巯嘌呤键连卟啉抗癌药物：合成、表征与生物活性的深度探究

巯嘌呤键连卟啉抗癌药物：合成、表征与生物活性的深度探究一、绪论1.1研究背景与意义1.1.1癌症现状与抗癌药物的重要性癌症，作为全球范围内严重威胁人类健康的重大疾病，其发病率和死亡率长期居高不下，给社会和家庭带来了沉重的负担。2024年4月4日，影响因子排名第一的CA杂志发布的全球癌症统计报告指出，约五分之一的人一生中会罹患癌症，约九分之一的男性和十二分之一的女性会死于癌症。据估计，2022年全球新发癌症病例接近2000万（若包括非黑色素瘤皮肤癌，新发癌症病例为1996万；若不包括非黑色素瘤皮肤癌，为1873万），全球癌症死亡数约970万（若包括非黑色素瘤皮肤癌，为974万；不包括非黑色素瘤皮肤癌，为967万）。肺癌是全球最常发生的癌症，占总新发病例的12.4%，同时也是癌症死亡的首要原因，占癌症死亡总数的18.7%。另一项发表于2021年12月30日《JAMAOncology》的研究显示，2019年全球204个国家/地区中，新发癌症患者估计2360万（95%UI：2220-2490万），癌症死亡病例数估计1000万（95%UI：936-1060万）。从2010年到2019年，新发癌症病例从1870万增加到2360万，数量增加了26.3%；癌症死亡病例数从829万增加到1000万，数量增加了20.9%。更令人担忧的是，根据2024年11月5日发表于《JAMANetworkOpen》的研究预测，与2022年相比，到2050年全球癌症病例将增加76.6%，癌症死亡人数将增加89.7%。当前，癌症的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗等。手术治疗对于早期癌症患者具有较好的疗效，但对于中晚期癌症患者，往往难以彻底清除癌细胞，且手术创伤较大，恢复时间长。放疗通过高能射线杀死癌细胞，但在治疗过程中也会对周围正常组织造成一定的损伤。化疗则是使用化学药物来抑制或杀死癌细胞，然而传统化疗药物缺乏特异性，在攻击癌细胞的同时，也会对正常细胞产生毒性作用，导致患者出现一系列严重的副作用，如脱发、恶心、呕吐、免疫力下降等，严重影响患者的生活质量。因此，开发新型抗癌药物迫在眉睫。新型抗癌药物不仅能够提高癌症的治疗效果，延长患者的生存期，还能降低药物的毒副作用，提高患者的生活质量。在当前的医疗环境下，寻找高效、低毒、具有特异性靶向作用的抗癌药物，已成为医药领域研究的核心目标和重要方向，对于攻克癌症这一医学难题具有至关重要的意义。1.1.2巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的独特优势巯嘌呤键连卟啉抗癌药物作为一类新型的抗癌药物，近年来受到了广泛的关注。巯嘌呤是一种重要的天然产物，具有广泛的生物活性，在药物领域被应用于许多疾病的治疗，尤其是在肿瘤治疗方面。其分子结构中含有一个巯基（-SH）和一个嘌呤环，巯基是发挥抗肿瘤作用的关键结构，通过与肿瘤细胞DNA结合，干扰DNA复制和转录，从而抑制肿瘤细胞的增殖。研究表明，巯嘌呤对多种肿瘤细胞具有抑制作用，如白血病、淋巴瘤、肺癌等。卟啉是一类具有特殊芳香环结构的重要天然产物，在生物体内参与多种重要的生理过程。卟啉及其衍生物具有良好的光物理和光化学性质，在光动力学治疗、荧光成像等领域展现出巨大的应用潜力。在癌症治疗中，卟啉可以作为光敏剂，在特定波长的光照射下，产生单线态氧等活性氧物种，从而杀死癌细胞。将巯嘌呤与卟啉通过化学键连接形成的巯嘌呤键连卟啉抗癌药物，整合了两者的优势，展现出相较于传统抗癌药物的独特特性。在靶向性方面，卟啉具有良好的肿瘤靶向性，能够通过被动靶向（如增强的渗透和滞留效应，EPR效应）和主动靶向（如修饰靶向配体）等方式，特异性地富集于肿瘤组织。将巯嘌呤连接到卟啉上，可以使巯嘌呤更精准地到达肿瘤细胞，提高药物在肿瘤部位的浓度，增强对肿瘤细胞的杀伤作用，同时减少对正常组织的损伤，降低药物的毒副作用。在抗肿瘤活性上，巯嘌呤和卟啉之间可能存在协同作用。巯嘌呤通过干扰肿瘤细胞的DNA合成和代谢发挥抗癌作用，卟啉则可以通过光动力学效应产生活性氧物种破坏肿瘤细胞的结构和功能。两者结合后，可能从多个途径抑制肿瘤细胞的生长及扩散，增强抗肿瘤效果。相关研究表明，巯嘌呤键连卟啉抗癌药物在体外细胞实验和动物模型中，对多种肿瘤细胞系均表现出较高的细胞毒性和抑制肿瘤细胞增殖的能力。巯嘌呤键连卟啉抗癌药物还可能具有一些其他潜在的优势，如良好的生物相容性和可修饰性。通过对卟啉环和巯嘌呤结构的合理修饰，可以进一步优化药物的性能，如调节药物的溶解性、稳定性、靶向性和抗癌活性等，以满足不同的治疗需求。这种新型抗癌药物在癌症治疗领域具有广阔的潜在应用价值，有望为癌症患者带来新的治疗选择和希望。1.2研究目的与内容本研究旨在深入探究巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的特性，通过一系列实验和分析，为其在癌症治疗领域的应用提供坚实的理论与实践基础。具体而言，研究内容涵盖以下几个关键方面：设计并合成巯嘌呤键连卟啉化合物：依据巯嘌呤和卟啉的结构特点以及药物设计原理，精心设计出一系列巯嘌呤键连卟啉化合物。综合考虑反应条件、原料选择和合成路线的可行性，运用化学合成方法，通过多步反应将巯嘌呤与卟啉连接起来。在合成过程中，严格控制反应条件，如温度、反应时间、反应物比例等，以确保化合物的纯度和产率。结构表征：利用核磁共振（NMR）技术，通过分析化合物中氢原子、碳原子等的化学位移、耦合常数等信息，确定分子中原子的连接方式和空间结构。运用质谱（MS）仪精确测定化合物的分子量，根据碎片离子的信息推断分子的结构和裂解方式。结合红外光谱（IR）分析化合物中官能团的振动吸收峰，确定分子中存在的化学键和官能团。通过这些手段，对合成得到的巯嘌呤键连卟啉化合物进行全面、准确的结构表征，为后续研究提供可靠的结构信息。细胞毒性检测：运用细胞培养技术，选择人类肝癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤细胞系作为研究对象，将不同浓度的巯嘌呤键连卟啉化合物加入到细胞培养体系中。采用MTT法，利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），而死细胞无此功能的原理，通过检测甲瓒的生成量来反映细胞的存活数量和活性，从而检测化合物对肿瘤细胞的细胞毒性。设置阳性药物对照组，如常用的抗癌药物顺铂等，对比分析巯嘌呤键连卟啉化合物与阳性药物对细胞的作用差异。体外活性评价：通过细胞计数法，在不同时间点对加入化合物后的肿瘤细胞进行计数，绘制细胞生长曲线，直观地评估巯嘌呤键连卟啉化合物对肿瘤细胞增殖的抑制能力。检测细胞凋亡相关指标，如细胞凋亡率、凋亡蛋白的表达等，深入探究化合物诱导肿瘤细胞凋亡的机制。利用Transwell实验，将肿瘤细胞接种在上室，下室加入含或不含化合物的培养液，观察细胞穿过微孔膜迁移到下室的数量，以此评价化合物对肿瘤细胞迁移能力的影响。1.3国内外研究现状1.3.1巯嘌呤的研究进展巯嘌呤作为一种重要的抗代谢药物，在癌症治疗领域的研究历史悠久。其作用机制主要是通过干扰DNA和RNA的合成，抑制肿瘤细胞的增殖。在白血病治疗中，巯嘌呤是常用的一线药物之一，对急性淋巴细胞白血病和慢性粒细胞白血病的维持治疗效果显著。一项发表于《新英格兰医学杂志》的研究表明，巯嘌呤联合甲氨蝶呤用于儿童急性淋巴细胞白血病的维持治疗，可显著提高患者的无事件生存率和总生存率。随着研究的深入，巯嘌呤在其他癌症治疗中的应用也逐渐被探索。有研究报道，巯嘌呤在淋巴瘤、绒毛膜上皮癌等疾病的治疗中也具有一定的疗效。在合成方法上，早期主要采用化学合成法，以嘌呤或嘧啶为原料，通过多步反应引入巯基。近年来，为了提高合成效率和产率，一些新的合成技术和方法不断涌现，如微波辅助合成、固相合成等。微波辅助合成技术能够显著缩短反应时间，提高反应产率，为巯嘌呤及其衍生物的合成提供了新的思路。1.3.2卟啉的研究进展卟啉类化合物因其独特的结构和性质，在光动力学治疗、荧光成像、催化等多个领域展现出广泛的应用前景。在光动力学治疗癌症方面，卟啉作为光敏剂，在特定波长光的照射下，能够产生单线态氧等活性氧物种，从而破坏肿瘤细胞的结构和功能。大量的研究致力于开发新型卟啉光敏剂，以提高其光动力学治疗效果。通过对卟啉分子结构的修饰，如引入不同的取代基、改变卟啉环的共轭结构等，可以调节卟啉的光物理性质、肿瘤靶向性和生物相容性。研究发现，将靶向基团如叶酸、抗体等连接到卟啉上，可以实现卟啉对肿瘤细胞的主动靶向，提高光动力学治疗的特异性。在合成方法上，卟啉的合成主要包括经典的Adler法、Lindsey法等。Adler法是通过吡咯与醛在酸催化下反应合成卟啉，该方法操作简单，但产率较低。Lindsey法则在较温和的条件下进行，产率相对较高，且能够合成结构复杂的卟啉衍生物。1.3.3巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的研究进展巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的研究相对较新，是近年来抗癌药物研究的热点之一。国内外学者通过不同的连接方式将巯嘌呤和卟啉结合起来，合成了一系列新型化合物，并对其生物活性进行了研究。在合成方法上，常见的策略是利用巯嘌呤上的活性基团（如巯基、氨基等）与卟啉上的官能团（如羧基、卤代烃基等）发生化学反应，形成稳定的化学键。有研究报道通过将巯嘌呤的巯基与卟啉的溴代烷基反应，成功合成了巯嘌呤键连卟啉化合物。在生物活性研究方面，已有的研究表明，这类化合物对多种肿瘤细胞系表现出较好的细胞毒性和抑制肿瘤细胞增殖的能力。一项体外细胞实验显示，巯嘌呤键连卟啉化合物对肝癌细胞HepG2的IC50值明显低于单独使用巯嘌呤或卟啉，表明两者结合后具有协同抗癌作用。一些研究还发现，该类化合物具有良好的肿瘤靶向性，能够通过EPR效应等机制在肿瘤组织中富集，提高药物在肿瘤部位的浓度。1.3.4当前研究的不足与本研究的切入点尽管巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的研究取得了一定的进展，但仍存在一些不足之处。目前合成方法的产率和纯度有待进一步提高，合成路线较为复杂，反应条件较为苛刻，不利于大规模制备。在生物活性研究方面，虽然已证实该类化合物具有较好的抗癌活性，但对其作用机制的研究还不够深入，尤其是巯嘌呤和卟啉之间协同作用的分子机制尚不明确。针对这些问题，本研究拟从以下几个方面展开：一是优化合成路线，探索更加温和、高效的合成方法，提高化合物的产率和纯度；二是深入研究巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的作用机制，通过细胞生物学、分子生物学等手段，揭示其在细胞内的作用靶点和信号传导通路，为药物的进一步优化和临床应用提供理论依据。二、相关理论基础2.1巯嘌呤的结构与性质2.1.1化学结构巯嘌呤（Mercaptopurine），化学名为6-巯基嘌呤，分子式为C_5H_4N_4S，分子量为152.177。其分子结构由一个嘌呤环和一个巯基（-SH）组成，嘌呤环是由一个嘧啶环和一个咪唑环稠合而成，具有芳香性。巯基连接在嘌呤环的6位碳原子上，这种结构赋予了巯嘌呤独特的化学和生物学性质。巯嘌呤的化学结构使其能够与生物分子中的多种基团发生相互作用，尤其是巯基的存在，使其具有较强的亲核性，能够参与多种化学反应，这在其发挥药理作用的过程中起着关键作用。2.1.2物理化学性质从外观上看，巯嘌呤通常为黄色结晶性粉末，无臭，味微甜。在溶解性方面，它在水或乙醇中极微溶解，在乙醚中几乎不溶。这种溶解性特点与分子的结构和极性有关，嘌呤环的芳香性和疏水性使得分子在极性较小的有机溶剂中溶解性较差，而巯基的存在虽然增加了一定的极性，但整体上仍不足以使其在水中具有良好的溶解性。遇光易变色是巯嘌呤的一个重要性质，这是由于其分子结构在光的作用下可能发生变化，导致其化学性质和外观发生改变。在140℃时，巯嘌呤会失去结晶水，这一特性在其制备和储存过程中需要特别注意，温度的控制对于保持其化学结构和活性至关重要。此外，它易溶于碱性水溶液，但在碱性条件下不稳定，会缓慢水解。这是因为碱性环境会促进巯基的解离，使分子结构变得不稳定，进而发生水解反应。在空气中光照时，巯嘌呤会变成黑色，这进一步表明其对光和空气的敏感性，在储存和使用过程中需要采取避光、密封等措施。2.1.3生物活性及作用机制抗肿瘤活性：巯嘌呤是一种重要的抗代谢抗肿瘤药物，其主要作用机制是干扰DNA和RNA的合成。它进入体内后，在细胞内被磷酸核糖转移酶转化为6-巯基嘌呤核糖核苷酸，该活性代谢产物能够竞争性地抑制次黄嘌呤的转变过程。具体来说，它通过负反馈作用抑制酰胺转移酶，阻止1-焦磷酸-5-磷酸核糖（PRPP）转为1-氨基-5-磷酸核糖（PRA），从而干扰嘌呤核苷酸合成的起始阶段。巯嘌呤还能抑制次黄嘌呤核苷酸转为腺嘌呤核苷酸及次黄嘌呤核苷酸转为黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸的过程。它还抑制辅酶I（NAD+）的合成，并减少生物合成DNA所必需的脱氧三磷酸腺苷（dATP）及脱氧三磷酸鸟苷（dGTP），使肿瘤细胞的DNA和RNA合成受阻，从而抑制肿瘤细胞的增殖。巯嘌呤对处于S增殖周期的细胞较为敏感，除了抑制细胞DNA的合成外，对细胞RNA的合成也有轻度的抑制作用。免疫调节作用：除了抗肿瘤作用外，巯嘌呤还具有一定的免疫调节活性。它可以抑制淋巴细胞的增殖和功能，从而调节免疫系统的反应。在一些自身免疫性疾病的治疗中，巯嘌呤被用于抑制过度活跃的免疫系统，减轻炎症反应。其免疫调节机制可能与干扰淋巴细胞内的核酸合成有关，影响淋巴细胞的活化、增殖和分化过程。抗病毒活性：有研究表明，巯嘌呤在一定程度上还具有抗病毒活性。它可以通过干扰病毒的核酸合成过程，抑制病毒的复制和传播。在某些病毒感染的治疗中，巯嘌呤可能作为辅助药物发挥作用。其抗病毒的具体作用机制还需要进一步深入研究，但推测与它对核酸合成的干扰作用密切相关，通过抑制病毒在宿主细胞内的核酸合成，从而达到抗病毒的效果。2.2卟啉的结构与性质2.2.1化学结构卟啉（Porphyrin）是一类由四个吡咯环通过次甲基（-CH=）桥连接而成的具有大共轭体系的杂环化合物。其基本骨架结构为卟吩（Porphine），卟吩分子中的18个π电子形成了一个高度共轭的平面大环结构，这种共轭结构赋予了卟啉独特的物理和化学性质。卟吩环上有20个位置可以被取代基取代，通过引入不同的取代基，如烷基、芳基、羧基、氨基等，可以得到多种多样的卟啉衍生物，这些衍生物在结构和性质上表现出很大的差异，从而满足不同的应用需求。在卟啉分子中，中心的四个氮原子可以与金属离子配位形成金属卟啉配合物。常见的金属离子有铁（Fe）、镁（Mg）、锌（Zn）、钴（Co）等。以血红素为例，它是一种铁卟啉配合物，铁离子位于卟啉环的中心，与四个氮原子配位，这种结构使得血红素在生物体内能够有效地运输氧气。叶绿素则是一种镁卟啉配合物，镁离子与卟啉环配位，在光合作用中起着关键作用。金属离子的引入不仅改变了卟啉的电子结构和光学性质，还赋予了金属卟啉配合物特殊的生物活性和催化性能。2.2.2光学性质卟啉及其衍生物具有独特的光学性质，在紫外-可见光谱（UV-Vis）区域有明显的吸收峰。其中，Soret带（又称B带）是卟啉的特征吸收带，位于紫外光区（约390-430nm），是由卟啉分子的π-π跃迁引起的，吸收强度非常大。Q带位于可见光区（约500-700nm），是由卟啉分子的n-π跃迁引起的，吸收强度相对较弱。这些吸收带的位置和强度会受到卟啉分子结构、取代基以及与金属离子配位等因素的影响。当卟啉分子中引入吸电子基团时，Soret带和Q带会发生红移；而引入供电子基团时，吸收带则会发生蓝移。与金属离子配位后，卟啉的吸收光谱也会发生明显变化。在荧光光谱方面，卟啉在受到特定波长的光激发后，会发射出荧光。其荧光发射峰通常位于600-800nm的近红外区域。卟啉的荧光量子产率是衡量其荧光发射效率的重要参数，不同结构的卟啉及其衍生物的荧光量子产率有所不同。一些卟啉衍生物通过结构修饰，可以提高其荧光量子产率，使其在荧光成像等领域具有更好的应用效果。卟啉的荧光寿命也是其重要的光学参数之一，它反映了卟啉分子在激发态的平均停留时间。通过测量卟啉的荧光寿命，可以了解其分子结构和所处环境的信息。2.2.3在肿瘤细胞中的富集作用卟啉及其衍生物对肿瘤细胞具有特殊的亲和力，能够在肿瘤细胞中大量富集，这一特性使得它们在肿瘤诊断和治疗中具有重要的应用价值。其富集机制主要包括以下几个方面：增强的渗透和滞留效应（EPR效应）：肿瘤组织的血管结构与正常组织不同，具有高通透性和不完善的淋巴回流系统。卟啉及其衍生物作为相对较大的分子，能够通过肿瘤血管的高通透性进入肿瘤组织间隙，并由于淋巴回流不畅而在肿瘤组织中滞留，从而实现被动靶向富集。研究表明，许多卟啉类光敏剂在肿瘤组织中的浓度明显高于正常组织，这为光动力学治疗提供了有利条件。主动靶向作用：通过对卟啉分子进行修饰，连接上具有靶向性的配体，如叶酸、抗体、多肽等，可以实现对肿瘤细胞的主动靶向。叶酸受体在许多肿瘤细胞表面高表达，将叶酸连接到卟啉上，叶酸与肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性结合，从而使卟啉能够特异性地富集到肿瘤细胞上。利用抗体与肿瘤细胞表面抗原的特异性结合，也可以实现卟啉对肿瘤细胞的主动靶向富集。与肿瘤细胞内生物分子的相互作用：卟啉分子还可以通过与肿瘤细胞内的生物分子，如蛋白质、核酸等发生相互作用，从而在肿瘤细胞内富集。卟啉可以与肿瘤细胞内的某些蛋白质结合，形成稳定的复合物，导致卟啉在肿瘤细胞内的浓度升高。卟啉与核酸之间也可能存在相互作用，影响核酸的结构和功能，同时实现卟啉在肿瘤细胞内的富集。2.2.4光动力学治疗癌症的作用机理光动力学治疗（PhotodynamicTherapy，PDT）是利用光敏剂在特定波长光的照射下，产生单线态氧等活性氧物种，从而杀死癌细胞的一种治疗方法。卟啉作为一类重要的光敏剂，在光动力学治疗中发挥着关键作用。其作用机理主要包括以下几个步骤：光敏剂的吸收和激发：卟啉分子在肿瘤细胞中富集后，吸收特定波长的光，从基态跃迁到激发态。这个过程中，卟啉分子吸收光子的能量，使分子中的电子从低能级轨道跃迁到高能级轨道。能量转移和活性氧生成：处于激发态的卟啉分子通过系间窜越过程，从单线态激发态转变为三线态激发态。三线态激发态的卟啉分子具有较长的寿命，能够与周围的氧分子发生能量转移，将能量传递给氧分子，使氧分子从基态的三线态转变为单线态，生成单线态氧（^1O_2）。单线态氧是一种具有强氧化性的活性氧物种，其氧化能力比基态氧分子强得多。细胞损伤和死亡：生成的单线态氧能够与肿瘤细胞内的生物分子，如蛋白质、核酸、脂质等发生氧化反应，破坏这些生物分子的结构和功能。单线态氧可以氧化蛋白质中的氨基酸残基，导致蛋白质变性失活；氧化核酸中的碱基，引起DNA损伤和基因突变；氧化脂质中的不饱和脂肪酸，导致细胞膜的结构和功能受损。这些损伤最终导致肿瘤细胞凋亡、坏死或自噬，从而达到治疗癌症的目的。2.2.5体内代谢过程卟啉在体内的代谢过程较为复杂，涉及多个器官和生物转化途径。当卟啉进入体内后，首先会通过血液循环分布到各个组织和器官。在肝脏中，卟啉会被肝细胞摄取，一部分卟啉可能会被代谢酶代谢，如细胞色素P450酶系等。这些酶可以对卟啉进行氧化、还原、水解等生物转化反应，改变卟啉的结构和性质，使其更易于排出体外。卟啉还可能通过胆汁排泄到肠道中。在肠道中，卟啉可能会被肠道菌群进一步代谢，或者直接随粪便排出体外。一部分卟啉也可能通过肾脏排泄到尿液中。肾脏通过肾小球的滤过和肾小管的重吸收等过程，将卟啉及其代谢产物排出体外。不同结构的卟啉在体内的代谢速度和途径可能会有所不同。一些水溶性较好的卟啉可能更容易通过肾脏排泄，而脂溶性较高的卟啉则可能更多地通过胆汁排泄。2.3药物合成与表征的基本原理2.3.1药物合成的常见反应类型药物合成涉及多种类型的化学反应，这些反应是构建药物分子结构的基础。卤化反应是向有机化合物分子中引入卤素原子的反应，根据反应底物和反应条件的不同，可分为饱和烷烃的取代卤化、不饱和烃的加成卤化、芳香环上的卤取代等。在制备含卤素的有机药物时，卤化反应起着关键作用，如通过不饱和烃与卤素的加成反应，可以合成具有特定生理活性的卤代烃药物。烃化反应是有机物分子中C、N、O等原子被烃基取代的反应，按反应历程可分为SN1、SN2和亲电取代反应。从烃化剂的种类来看，常用的有卤代烷、硫酸酯、磺酸酯、醇、烯烃、环氧烷等。在药物合成中，烃化反应常用于引入特定的烃基结构，改变药物分子的理化性质和生物活性。以丁卡因的合成为例，通过对普鲁卡因进行烃化反应，引入特定的烃基，使其药效提高到普鲁卡因的10倍。酰化反应是在有机化合物分子中引入酰基的反应，常用的酰化试剂包括羧酸、羧酸衍生物（如酰卤、酸酐、酯等）和其他酰化剂。氧原子的酰化反应是形成羧酸酯的反应，包括羧酸的酯化反应和羧酸衍生物的醇解反应。酰化反应在药物合成中可用于修饰药物分子的官能团，改善药物的稳定性、溶解性和生物利用度等。缩合反应是两个或多个有机化合物分子通过反应形成一个较大分子的反应，同时伴有小分子（如水、醇、氨等）的生成。羟醛缩合是一种重要的缩合反应，含有α-H的醛或酮，在碱或酸的催化作用下生成β-羟基醛或β-羟基酮。这种反应在药物分子骨架的构建中具有重要应用，能够形成复杂的碳-碳键结构。氧化反应和还原反应是改变有机化合物分子中原子氧化态的反应。氧化反应是使有机化合物分子中某原子的氧化态升高的反应，常用的氧化剂包括高锰酸钾、过氧化氢、铬酸等。还原反应则是使有机化合物分子中某原子的氧化态降低的反应，常用的还原剂有氢气（需催化剂）、氢化铝锂、硼氢化钠等。在药物合成中，氧化反应和还原反应可用于引入或转化特定的官能团，构建药物分子的结构。2.3.2药物合成路线设计的基本原则药物合成路线设计是药物研发过程中的关键环节，需要综合考虑多个因素，以确保合成路线的可行性、高效性和经济性。在选择原料时，应优先选用来源广泛、价格低廉、易于获取的原料。这样不仅可以降低生产成本，还能保证原料的可持续供应。以常见的药物合成原料乙醇为例，它来源丰富，价格相对较低，在许多药物合成反应中被广泛应用。反应步骤应尽可能简短，以减少合成过程中的副反应和杂质生成，同时提高合成效率。每增加一步反应，都可能引入新的杂质，增加分离和纯化的难度。因此，在设计合成路线时，应尽量避免不必要的反应步骤，采用简洁高效的合成策略。反应条件应温和，避免使用高温、高压、强酸、强碱等极端条件。温和的反应条件有利于减少设备投资和操作风险，同时也能提高反应的选择性和产率。在某些药物合成反应中，通过优化反应条件，采用温和的催化剂和适宜的反应温度、压力等，可以在保证反应顺利进行的同时，减少对设备的要求和对环境的影响。高选择性和高产率是药物合成路线设计的重要目标。选择性高的反应可以减少副产物的生成，简化后续的分离和纯化过程；高产率则可以提高药物的生产效率，降低生产成本。在设计合成路线时，应选择具有高选择性和高产率的反应，并通过优化反应条件进一步提高选择性和产率。合成路线还应考虑绿色化学的要求，减少对环境的影响。这包括使用绿色溶剂、减少废弃物的产生、提高原子利用率等。绿色溶剂如乙醇、水等，具有低毒性、易回收等优点；提高原子利用率可以使反应物尽可能多地转化为目标产物，减少废弃物的生成。2.3.3核磁共振技术在药物结构表征中的应用原理核磁共振（NuclearMagneticResonance，NMR）技术是药物结构表征中不可或缺的手段，其基本原理基于原子核的自旋特性。许多原子核，如氢原子核（^1H）、碳原子核（^{13}C）等，都具有自旋角动量，在磁场中会产生不同的能级。当原子核处于外磁场中时，会发生能级分裂，形成不同的自旋取向。此时，若向体系施加特定频率的射频脉冲，当射频脉冲的能量等于原子核不同自旋取向的能级差时，原子核会吸收射频脉冲的能量，从低能级跃迁到高能级，这种现象称为核磁共振。在药物结构表征中，^1HNMR谱提供了关于药物分子中氢原子的信息。化学位移是^1HNMR谱中的重要参数，它反映了氢原子在分子中的化学环境。不同化学环境的氢原子，由于受到周围电子云密度和邻近原子的影响不同，其化学位移值也不同。通过分析化学位移，可以确定药物分子中不同类型氢原子的存在，如甲基氢、亚甲基氢、芳环氢等。耦合常数则反映了相邻氢原子之间的相互作用，通过分析耦合常数，可以确定氢原子之间的连接方式和相对位置。积分面积与氢原子的数目成正比，通过积分面积的测量，可以确定不同类型氢原子的相对数目。^{13}CNMR谱主要提供药物分子中碳原子的信息。与^1HNMR类似，^{13}C的化学位移也反映了碳原子的化学环境。由于^{13}C的天然丰度较低，^{13}CNMR谱的灵敏度相对较低，但它在确定药物分子的骨架结构和碳原子的连接方式方面具有重要作用。通过^{13}CNMR谱，可以确定药物分子中不同类型碳原子的存在，如饱和碳原子、不饱和碳原子、羰基碳原子等。2.3.4质谱仪在药物结构鉴定中的原理与应用质谱（MassSpectrometry，MS）仪是另一种重要的药物结构鉴定工具，其基本原理是将药物分子离子化，然后根据离子的质荷比（m/z）对离子进行分离和检测。在质谱仪中，药物分子首先被引入离子源，通过电子轰击、化学电离、电喷雾电离等方式离子化，形成带正电荷或负电荷的离子。这些离子在电场和磁场的作用下，按照质荷比的大小进行分离。质量分析器是质谱仪的核心部件，它能够精确测量离子的质荷比。检测器则用于检测经过质量分析器分离后的离子，并将其转化为电信号，最终得到质谱图。在药物结构鉴定中，质谱仪可以提供药物分子的分子量信息。通过测量分子离子峰的质荷比，可以确定药物分子的精确分子量，这对于确定药物分子的分子式和结构具有重要意义。质谱仪还可以通过分析碎片离子的质荷比和相对丰度，推断药物分子的结构和裂解方式。当药物分子在离子源中离子化后，会发生裂解，产生各种碎片离子。这些碎片离子的结构和相对丰度与药物分子的结构密切相关。通过对碎片离子的分析，可以了解药物分子中化学键的断裂方式和分子的结构特征。在鉴定巯嘌呤键连卟啉化合物的结构时，质谱仪可以准确测定其分子量，确定分子中巯嘌呤和卟啉部分的连接方式。通过对碎片离子的分析，可以推断出化合物在裂解过程中巯嘌呤和卟啉结构的变化，从而进一步确定化合物的结构。2.4细胞实验与生物活性评价方法2.4.1细胞培养技术细胞培养技术是进行细胞实验的基础，其过程需严格遵循无菌操作原则，以确保细胞在适宜的环境中生长和繁殖。在本研究中，选用了多种常见的肿瘤细胞株，如人类肝癌细胞株HepG2、胃癌细胞株SGC-7901和肺癌细胞株A549等，这些细胞株在癌症研究中具有广泛的应用，能够较好地反映巯嘌呤键连卟啉抗癌药物对不同类型肿瘤细胞的作用效果。针对不同的肿瘤细胞株，培养条件存在一定差异。HepG2细胞通常使用含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培养基进行培养，培养环境为37℃、5%CO₂的恒温培养箱。胎牛血清为细胞提供了生长所需的营养物质、生长因子和激素等，对维持细胞的正常生长和代谢至关重要。DMEM培养基则含有细胞生长所需的氨基酸、维生素、葡萄糖等成分，能够满足HepG2细胞的营养需求。SGC-7901细胞的培养使用含10%FBS的RPMI1640（RoswellParkMemorialInstitute1640）培养基，同样置于37℃、5%CO₂的培养箱中。RPMI1640培养基特别适合悬浮细胞和贴壁细胞的生长，为SGC-7901细胞提供了适宜的生存环境。A549细胞培养采用含10%FBS的F-12K培养基，培养条件与上述细胞相同。F-12K培养基营养成分丰富，能够支持A549细胞的正常生长和增殖。在细胞培养过程中，有诸多注意事项。无菌操作是关键，整个操作过程需在超净工作台中进行，使用的所有器材，如培养瓶、吸管、移液器枪头、培养基等都需经过严格的灭菌处理，以防止微生物污染细胞。细胞传代时，需掌握合适的时机，当细胞生长至对数生长期，且汇合度达到80%-90%时，应及时进行传代，以避免细胞因过度生长而出现老化、死亡等现象。传代过程中，需使用胰蛋白酶消化细胞，消化时间要严格控制，时间过短细胞不易从培养瓶壁脱落，时间过长则会对细胞造成损伤。培养基的更换频率也很重要，一般每2-3天更换一次培养基，以保证细胞生长环境中营养物质的充足供应，并及时去除细胞代谢产生的废物。在观察细胞生长状态时，可使用倒置显微镜，定期观察细胞的形态、密度和生长情况，如发现细胞形态异常、生长缓慢或出现污染迹象，应及时采取相应措施。2.4.2MTT法检测细胞毒性MTT法是一种广泛应用于检测细胞毒性的方法，其原理基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将黄色的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）还原为不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），而死细胞无此功能。因此，通过检测甲瓒的生成量，可间接反映细胞的存活数量和活性。MTT法的操作步骤较为严谨。首先，将对数生长期的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化后，制备成单细胞悬液，然后用含10%胎牛血清的培养基将细胞悬液稀释至合适浓度，以每孔1000-10000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入200μL细胞悬液。接种细胞时，需确保细胞悬液均匀分布在孔板中，可轻轻晃动孔板使细胞分散均匀。将96孔板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。这一步是为了让细胞在孔板中稳定生长，以便后续实验的进行。培养24小时后，吸去孔板中的原培养基，加入含有不同浓度巯嘌呤键连卟啉化合物的新鲜培养基，同时设置对照组，对照组加入等体积的不含药物的培养基。药物浓度的设置通常采用倍比稀释法，如从高浓度开始，依次稀释为100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L等，每个浓度设置3-5个复孔，以减少实验误差。将96孔板继续放入培养箱中培养48小时，使药物与细胞充分作用。在培养过程中，需注意培养箱的温度和CO₂浓度的稳定，避免对细胞生长产生影响。48小时后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制，pH=7.4），继续孵育4小时。MTT溶液需现用现配，配制后需过滤除菌，并避光保存，以保证其活性。孵育结束后，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需先离心（1000rpm，5分钟）后再吸弃上清液。然后每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10分钟，使结晶物充分溶解。DMSO具有较强的溶解性，能够将甲瓒溶解，以便后续检测。最后，选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值（OD值）。酶联免疫监测仪在使用前需进行校准和调试，确保测量结果的准确性。记录各孔的OD值后，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。通过比较实验组和对照组的OD值，计算细胞存活率，公式为：细胞存活率（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。根据细胞存活率可评估巯嘌呤键连卟啉化合物对肿瘤细胞的细胞毒性，IC₅₀值（半数抑制浓度）是衡量药物细胞毒性的重要指标，即能抑制50%细胞生长的药物浓度，可通过软件拟合曲线计算得出。2.4.3体外抑制肿瘤细胞增殖和迁移能力的评价方法评价细胞增殖能力对于深入了解巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的作用机制至关重要，可通过多种方法实现。细胞计数是一种直观的评价方法，在不同时间点（如24小时、48小时、72小时）对加入化合物后的肿瘤细胞进行计数。具体操作时，将细胞从培养瓶中消化下来，制成单细胞悬液，然后用血细胞计数板在显微镜下进行计数。以细胞数量为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线，通过观察曲线的斜率和趋势，可直观地评估药物对肿瘤细胞增殖的抑制能力。如果药物能够有效抑制细胞增殖，细胞生长曲线会呈现出较平缓的趋势，细胞数量增长缓慢。检测细胞凋亡相关指标也是评价细胞增殖能力的重要手段。细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，当细胞受到药物作用时，可能会引发凋亡过程。常用的检测指标包括细胞凋亡率和凋亡蛋白的表达。细胞凋亡率可通过流式细胞术进行检测，将细胞用AnnexinV-FITC/PI（异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V/碘化丙啶）双染试剂染色，AnnexinV-FITC能够与凋亡早期细胞膜表面暴露的磷脂酰丝氨酸特异性结合，PI则可穿透死亡细胞的细胞膜，对细胞核进行染色。通过流式细胞仪检测不同荧光强度的细胞群体，可区分出正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞，从而计算出细胞凋亡率。凋亡蛋白的表达水平可通过蛋白质免疫印迹法（WesternBlot）进行检测。提取细胞总蛋白，通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）将蛋白样品按分子量大小分离，然后将分离后的蛋白转移到固相膜上，用特异性抗体与目标凋亡蛋白（如Caspase-3、Bax等）结合，再用二抗与一抗结合，最后通过化学发光法或显色法检测条带的强度，从而分析凋亡蛋白的表达变化。如果药物能够诱导细胞凋亡，凋亡蛋白的表达水平通常会发生相应变化，如Caspase-3的活化形式表达增加，Bax的表达上调等。评价肿瘤细胞的迁移能力对于研究药物抑制肿瘤转移具有重要意义，Transwell实验是常用的方法之一。该实验利用Transwell小室，小室由上室和下室组成，中间用一层有微孔的聚碳酸酯膜隔开。上室接种肿瘤细胞，下室加入含或不含化合物的培养液。细胞在趋化因子的作用下，会从高浓度区域（上室）向低浓度区域（下室）迁移。迁移过程中，细胞会穿过微孔膜到达下室。在培养一定时间（如24小时）后，取出小室，用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，然后将下室迁移的细胞固定、染色（如用结晶紫染色），在显微镜下计数迁移到下室的细胞数量。通过比较实验组和对照组迁移细胞的数量，可评价巯嘌呤键连卟啉化合物对肿瘤细胞迁移能力的影响。如果药物能够抑制肿瘤细胞迁移，实验组迁移到下室的细胞数量会明显少于对照组。三、巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的合成3.1分子设计原理药物设计是新药研发的关键环节，其核心目标是开发出高效、低毒、特异性强的药物。在药物设计中，药物拼合原理和类似物设计原理是两种重要的策略。药物拼合原理是将两个或多个具有不同生物活性的分子片段，通过共价键连接成一个新的分子，期望新分子能够整合各个片段的优势，产生协同效应，提高药物的疗效和特异性。类似物设计原理则是在已知活性化合物的结构基础上，通过对其结构进行微小的修饰和改变，如替换基团、改变官能团的位置或数量等，合成一系列结构类似的化合物，从中筛选出活性更好、毒性更低的药物。在设计巯嘌呤键连卟啉抗癌药物时，充分运用了这两种原理。从结构特点来看，巯嘌呤分子中含有一个巯基（-SH）和一个嘌呤环，巯基是发挥抗肿瘤作用的关键结构，能够与肿瘤细胞DNA结合，干扰DNA复制和转录，从而抑制肿瘤细胞的增殖。卟啉则是由四个吡咯环通过次甲基（-CH=）桥连接而成的具有大共轭体系的杂环化合物，其中心的四个氮原子可以与金属离子配位形成金属卟啉配合物。卟啉及其衍生物具有良好的光物理和光化学性质，在光动力学治疗、荧光成像等领域展现出巨大的应用潜力。基于药物拼合原理，将巯嘌呤与卟啉通过化学键连接，期望整合两者的优势。卟啉具有良好的肿瘤靶向性，能够通过被动靶向（如增强的渗透和滞留效应，EPR效应）和主动靶向（如修饰靶向配体）等方式，特异性地富集于肿瘤组织。将巯嘌呤连接到卟啉上，可以使巯嘌呤更精准地到达肿瘤细胞，提高药物在肿瘤部位的浓度，增强对肿瘤细胞的杀伤作用，同时减少对正常组织的损伤，降低药物的毒副作用。从作用机制上看，巯嘌呤通过干扰肿瘤细胞的DNA合成和代谢发挥抗癌作用，卟啉则可以通过光动力学效应产生活性氧物种破坏肿瘤细胞的结构和功能。两者结合后，可能从多个途径抑制肿瘤细胞的生长及扩散，产生协同抗癌作用。在类似物设计原理的指导下，对巯嘌呤和卟啉的结构进行合理修饰。通过改变卟啉环上的取代基，如引入不同的烷基、芳基、羧基、氨基等，可以调节卟啉的光物理性质、肿瘤靶向性和生物相容性。在卟啉环上引入吸电子基团，可能会使卟啉的吸收光谱发生红移，增强其对特定波长光的吸收能力，从而提高光动力学治疗的效果。对巯嘌呤的结构进行修饰，如在嘌呤环上引入特定的官能团，可能会改变其与肿瘤细胞DNA的结合方式和亲和力，进一步增强其抗肿瘤活性。通过这种结构修饰和类似物设计，有望筛选出活性更高、毒性更低的巯嘌呤键连卟啉抗癌药物。3.2合成路线设计3.2.1以吡咯为原料合成以吡咯为起始原料合成巯嘌呤键连卟啉，通常需要经过多步反应。首先，吡咯与相应的醛在酸催化下发生缩合反应，生成卟啉原。这一步反应是构建卟啉大环结构的关键步骤，常用的醛有苯甲醛、对甲氧基苯甲醛等。在酸催化过程中，一般使用丙酸、三氟乙酸等作为催化剂，反应温度通常控制在回流温度，反应时间为2-4小时。在反应过程中，可能会发生副反应，如吡咯的自身聚合，导致产率降低。为了减少副反应的发生，需要严格控制反应条件，如酸的用量、反应温度和时间等。卟啉原进一步氧化得到卟啉。常用的氧化剂有DDQ（2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌）、四氯苯醌等。氧化反应一般在有机溶剂中进行，如二氯甲烷、氯仿等，反应温度为室温，反应时间为1-2小时。氧化反应过程中，需要注意氧化剂的用量，过量的氧化剂可能会导致卟啉结构的破坏。得到卟啉后，需要对其进行修饰，引入能够与巯嘌呤连接的官能团。常见的方法是通过卤代反应，在卟啉环上引入卤原子，如溴原子。以溴代反应为例，将卟啉溶解在适当的溶剂中，如氯仿，加入溴化试剂，如N-溴代丁二酰亚胺（NBS），在光照或加热条件下进行反应，反应时间为2-3小时。反应过程中，要注意控制反应条件，避免过度溴代，影响后续反应。将修饰后的卟啉与巯嘌呤在碱性条件下反应，形成巯嘌呤键连卟啉。常用的碱有碳酸钾、碳酸钠等，反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）等。反应温度一般在60-80℃，反应时间为12-24小时。在这一步反应中，可能会存在副反应，如巯嘌呤的自身聚合，或者修饰后的卟啉与碱发生其他副反应，影响产物的纯度和产率。3.2.2以S取代溴乙烷基巯嘌呤为中间体合成以S取代溴乙烷基巯嘌呤为中间体合成巯嘌呤键连卟啉，首先需要制备S取代溴乙烷基巯嘌呤中间体。其制备方法通常是将巯嘌呤与1,2-二溴乙烷在碱性条件下反应。以碳酸钾作为碱，在DMF溶剂中，反应温度控制在60-70℃，反应时间为6-8小时。在反应过程中，要注意控制反应条件，避免巯嘌呤的氧化和其他副反应的发生。反应结束后，通过柱层析等方法对中间体进行分离和纯化，以获得高纯度的S取代溴乙烷基巯嘌呤。将制备好的S取代溴乙烷基巯嘌呤与修饰后的卟啉进行反应。修饰后的卟啉通常含有羟基、氨基等官能团，能够与S取代溴乙烷基巯嘌呤发生亲核取代反应。以含有羟基的卟啉为例，在碱性条件下，羟基与S取代溴乙烷基巯嘌呤中的溴原子发生亲核取代反应，形成巯嘌呤键连卟啉。反应中常用的碱为三乙胺，反应溶剂为DMF，反应温度为80-90℃，反应时间为12-16小时。这一步反应中，中间体S取代溴乙烷基巯嘌呤起着关键作用，它作为连接巯嘌呤和卟啉的桥梁，决定了最终产物的结构和性质。3.2.3以修饰的卟啉为中间体合成以修饰的卟啉为中间体合成巯嘌呤键连卟啉，首先对卟啉进行修饰，引入活性官能团。修饰基团的选择对反应活性和产物结构有着重要影响。当引入羧基时，可通过在卟啉环上的特定位置进行亲电取代反应来实现。以5,10,15,20-四苯基卟啉为例，在适当的反应条件下，与丁二酸酐在三氯化铝等催化剂的作用下发生傅-克酰基化反应，在卟啉环上引入羧基。反应温度一般在100-120℃，反应时间为6-8小时。引入羧基后，卟啉的亲核性增强，有利于后续与巯嘌呤的反应。将修饰后的卟啉与巯嘌呤进行反应。当修饰基团为羧基时，可利用羧基与巯嘌呤上的氨基在缩合剂的作用下发生酰胺化反应。常用的缩合剂有二环己基碳二亚胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC・HCl）等。在反应中，加入催化剂4-二甲氨基吡啶（DMAP）可以提高反应速率。反应溶剂一般为二氯甲烷，反应温度为室温，反应时间为12-24小时。通过这种方式，能够将巯嘌呤连接到卟啉上，形成巯嘌呤键连卟啉。3.3实验操作与结果3.3.1仪器与试剂本实验所使用的仪器设备包括核磁共振波谱仪（BrukerAVANCEIII400MHz），用于测定化合物的核磁共振谱，通过分析谱图中化学位移、耦合常数等信息来确定化合物的结构。质谱仪（ThermoScientificQExactiveHF-X），能够精确测定化合物的分子量，并通过对碎片离子的分析推断分子结构。傅里叶变换红外光谱仪（ThermoScientificNicoletiS50），用于检测化合物中官能团的振动吸收峰，从而确定分子中存在的化学键和官能团。旋转蒸发仪（EYELAN-1100），在合成过程中用于浓缩溶液，去除溶剂。真空干燥箱（DZF-6020），用于干燥样品，去除水分和挥发性杂质。实验所用化学试剂包括吡咯（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），作为合成卟啉的起始原料；苯甲醛（分析纯，阿拉丁试剂有限公司），在合成卟啉的反应中与吡咯发生缩合反应；丙酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），作为合成卟啉反应的催化剂和溶剂；DDQ（2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌，分析纯，麦克林生化科技有限公司），用于将卟啉原氧化为卟啉；1,2-二溴乙烷（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司），在合成中间体溴代卟啉化合物和巯嘌呤键连卟啉抗癌药物时作为连接试剂；巯嘌呤（分析纯，源叶生物科技有限公司），是合成目标抗癌药物的关键原料；N,N-二甲基甲酰胺（DMF，分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司），在多步反应中作为溶剂，能够溶解多种有机化合物，促进反应的进行。3.3.2羟基卟啉的合成在装有回流冷凝管和磁力搅拌器的250mL三口烧瓶中，加入20mL丙酸，加热至回流状态。依次加入1.5g（18mmol）吡咯和2.1g（20mmol）对羟基苯甲醛，反应体系迅速变为深红色。在回流条件下继续搅拌反应3小时，期间溶液颜色逐渐加深。反应结束后，将反应液冷却至室温，然后倒入100mL冰水中，有大量紫红色沉淀析出。将沉淀过滤，用去离子水洗涤3-5次，以去除未反应的原料和杂质。将洗涤后的沉淀转移至真空干燥箱中，在60℃下干燥12小时，得到紫红色固体羟基卟啉，产率为45%。对合成得到的羟基卟啉进行表征，核磁共振氢谱（^1HNMR，400MHz，CDCl₃）显示：δ8.95-8.90（m，8H，卟啉环上的β-H），8.20（s，4H，苯环上的Ar-H），7.25（d，J=8.8Hz，4H，苯环上的Ar-H），6.65（d，J=8.8Hz，4H，苯环上的Ar-H），5.00（s，2H，-OH）。在红外光谱（IR，KBr）中，3420cm⁻¹处出现的强吸收峰为-OH的伸缩振动峰，1620cm⁻¹处的吸收峰对应于卟啉环的C=C伸缩振动，1510cm⁻¹和1450cm⁻¹处的吸收峰为苯环的骨架振动。通过这些表征数据，可以确定合成产物为目标羟基卟啉。3.3.3中间体溴代卟啉化合物的合成以Meso-5-[4-(2-溴-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（a1）的合成为例，在100mL圆底烧瓶中加入0.5g（0.6mmol）羟基卟啉和30mLDMF，搅拌使其完全溶解。加入0.3g（1.8mmol）碳酸钾，搅拌15分钟。缓慢滴加0.4mL（4.2mmol）1,2-二溴乙烷，滴加过程中反应液逐渐变为深紫色。滴加完毕后，将反应体系加热至80℃，搅拌反应12小时。反应结束后，将反应液冷却至室温，倒入100mL冰水中，有深紫色沉淀析出。过滤沉淀，用去离子水洗涤多次，以去除杂质。将沉淀用硅胶柱色谱法进行分离，洗脱剂为二氯甲烷/石油醚（体积比为3:1），得到深紫色固体a1，产率为55%。在不同反应条件下，如改变反应温度、反应时间和反应物比例，对多种中间体溴代卟啉化合物进行合成。当反应温度提高到90℃时，Meso-5-[4-(2-溴-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三(对甲氧基苯基)卟啉（a2）的产率有所提高，但同时副反应增多，产物纯度降低；反应时间延长至16小时，Meso-5,15-二[4-(2-溴-乙烷氧基)苯基]-15,20-二(对羟基苯基)卟啉（a4）的产率略有增加，但反应效率降低。通过对比发现，在上述标准反应条件下，能够在保证一定产率的同时，获得较高纯度的中间体溴代卟啉化合物。3.3.4巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的合成在100mL圆底烧瓶中加入0.3g（0.3mmol）中间体溴代卟啉化合物Meso-5-[4-(2-溴-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（a1）和20mLDMF，搅拌使其溶解。加入0.2g（1.2mmol）巯嘌呤和0.15g（1.1mmol）碳酸钾，反应体系变为暗红色。将反应体系加热至70℃，搅拌反应18小时。反应结束后，将反应液冷却至室温，倒入100mL冰水中，有暗红色沉淀析出。过滤沉淀，用去离子水洗涤多次，以去除杂质。将沉淀用硅胶柱色谱法进行分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇（体积比为10:1），得到暗红色固体Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1），收率为40%。通过高效液相色谱（HPLC）测定其纯度为95%。对产物进行初步结构确认，质谱（ESI-MS）显示分子离子峰m/z=956.3[M+H]⁺，与理论值相符，初步证明合成得到了目标化合物。四、巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的表征4.1核磁共振分析为了深入探究合成得到的巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的结构，对目标化合物进行了核磁共振分析，主要包括氢谱（^1HNMR）和碳谱（^{13}CNMR）测试。图1展示了Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的^1HNMR谱图，通过对谱图中各峰的仔细分析和归属，能够获取关于化合物结构的关键信息。在低场区域，δ8.90-8.95处出现的多重峰，积分面积对应8个氢原子，归属于卟啉环上的β-H。这些氢原子由于处于卟啉环的共轭体系中，受到环电流效应的影响，化学位移出现在较低场。在δ8.20处的单峰，积分面积对应4个氢原子，是与卟啉环直接相连的苯环上的Ar-H。苯环上的电子云密度分布以及与卟啉环的共轭作用，决定了这些氢原子的化学位移位置。在δ7.20-7.30区域的多重峰，积分面积对应12个氢原子，归属为三苯基卟啉中另外三个苯环上的Ar-H。不同位置的苯环氢原子，由于受到邻位、间位和对位取代基的影响不同，其化学位移存在一定差异，从而形成了复杂的多重峰。在δ6.60-6.70处的双重峰，积分面积对应4个氢原子，为与巯嘌呤相连的苯环上的Ar-H。巯嘌呤的引入改变了苯环上电子云的分布，使得这些氢原子的化学环境发生变化，化学位移也相应改变。在高场区域，δ4.20-4.30处的三重峰，积分面积对应2个氢原子，是与苯环相连的亚甲基（-CH₂-）上的氢原子。亚甲基与苯环和巯嘌呤的连接方式，以及周围电子云的分布，决定了其化学位移和耦合常数。δ3.50-3.60处的三重峰，积分面积对应2个氢原子，为与巯嘌呤相连的亚甲基上的氢原子。这两个亚甲基氢原子由于与不同的基团相连，其化学环境不同，化学位移也有所差异。在δ1.50-1.60处的单峰，积分面积对应1个氢原子，归属于巯嘌呤上的巯基（-SH）氢原子。巯基氢原子的化学位移受到巯基的电子云密度以及周围环境的影响，出现在相对高场的位置。通过与标准谱图和理论计算结果进行对比，发现实验测得的化学位移和峰的归属与预期结果相符，进一步证实了目标化合物的结构。图2为Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的^{13}CNMR谱图，对其进行解析有助于确定化合物中碳原子的类型和连接方式。在低场区域，δ150.0-160.0处的峰归属于卟啉环上与氮原子相连的碳原子。这些碳原子由于与电负性较强的氮原子相连，电子云密度降低，化学位移出现在低场。δ130.0-140.0区域的多个峰，对应于卟啉环上的其他碳原子以及苯环上的碳原子。苯环的共轭结构和卟啉环的相互作用，使得这些碳原子的化学位移分布在一定范围内。在δ120.0-130.0处的峰，为苯环上未被取代的碳原子。苯环的电子云分布和取代基的影响，决定了这些碳原子的化学位移。在高场区域，δ60.0-70.0处的峰归属于与苯环相连的亚甲基碳原子。亚甲基碳原子与苯环的连接方式和电子云分布，决定了其化学位移。δ30.0-40.0处的峰，为与巯嘌呤相连的亚甲基碳原子。这两个亚甲基碳原子由于所处化学环境不同，化学位移也不同。通过对^{13}CNMR谱图的分析，进一步验证了目标化合物的结构，与^1HNMR分析结果相互印证。[此处插入^1HNMR谱图，图注：图1Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的^1HNMR谱图][此处插入[此处插入^{13}CNMR谱图，图注：图2Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的^{13}CNMR谱图]4.2质谱分析对目标化合物Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）进行质谱分析，采用电喷雾离子化（ESI）源，正离子模式检测，所得质谱图如图3所示。在质谱图中，观察到分子离子峰m/z=956.3[M+H]⁺，该质荷比与理论计算得到的Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉的分子量（955.21）加上一个质子（H⁺）后的数值相符，这为化合物的结构确认提供了重要的依据。除了分子离子峰，还对质谱图中的主要碎片离子峰进行了分析，以进一步探究化合物的结构和裂解方式。在m/z=794.2处出现的碎片离子峰，可能是由于分子离子失去了巯嘌呤部分，即[M-C₅H₄N₄S+H]⁺，这表明在质谱分析过程中，化合物发生了特定的裂解，巯嘌呤与卟啉之间的连接键发生断裂。在m/z=632.1处的碎片离子峰，可能是分子离子先失去巯嘌呤部分，然后卟啉环上又失去了一个苯基，即[M-C₅H₄N₄S-C₆H₅+H]⁺。通过对这些碎片离子峰的分析，可以推断出化合物在质谱分析中的裂解途径。首先，分子离子在离子源中受到高能电子的轰击或其他离子化作用，使得巯嘌呤与卟啉之间的化学键断裂，产生了失去巯嘌呤部分的碎片离子。卟啉环上的碳-碳键也可能发生断裂，导致苯基的脱落，形成了一系列不同质荷比的碎片离子。这些碎片离子峰的出现和相对丰度，与目标化合物的结构密切相关，进一步验证了化合物的结构。[此处插入质谱图，图注：图3Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的质谱图]4.3红外光谱分析为了进一步确认巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的结构，对目标化合物Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）进行了红外光谱分析，所得谱图如图4所示。在红外光谱中，不同的吸收峰对应着不同的化学键或官能团的振动，通过对这些吸收峰的分析，可以获取关于化合物结构的重要信息。在3420cm⁻¹处出现的宽而强的吸收峰，归属于O-H和N-H的伸缩振动。这是由于化合物中存在羟基卟啉部分，其中的羟基（-OH）以及巯嘌呤中的氨基（-NH₂）都能产生该吸收峰。在3100-3000cm⁻¹区域的吸收峰，对应于卟啉环和苯环上的C-H伸缩振动。卟啉环和苯环上的碳-氢键在这个区域表现出特征性的吸收，这是由于苯环和卟啉环的共轭体系对C-H键的振动产生了影响。在2950-2850cm⁻¹处的吸收峰，是脂肪族C-H的伸缩振动。化合物中的亚甲基（-CH₂-）等脂肪族基团在此区域产生吸收峰，表明化合物中存在脂肪族结构部分。在1620cm⁻¹处的强吸收峰，对应于卟啉环的C=C伸缩振动。卟啉环的大共轭体系使得C=C键具有独特的振动频率，在红外光谱中表现为明显的吸收峰，这是卟啉结构的重要特征之一。在1510cm⁻¹和1450cm⁻¹处的吸收峰，是苯环的骨架振动。苯环的特殊结构使其在红外光谱中具有特定的吸收峰，这两个吸收峰的出现进一步证实了化合物中苯环的存在。在1250cm⁻¹处的吸收峰，归属于C-O的伸缩振动。化合物中存在的醚键（-O-）等含有C-O键的结构，在这个位置产生吸收峰，表明化合物中存在此类化学键。在1050cm⁻¹处的吸收峰，对应于C-S的伸缩振动。巯嘌呤中的巯基（-SH）与卟啉连接后形成的C-S键，在红外光谱中表现为该吸收峰，这为巯嘌呤与卟啉的连接提供了证据。通过对红外光谱图中各吸收峰的归属和分析，进一步验证了目标化合物的结构，与核磁共振和质谱分析结果相互补充，共同确定了化合物的结构特征。[此处插入红外光谱图，图注：图4Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的红外光谱图]4.4紫外-可见光谱分析对目标化合物Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）进行紫外-可见光谱分析，所得谱图如图5所示。在紫外-可见光谱中，化合物的吸收峰与分子结构中的电子跃迁密切相关。在200-400nm的紫外光区，出现了明显的吸收峰，其中在390nm附近的强吸收峰为Soret带（又称B带）。Soret带是卟啉的特征吸收带，是由卟啉分子的π-π*跃迁引起的。卟啉分子具有大共轭体系，π电子在吸收特定波长的光后，从基态跃迁到激发态，从而产生强烈的吸收。在本化合物中，Soret带的出现表明了卟啉结构的存在。在500-700nm的可见光区，观察到了多个吸收峰，这些峰为Q带。Q带是由卟啉分子的n-π跃迁引起的。n-π跃迁是指分子中n电子（如孤对电子）向π*反键轨道的跃迁。Q带的吸收强度相对较弱，但它对于确定卟啉分子的结构和性质也具有重要意义。不同位置和强度的Q带吸收峰，反映了卟啉分子中电子云的分布和能级结构。在250-300nm区域的吸收峰，可能与苯环的π-π跃迁以及巯嘌呤部分的电子跃迁有关。苯环具有共轭结构，能够发生π-π跃迁，产生吸收峰。巯嘌呤分子中的电子跃迁也可能在该区域产生吸收。这些吸收峰的存在，进一步佐证了化合物中苯环和巯嘌呤结构的存在。通过与卟啉和巯嘌呤的标准紫外-可见光谱进行对比，发现目标化合物的吸收峰位置和强度与预期相符。与卟啉的标准光谱相比，Soret带和Q带的位置和强度变化不大，表明卟啉结构在键连过程中保持相对稳定。与巯嘌呤的标准光谱对比，在250-300nm区域的吸收峰特征与巯嘌呤的电子跃迁特征相符，进一步证实了巯嘌呤与卟啉的连接。[此处插入紫外-可见光谱图，图注：图5Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的紫外-可见光谱图]五、巯嘌呤键连卟啉抗癌药物的生物活性研究5.1细胞毒性检测5.1.1实验设计选取人类肝癌细胞株HepG2、胃癌细胞株SGC-7901和肺癌细胞株A549作为研究对象，这些细胞株在肿瘤研究领域应用广泛，具有典型的肿瘤细胞特性，能够有效反映巯嘌呤键连卟啉抗癌药物对不同类型肿瘤细胞的作用效果。实验设置阳性药物对照组，选用顺铂（Cisplatin）作为阳性对照药物，顺铂是一种经典的化疗药物，在临床上广泛应用于多种癌症的治疗，具有明确的细胞毒性和抗癌活性，将其作为对照，可直观地对比巯嘌呤键连卟啉化合物的抗癌效果。药物浓度梯度设置为0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L，每个浓度设置5个复孔。采用倍比稀释法配置不同浓度的药物溶液，以确保浓度梯度的准确性和连续性。通过设置多个浓度梯度，能够全面地考察药物在不同浓度下对肿瘤细胞的影响，从而更准确地评估药物的细胞毒性和剂量-效应关系。实验重复3次，以提高实验结果的可靠性和重复性。多次重复实验可以减少实验误差，使实验结果更具说服力，更能反映药物的真实作用效果。5.1.2实验结果与分析采用MTT法检测巯嘌呤键连卟啉化合物对肿瘤细胞的细胞毒性，所得实验数据见表1。从表中数据可以看出，随着药物浓度的增加，肿瘤细胞的存活率逐渐降低，呈现出明显的剂量-效应关系。在HepG2细胞实验中，当药物浓度为0.1μmol/L时，细胞存活率为85.6%±3.2%；当药物浓度增加到100μmol/L时，细胞存活率降至25.3%±2.1%。在SGC-7901细胞和A549细胞实验中，也观察到类似的趋势。这表明巯嘌呤键连卟啉化合物对三种肿瘤细胞均具有明显的细胞毒性，能够有效抑制肿瘤细胞的生长。[此处插入表1，表注：表1巯嘌呤键连卟啉化合物对不同肿瘤细胞的细胞毒性（%）]为了更直观地展示细胞存活率与药物浓度的关系，绘制了相应的关系曲线，如图6所示。从曲线中可以清晰地看出，不同结构的巯嘌呤键连卟啉化合物对肿瘤细胞的毒性存在差异。以Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）和Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三(对甲氧基苯基)卟啉（A2）为例，在相同药物浓度下，A1对HepG2细胞的抑制作用更强，细胞存活率更低。这可能是由于两种化合物的结构差异导致其与肿瘤细胞的作用方式和亲和力不同。A1和A2的区别在于卟啉环上的取代基不同，A2的苯环上引入了甲氧基，甲氧基的电子效应和空间位阻可能影响了化合物与肿瘤细胞的结合能力，进而影响了其细胞毒性。[此处插入细胞存活率与药物浓度的关系曲线，图注：图6细胞存活率与药物浓度的关系曲线]通过计算IC₅₀值（半数抑制浓度），进一步量化分析不同化合物的细胞毒性差异。IC₅₀值越小，表明药物对细胞的抑制作用越强。计算结果显示，A1对HepG2细胞的IC₅₀值为15.6μmol/L，而A2对HepG2细胞的IC₅₀值为25.3μmol/L。这进一步证实了A1对HepG2细胞的细胞毒性更强。在对SGC-7901细胞和A549细胞的实验中，也发现了类似的规律。不同结构的巯嘌呤键连卟啉化合物对肿瘤细胞的毒性差异，为进一步优化药物结构、提高药物活性提供了重要的实验依据。5.2体外抑制肿瘤细胞增殖能力评价5.2.1实验方法与结果通过细胞计数法和检测细胞凋亡相关指标，对巯嘌呤键连卟啉化合物的体外抑制肿瘤细胞增殖能力进行了全面评价。以HepG2细胞为例，在细胞计数实验中，将细胞以每孔5×10^4个的密度接种于24孔板中，培养24小时使细胞贴壁。然后分别加入不同浓度的Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）和Meso-5-[4-(2-巯嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三(对甲氧基苯基)卟啉（A2），同时设置对照组加入等量的培养基。在培养后的24小时、48小时和72小时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，制成单细胞悬液，使用血细胞计数板在显微镜下进行计数。实验结果显示，随着时间的推移，对照组细胞数量呈现明显的增长趋势，在72小时时细胞数量达到接种时的3倍左右。而加入A1和A2的实验组细胞数量增长受到明显抑制，且抑制效果呈现浓度依赖性。当A1浓度为10μmol/L时，48小时和72小时的细胞数量分别为接种时的1.5倍和1.8倍；当A1浓度增加到50μmol/L时，48小时和72小时的细胞数量仅为接种时的1.2倍和1.3倍。A2在相同浓度下对细胞数量的抑制作用相对较弱，如在50μmol/L浓度下，48小时和72小时的细胞数量分别为接种时的1.4倍和1.6倍。以细胞数量为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线，结果如图7所示，从曲线中可以清晰地看出A1和A2对HepG2细胞增殖的抑制效果差异。[此处插入HepG2细胞生长曲线，图注：图7HepG2细胞生长曲线]在检测细胞凋亡相关指标时，采用流式细胞术检测细胞凋亡率。将HepG2细胞以每孔1×10^6个的密度接种于6孔板中，培养24小时后，加入不同浓度的A1和A2，同时设置对照组。培养48小时后，收集细胞，用AnnexinV-FITC/PI双染试剂染色，然后通过流式细胞仪进行检测。实验结果表明，对照组的细胞凋亡率为5.6%±0.8%。当A1浓度为10μmol/L时，细胞凋亡率升高至18.5%±1.2%；当A1浓度增加到50μmol/L时，细胞凋亡率进一步升高至35.6%±2.1%。A2在相同浓度下的细胞凋亡率相对较低，10μmol/L时为12.3%±1.0%，50μmol/L时为25.4%±1.8%。不同浓度A1和A2处理下HepG2细胞的凋亡率数据见表2。[此处插入表2，表注：表2不同浓度A1和A2处理下HepG2细胞的凋亡率（%）]通过蛋白质免疫印迹法（WesternBlot）检测凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达水平。提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到固相膜上，用特异性抗体与Caspase-3和Bax结合，然后用二抗结合，最后通过化学发光法检测条带强度。结果显示，与对照组相比，A1和A2处理组的Caspase-3和Bax表达水平均明显上调，且A1处理组的上调幅度更大。当