色谱技术及应用课件

色谱技术及应用1 凝胶过滤技术1)、Gelfiltrationchromatography(GFC)原理操作与原理：含有不同组分的溶液，通过网状结构的凝胶粒子(a)，小分子扩散进入凝胶相，大分子被排阻于凝胶相外，加入洗脱剂后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子进入下层新的凝胶相中，重复上述扩散和排阻。这样最先流出的为最大的分子，最后流出的为最小分子，分段收集可以获得按分子量大小分布的各组分。分子筛色谱:

从上可见，凝胶过滤具有分子筛的作用。分离关系：组分0的M最大，不能进入gel，洗脱体积为空隙体积V0；组分t的M最小，能进入到gel的细孔中，其洗脱体积接近柱体积Vt,组分1-2在V0-Vt之间.显然，GFC能分离洗脱体积在V0-Vt之间的组分。对于组分1和2，两峰距离m1 凝胶过滤技术分配系数m影响因素：分子量,分子形状,gel孔径结构；与pH,I,T无关.2)、凝胶介质对介质的要求：1st

亲水性高；2nd

表面惰性，不发生化学和物理变化；3rd

高稳定性，有较宽的pH和I适应范围；4th

具有一定的孔径分布；5th

机械强度高，耐高压操作，寿命长。 商品化的介质均能满足1-4条的要求。介质的类型：1st Sephadex2nd

Sephacryl3rd

Superose/-dex,Sepharose4th Cellulose5th

TSKgel1 凝胶过滤技术3)、凝胶介质特征参数排阻极限(exclusionlimit)：指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的M。如，SephadexG50的排阻极限为30kD。分级范围(fractionationrange)：能阻滞组分并且使组分相互之间得到分离的组分分子量范围。如，SephadexG50的分级在1.5-30KD内。溶胀率/吸水率：

如，SephadexG50的溶胀率=500±30%。

意义:凝胶粒径：软gel粒径较大，在50-150

m之间；硬gel较小，在5-50m之间。粒径越小，HETP越小，分离效率越高。床体积(bedvolume)：1g干燥gel溶胀后所占有的体积。如，SephadexG50的床体积为9-11cm3/g干胶。空隙体积(voidvolume)：凝胶之间的空隙体积，即V0。

空隙体积一般用平均分子量在2000KD水溶性蓝葡聚糖(bluedextran)测定。1 凝胶过滤技术4)、影响因素线速度：1stHW40F凝胶的排阻极限小，在该凝胶中蛋白质的m=0，故HETP=2Dz/u(Dz

udp)=常数。2ndHW55F凝胶的排阻极限较大，在此，m>0,HETPu;在u=0处，直线交于点2Dz/u。3rd

当u<0.2cm/min,NaCl的HETP随流速降低急剧增大。这主要由于分子的扩散影响。进样体积：

1st

在一定相对料液体积范围内，HETP为常数；2nd

但，之后，HETP随料液相对体积的增加而急剧增大。

3rd

意义：为得到较高的分离度，料液体积需根据溶质的m差别控制在适当的范围内，在不影响分离度的前提下取最大值。料液浓度 依据GFC的原理，tr和HETP与浓度无关。但实验表明，当浓度较高时，洗脱曲线出现吐舌、拖尾、甚至双峰；使HETP极度上升。这主要为样品黏度高造成。经验表明，料液与流动相的黏度比应控制在2以内。1 凝胶过滤技术分子量M和分配系数m1st

在GFC分级范围内m与M关系 此时，分离度方程为 方程示：b值越大，即凝胶分级范围越小，Rs越大。2nd

因此，一定料液时，根据组分的M选择分级范围较小的介质，提高Rs和料液的处理量。凝胶的粒径1st

dp,HETP.故dp

是N的最佳途径；2nd

dp10倍,而h和v不变，u10倍，HETP(=hdp)10倍，R10倍1 凝胶过滤技术5）、应用1st

分离纯化

M：x0-106，

d:0.x-x00nm之间；

种类：肽、脂质、抗生素、糖、核酸、病毒(50-400nm)。2nd

除热原、过敏原 如青霉噻唑蛋白–SephadexG25凝胶柱。3rd 脱盐/置换buffer1 凝胶过滤技术4th

M测定 原理： 挑选标准蛋白质：cytC(12500),Mb(16900),胰凝乳蛋白(23200),卵白蛋白(45000)和Hb(64500).

条件：在凝胶介质分级范围内.

作图：6）、优点1st

如其他色谱相比，操作简便，介质价廉易得；适合于大规模生产；2nd

溶质和介质不发生任何形式的相互作用，故操作条件温和，回收率接近100%；3rd

分离结束后，无须对分离介质进行清洗和再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；4th 作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤相比，剪切力小，蛋白质的回收率高。5th

分离机理简单，操作参数少，易于放大。7）、缺点1st

分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少；2nd

经GFC洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。2 离子交换剂色谱原理(ionexchangerchromatography,IEC)1st

荷电溶质在离子交换剂上的分配系数m I-离子强度；A和B为常数,均为pH的函数，在物理意义上，B为溶质的静电荷数与交换剂的离子价数之比(对于pro,一般大于10)。m

-离子强度无限大时的溶质分配系数,为静电作用外的非特异性吸附引起的溶质在交换剂上分配。2nd

意义：对于pro.和aa

调节Ivalue

调节|pH–pI| value操作1st

恒定洗脱(Sephadex常用)缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽2nd

I线性梯度洗脱(lineargradientelution)2 离子交换剂色谱3ndpH线性梯度洗脱(lineargradientelution)4th

线性梯度洗脱的优缺点优点：流动相I/pH连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广；缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。5th

阶梯洗脱法(stepwiseelution)2 离子交换剂色谱6th阶梯洗脱法的优缺点优点：无须特殊设备，操作简单；缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。线性洗脱时间定义：GHdI/dV-离子强度梯度(mol/l)，F-流动相流量(l/s).利用GH和Ip关系图及上述方程，可算tr2 离子交换剂色谱分离度和柱效1st

分离度意义：4因素可控制2nd

柱效意义：I+dIImi富集效应2 离子交换剂色谱应用：3 疏水性吸附色谱疏水性色谱原理1)、吸附1stpro疏水性2ndpro稀疏水性差异3rd

原有吸附介质的亲水性4th

亲水性介质的改造hydrophobicinteractionchromatography,HIC2)、影响pro水化层因素1st

水化层(hydrationshell) tighthydrationshell(0.35gwater/1gpro) loosehydrationshell(2gwater/1gpro)2ndionicstrength3rd|pH水

–pI|Value

|pH水

–pI|Value

zeta电势

水化层

4th

增加亲水性物质 离子：SCN-，ClO4-，I-

有机物：乙二醇、丙三醇等含羟基物质5th

表面活性剂TighthydrationshellProteincoreLoosehydrationshell洗脱方法?3 疏水性吸附色谱3)、洗脱方法降低离子强度增加|pH–pI|[乙二醇]or[I-][表面活性剂]4)、富集效应I+dIImi3 疏水性吸附色谱分离效率和柱效1st

分离效率2nd

柱效3rd

降低颗粒大小的极端重要性3 疏水性吸附色谱Applications3 疏水性吸附色谱特点：1st互补工具：HIC主要用于蛋白质类分离纯化，虽然HIC不如IEC的应用广泛，但可以作为IEC的互补工具。如方法得当，HIC与IEC的分离效率相当。2nd

与盐析衔接：由于在高浓度盐溶液中疏水性较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液。3rd

可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小，因此可根据目标产物的性质选择适当的吸附剂。4th

疏水性吸附的种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。4 聚焦色谱2)、聚焦色谱原理：基于离子交换原理，根据两性电解质pI的差别进行分离纯化的洗脱层析法。固定相：聚合缓冲离子交换剂(poly-bufferexchanger),特点是在较宽pH范围内具有缓冲能力。流动相：polybuffer的水溶液，特点在较宽pH范围内具有缓冲能力。Poly-bufferandPoly-bufferexchangerManypolybufferswithdifferentpIsAkindofPoly-bufferwithapI4 聚焦色谱洗脱发生的变化：在柱内pH缓慢变化，在轴向形成连续的pH梯度，使溶质依据其pI或吸附或洗脱，渐渐向下移动，彼此分离。以阴离子交换剂为例4 聚焦色谱对应的色谱图4 聚焦色谱2)5 反相色谱反相色谱(reversedphasechromatography,RPC)固定相：非极性的反相介质，即为疏水性介质(R1,R2多为甲基，R为C4，C8，C18烷基或苯基，其中C18硅烷化制备的试剂最多，统称为ODS–Octadecylsilica)。烷基化密度：45%，55%的羟基用 三甲基氯硅烷覆盖，使表面完全 非极性化。

溶质在介质上的分配系数处决于溶质的疏水性，疏水性大，m高。流动相：极性有机溶剂的水溶液(甲醇,