胞的活化和细胞毒性，使肿瘤细胞逃避NK细胞的攻击。巨噬细胞分泌的趋化因子，如CCL2、CCL5等，可以招募调节性T细胞（Tregs）到血液循环中。Tregs具有免疫抑制功能，能够抑制效应T细胞的活性，保护肿瘤细胞免受免疫攻击。在肝癌患者的血液样本中，发现Tregs的数量与巨噬细胞分泌的趋化因子水平呈正相关，且与肿瘤细胞的循环存活能力相关。巨噬细胞还可以通过形成肿瘤细胞-巨噬细胞聚集体，帮助肿瘤细胞在血液循环中稳定存在。肿瘤细胞与巨噬细胞通过表面的黏附分子相互结合，形成聚集体。这种聚集体可以降低肿瘤细胞受到的血流剪切力，减少肿瘤细胞的损伤和死亡。肿瘤细胞-巨噬细胞聚集体还可以利用巨噬细胞的免疫调节功能，逃避免疫系统的识别和攻击。在体外模拟血液循环的实验中，观察到肿瘤细胞-巨噬细胞聚集体的存活时间明显长于单独的肿瘤细胞。当肿瘤细胞到达远处器官并定植时，巨噬细胞同样发挥着重要作用。巨噬细胞可以提前到达远处器官，为肿瘤细胞的定植创造适宜的微环境。在肿瘤转移前，巨噬细胞会被肿瘤细胞分泌的趋化因子吸引到远处器官，如肺、肝、骨等。这些巨噬细胞在远处器官中分泌细胞因子和生长因子，促进局部组织的炎症反应和血管生成。巨噬细胞分泌的血管内皮生长因子（VEGF）可以促进血管生成，为肿瘤细胞提供营养和氧气；巨噬细胞分泌的细胞因子还可以调节局部免疫细胞的活性，抑制抗肿瘤免疫反应。在小鼠肝癌肺转移模型中，阻断巨噬细胞向肺部的募集，会显著减少肿瘤细胞在肺部的定植和转移瘤的形成。巨噬细胞还可以通过与肿瘤细胞的直接相互作用，促进肿瘤细胞在远处器官的黏附和定植。巨噬细胞表面的某些受体与肿瘤细胞表面的配体相互作用，增强了肿瘤细胞与远处器官组织的黏附能力。巨噬细胞分泌的细胞外基质成分，如纤维连接蛋白等，也可以为肿瘤细胞提供黏附的底物，促进肿瘤细胞在远处器官的定植。在肝癌肺转移的实验中，发现巨噬细胞与肿瘤细胞在肺部组织中紧密结合，肿瘤细胞通过与巨噬细胞的相互作用，成功黏附并定植在肺部组织中。4.3.2转移灶微环境中巨噬细胞的作用转移灶微环境中的巨噬细胞在肝癌转移瘤的生长和存活过程中扮演着至关重要的角色，其表型和功能的变化对肿瘤的发展产生着深远影响。转移灶微环境中的巨噬细胞呈现出独特的表型特征。在肝癌转移灶中，巨噬细胞主要以M2型巨噬细胞为主。M2型巨噬细胞表面高表达甘露糖受体CD206、清道夫受体CD163等标志物。这些标志物的高表达反映了M2型巨噬细胞在转移灶微环境中的功能特点。CD206参与巨噬细胞对糖蛋白和糖脂的识别和摄取，可能在巨噬细胞与肿瘤细胞的相互作用以及对肿瘤微环境中物质的清除和代谢中发挥作用。CD163则主要参与巨噬细胞对血红蛋白-结合珠蛋白复合物的摄取和代谢，其高表达可能与转移灶微环境中的铁代谢调节以及免疫调节有关。M2型巨噬细胞还分泌大量的免疫抑制因子和促肿瘤生长因子，如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）等。巨噬细胞在转移灶微环境中的功能主要体现在促进肿瘤生长和抑制免疫反应两个方面。在促进肿瘤生长方面，巨噬细胞分泌的VEGF可以促进转移灶内的血管生成。VEGF与血管内皮细胞表面